BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHỦNG
VI KHUẨN Salmonella, Shigella,Vibrio parahaemolyticus
TRONG MẪU THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT
REAL-TIME PCR

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Sinh viên thực hiện: TỐNG TRẦN THẢO LY
Niên khóa: 2010 – 2014

Tháng 12 / 2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHỦNG
VI KHUẨN Salmonella, Shigella,Vibrio parahaemolyticus
TRONG MẪU THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT
REAL-TIME PCR

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện



TÓM TẮT

Salmonella, Shigella,Vibrio parahaemolyticus là 3 loại vi khuẩn nguy hiểm, là
tác nhân chính gây ngộ độc thực phẩm tại Việt Nam và các nước trên thế giới. Việc
kiểm soát sự hiện diện các vi khuẩn này trong thực phẩm là rất cần thiết để đảm bảo vệ
sinh an toàn thực phẩm và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng.
Trong nghiên cứu này, đã thiết kế và chọn lọc được những cặp mồi đặc hiệu cho
từng chủng vi khuẩn mục tiêu. Các cặp mồi chọn được cho kết quả đặc hiệu 100% với
loài vi khuẩn mục tiêu, không có hiện tượng bắt cặp chéo với các loại vi khuẩn khác.
Quy trình định lượng các vi khuẩn mục tiêu bằng kỹ thuật real-time PCR cũng được
thiết lập thành công với độ nhạy phản ứng là 3-10 cfu/ 25g mẫu thực phẩm (R2=
0.998), độ tin cậy đạt trên 90%. Kết quả định lượng này tương đồng so với phương
pháp đếm tế bào trên đĩa thạch. Tuy nhiên, so với phương pháp nuôi cấy truyền thống,
định lượng vi sinh vật bằng phương pháp real-time PCR cho kết quả chính xác cao hơn
và rút ngắn thời gian xét nghiệm. Toàn bộ quá trình định lượng vi khuẩn bằng kỹ thuật
real-time PCR chỉ mất khoảng 30 giờ so với thời gian 5-7 ngày khi sử dụng phương
pháp truyền thống.
Kết quả nghiên cứu này sẽ là cơ sở khoa học để phát triển kit real-time PCR
dùng trong xét nghiệm an toàn thực phẩm vừa đáp ứng được yêu cầu độ nhạy, độ
chính xác cao, và có thời gian xét nghiệm nhanh hơn phương pháp nuôi cấy truyền
thống.
Từ khóa: Salmonella, Shigella, Vibrio parahaemolyticus, real-time PCR

ii


SUMMARY

Salmonella, Shigella, Vibrio parahaemolyticus are 3 dangerous bacteria, is the

1.3 Nội dung thực hiện .............................................................................................. 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................ 3
2.1 Tình hình ngộ độc thực phẩm trên thế giới và ở Việt Nam................................... 3
2.2 Các loại vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm phổ biến .............................................. 4
2.2.1 Vi khuẩn Salmonella ........................................................................................... 5
2.2.2 Vi khuẩn Shigella ................................................................................................ 6
2.2.3 Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus .................................................................... 7
2.3 Một số phương pháp phân tích vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm ....................... 8
2.3.1 Phương pháp đếm khuẩn lạc ............................................................................... 9
2.3.2 Phương pháp Real-time PCR .............................................................................. 10
2.3.2.1 Nguyên tắc kỹ thuật real-time PCR dùng màu huỳnh quang chèn .................. 11
2.3.2.2 Phân tích tổng quát một phản ứng real-time PCR ............................................ 12
2.3.2.3 Tính lập lại của phản ứng real-time PCR ........................................................ 13
2.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ............................................................ 13
Chương 3 VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................... 15

iv


3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu .......................................................................... 15
3.2 Vật liệu ................................................................................................................... 15
3.2.1 Vi khuẩn .............................................................................................................. 15
3.2.2 Vật liệu và hóa chất dùng trong phản ứng Real-time PCR ................................. 15
3.2.3 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn ............................................................................ 16
3.3 Dụng cụ và thiết bị ................................................................................................. 17
3.4 Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 18
3.4.1 Thiết kế mồi đặc hiệu .......................................................................................... 19
3.4.2 Phương pháp trích ly DNA vi khuẩn ................................................................... 21
3.4.3 Xây dựng quy trình phản ứng real-time PCR ...................................................... 22
3.4.3.1 Sàng lọc mồi và tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp của mồi ..................................... 22

