BIẾN NẠP GEN Ở MÔ SẸO MÍA (Saccharum officinarum L.)
BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens
VÀ TÁI SINH CHỒI SAU CHUYỂN GEN


DANH SÁCH NHÓM 7

1.
2.
3.
4.
5.
6.

Phạm Thiên Phú
Hồ Hữu Trung
Đặng Lê Tú Trinh
Khâu Thị Hoàng Uyên
Hồ Tường Vi
Huỳnh Thanh Phương


Các nội dung chính

1.

CNSHTV và công nghiệp.

2.

Đối tượng nghiên cứu


NHẬT
BẢN
NGA
ĐỨC

TRIỂN

Tại Việt Nam:


2. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng: Cây mía – Saccharum officinarum L.
- Nguồn gốc: Xuất hiện từ lâu trên Trái Đất, khi châu Úc và châu Á chưa tách rời.Chúng vốn là
các loài cỏ, có thân cao từ 2-6 m, chia làm nhiều đốt, bên trong có chứa đường. Tất cả các giống
mía trồng đều là các giống mía lai nội chi hoặc nội loại phức tạp.


-

Giá trị kinh tế
+ Xét về mặt công nghiệp: Trong thế kỷ 21, cây mía còn là nguồn cung cấp

nguyên liệu cho các ngành công nghiệp thực phẩm, hóa phẩm, dược phẩm, chế biến cồn
sinh học (ethanol) … Ngoài sản phẩm chính là đường, các sản phẩm phụ của mía đường
nếu được khai thác triệt để, giá trị còn có thể gấp 3-4 lần chính phẩm.
+ Xét về mặt sinh học:
. Khả năng tạo ra sinh khối lớn
. Khả năng tái sinh mạnh

Việt Nam.


3. BIẾN NẠP GIÁN TIẾP THÔNG QUA AGROBACTERIUM

3.1 Agrobacterium
- Agrobacterium tumefaciens là loài vi khuẩn gây bệnh cho thực vật được sử
dụng như vector tự nhiên để mang các gen ngoại lai vào mô và tế bào thực vật.
- A. tumefaciens có chứa một plasmid lớn kích thước khoảng 200 kb gọi là
Ti-plasmid (tumor inducing plasmid) chính là tác nhân truyền bệnh cho cây.

Vi khuẩn A. tumefaciens


3.2 Cơ chế gây bệnh của A. tumefaciens
- Sau khi xâm nhiễm vào tế bào, chúng gắn đoạn T-DNA vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật, dẫn đến sự rối
loạn các chất sinh trưởng nội sinh, tạo ra khối u.
- Khả năng chuyển gen này đã được khai thác để chuyển gen ngoại lai vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật
theo ý muốn.


3.3. Nuôi cấy phát sinh mô sẹo (Callus)

- Là khối mô phát triển mạnh mẽ vô tổ chức trên hoặc xung quanh
bề mặt vết thương hay vết cắt; hoặc trong nuôi cấy mô tế bào thực vật.
- Thông thường, môi trường tạo mô sẹo cần bổ sung auxin ở nồng
độ cao, auxin có thể sử dụng riêng rẽ hoặc kết hợp với cytokinin. Tuy
nhiên, đối với mẩu có nồng độ auxin nội sinh cao, khi không có sự bổ
sung của auxin ngoại sinh, mẫu cũng có thể phát sinh mô sẹo.



+ 3 mg/L 2,4-D (D3)
+ 4 mg/L 2,4-D (D4)

MS bổ sung PVP

Để trong tối
o
22 – 25 C


- Kết quả:
+ Sau 7 – 10 ngày nuôi cấy, các khúc cắt thân bắt đầu hình thành sẹo tại vị trí cắt gần với gốc (Bảng 1).
+ Sau 4 - 6 tuần, các mẫu mô sẹo trở nên rắn chắc và ngả sang màu vàng (Hình 1). Các mẫu thân không tạo sẹo thì đen dần và cuối cùng chết đi.

Nghiệm thức

Tỉ lệ mẫu tạo sẹo (%)

D1

a
55,56 ± 3,85

D2

b
64,44 ± 3,85

D3


Chiếu sáng 16h/ngày
3000 lux

Mô sẹo ở TN1 (2-3 mm)

MS bổ sung BA


Nghiệm thức

Tỉ lệ mẫu tạo chồi (%)

Số chồi / mẫu (chồi)

B0

c
5,56 ± 4,81

0–1

ab

B0,5

22,22 ± 4,81

B1,0


- Sau 10 ngày, sẹo đặt trên các môi trường bắt đầu cảm ứng tạo chồi
- Sau 5 tuần nuôi cấy, các nghiệm thức có sự khác biệt về số chồi phát sinh từ một mẫu mô ban đầu


4.2.3. Thí nghiệm khảo sát nồng độ PPT tối thiểu gây chết 100% cho mô mía
- Bố trí thí nghiệm:
Môi trường cho thí nghiệm 3
+ 0 mg/L PPT (P0)

- Môi trường MS
- Đường Sucrose (20 g/L)
- Agar (8 g/L)
- Nước dừa 10%
- Polyvinylpyrrolidone (PVP) (0,8 g/L)

+ 1 mg/L PPT (P0)
+ 2 mg/L PPT (P0)
+ 3 mg/L PPT (P0)
+ 4 mg/L PPT (P0)
+ 5 mg/L PPT (P5)

Để trong tối
o
(22 - 25 C)

Mô sẹo ở TN1(2-3 mm)

MS bổ sung PVP, PPT




P5

0,00 ± 0,00

a

b
c
c
d
e

Bảng 3. Ảnh hưởng của PPT lên khả năng sống của sẹo mía


4.2.4. Thí nghiệm khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen và tái sinh chồi sau chuyển gen
- Bố trí thí nghiệm
+ Chuẩn bị dịch khuẩn:

Dịch tạo sẹo ở nghiệm thức D3
Vi khuẩn A. tumefaciens
+ AS đến nồng độ 100μM và
Thu sinh khối

150μM
Lắc đều và để yên trong 30 phút

20 ml YEP lỏng
rifampicin 50 mg/l

5-6 tuần

Chiếu sáng
Thử GUS

16h/ngày
Cắt là và thân

Môi trường B1 của TN2 + 5mg/L
PPT


- Kết quả:
Tiến hành trên 8 nghiệm thức kết hợp sự thay đổi các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen

Thời gian ủ mẫu với dịch

Thời gian phơi khô mẫu sau

khuẩn

khi ủ

100 μM

15’

15’

T2


T6

150 μM

15’

30’

T7

150 μM

30’

15’

T8

150 μM

30’

30’

Nghiệm thức 

Nồng độ acetosyringone

T1