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AOAC :

Association of Official Agriculture Chemists

BAM:

Bacteriological Analytical Manual

BC:

Bacillus

CDC:

Centers for Disease Control and Prevention

CT:

Chu kì ngưỡng

OD :

optical density

Gen ial:

invasive-associated locus


Shiga Toxin-Producing Escherichia coli

V:

Vibrio parahaemolyticus

vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1 Các loại vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm thường gặp ................................. 4
Bảng 3.1 Thành phần trong một phản ứng real-time PCR ........................................... 23
Bảng 3.2 Chu trình luân nhiệt cho phản ứng real-time PCR ........................................ 23
Bảng 3.3 Thành phần phản ứng PCR (sử dụng Pfu polymerase)................................. 26
Bảng 3.4 Thành phần phản ứng nối.............................................................................. 27
Bảng 3.5 Chu trình luân nhiệt cho phản ứng real-time PCR dựng đường chuẩn......... 30
Bảng 4.1 Các cặp mồi được thiết kế và thực hiện phản ứng PCR ............................... 33
Bảng 4.2 Các cặp mồi đặc hiệu cho Salmonella, Shigella, V. parahaemolyticus ........ 38
Bảng 4.3 Kết quả đo OD các mẫu plasmid chứng dương ............................................ 43
Bảng 4.4 Kết quả dựng đường chuẩn cho real-time PCR định lượng Salmonella....... 43
Bảng 4.5 Kết quả định lượng Salmonella từ canh khuẩn ............................................. 44
Bảng 4.6 Kết quả dựng đường chuẩn Shigella cho phản ứng real-time PCR .............. 45
Bảng 4.7 Kết quả định lượng Shigella từ canh khuẩn .................................................. 46
Bảng 4.8 Kết quả dựng đường chuẩn Vibrio parahaemolyticus cho realtime PCR..... 46
Bảng 4.9 Kết quả định lượng V. parahaemolyticus từ canh khuẩn .............................. 47
Bảng 4.10 Kết quả phát hiện các vi khuẩn ................................................................... 48

viii


Hình 4.13 Kết quả sàng lọc các dòng tế bào Ecoli DH5α chứa plasmid chứng
dương đoạn gen Sal- invA1 với cặp mồi vector pJET1.2 ............................................ 40
Hình 4.14 Kết quả sàng lọc các dòng tế bào Ecoli DH5α chứa plasmid chứng
dương đoạn gen Shi- ipaH với cặp mồi vector pJET1.2 .............................................. 41
Hình 4.15 Kết quả sàng lọc các dòng tế bào Ecoli DH5α chứa plasmid chứng
dương đoạn gen V-toxR với cặp mồi vector pJET1.2 .................................................. 41
Hình 4.16 Kiểm tra khuẩn lạc với cặp mồi Sal_invA1 ................................................ 42
Hình 4.17 Kiểm tra khuẩn lạc với cặp mồi Shi_ipaH................................................... 42
Hình 4.18 Kiểm tra khuẩn lạc với cặp mồi V_toxR ..................................................... 42
Hình 4.19 Kết quả so sánh định lượng bằng real-time PCR và phương pháp đếm
khuẩn lạc. ...................................................................................................................... 44
Hình 4.20 Kết quả dựng đường chuẩn realtime PCR cho vi khuẩn Shigella .............. 45
Hình 4.21 Kết quả Realtime PCR dựng đường chuẩn cho Vibrio parahaemolyticus .. 47

x


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Vi khuẩn phân bố rất phổ biến trong môi trường giàu dinh dưỡng, đặc biệt là
trong thực phẩm. Việc sử dụng các thực phẩm nhiễm vi khuẩn Samonella spp,
Shigella, Vibrio parahaemolyticus… là một trong những nguyên nhân gây ngộ độc
thực phẩm với các triệu chứng nguy hiểm như gây mất thăng bằng cho người và động
vật nhiễm bệnh, nhiễm trùng huyết, viêm màng não, sảy thai, hoặc sốt nhức đầu, co
thắt dạ dày, tiêu chảy buồn nôn và ói thường gặp do nhiễm Salmonella.spp hay Vibrio
parahaemolyticus. Ngoài hậu quả trực tiếp làm giảm chất lượng cuộc sống của con
người, các thực phẩm nhiễm khuẩn này còn gián tiếp làm giảm nguồn lợi kinh tế do
không thể xuất khẩu thực phẩm nhiễm vi sinh vật ra nước ngoài, đặc biệt là thủy sản.
Hiện nay, việc phát hiện các vi khuẩn này trong thực phẩm chủ yếu được thực
hiện theo phương pháp nuôi cấy truyền thống, nhược điểm của phương pháp này là xét

với phương pháp đếm khuẩn lạc.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm trên thế giới và ở Việt Nam
Ngộ độc thực phẩm hay ngộ độc thức ăn là các biểu hiện bệnh lý xuất hiện sau
khi ăn uống phải những loại thực phẩm nhiễm khuẩn, nhiễm độc hoặc có chứa chất
gây ngộ độc hoặc thức ăn bị biến chất, ôi thiu... Người bị ngộ độc thực phẩm thường
biểu hiện qua những triệu chứng lâm sàng như nôn mửa, tiêu chảy, chóng mặt, sốt, đau
bụng... Ngộ độc thực phẩm không chỉ gây hại cho sức khỏe (có thể dẫn đến tử vong)
mà còn khiến tinh thần con người mệt mỏi.
Nguyên nhân chính dẫn đến việc ngộ độc thực phẩm thường là do ăn uống phải
thực phẩm đã bị nhiễm khuẩn (như: nhóm E. coli STEC, Salmonella, Shigella, Vibrio
cholerae, Vibrio parahaemolyticus…) hoặc các thực phẩm bị nhiễm hóa học (kim loại
nặng, độc tố vi nấm...). Theo các chuyên gia về an toàn vệ sinh thực phẩm thì ngộ độc
thực phẩm thường diễn ra vào mùa hè do vi sinh vật có nhiều điều kiện thuận lợi sinh
sôi và phát triển. Đặc biệt thực phẩm có nguồn gốc từ động vật như thịt, trứng, cá, sữa
là các chất giàu đạm, rất dễ trở thành môi trường tốt cho các vi sinh vật, nhất là vi
khuẩn gây bệnh phát triển, và khi đó thức ăn đã biến thành chất độc.
Theo số liệu được công bố vào năm 2011 của CDC (Centers for Disease Control
and Prevention), ước tính rằng mỗi năm khoảng 1 trong 6 người Mỹ (hoặc 48 triệu
người) bị bệnh, 128.000 người được nhập viện và 3.000 người chết vì bệnh do thực
phẩm, nguyên nhân gây ngộ độc là do vi khuẩn hoặc virut. Chi phí y tế dùng cho các
trường hợp ngộ độc thực phẩm vượt hơn 77 tỉ USD. Số trường hợp gây ra bởi
Salmonella chiếm 26% số ca nhập viện, và Salmonella cũng là đối tượng gây tử vong
chính. Ở Peru, dịch tả bùng phát năm 1991 đã gây thiệt hại 500 triệu USD cho ngành
chế biến xuất khẩu cá. Bộ Y tế Malaysia cũng đặc biệt quan tâm đến ngộ độc thực
phẩm gây ra bởi Salmonella, Shigella spp, Vibrio spp. Ở Pháp mỗi năm có khoảng


Bacillus Cereus

1 – 6 giờ (ói)
8- 16 giờ
(tiêu chảy)

Do độc tố trong thực
phẩm và ruột

Gạo, bột sấy khô hâm
nóng

Camylobacter

1 - 2 ngày

Nhiễm trùng

Nước uống, tiếp xúc

E. Coli

12 -72 giờ

Độc tố trong ruột

Nước uống, thịt

Listeria


4

Nghêu, sò, nước


2.2.1. Vi khuẩn Salmonella
Salmonella là vi khuẩn Gram âm hình que, hiếu khí và kị khí tùy nghi, có khả
năng di động, hầu hết các loài đều có tiên mao không tạo bào tử. Chúng có khả năng
phát triển ở nhiệt độ từ 6 – 420C, nhiệt độ thích hợp nhất là từ 35 – 370C, ngưỡng pH
từ 6 - 9 và thích hợp nhất ở pH 7,2. Ở nhiệt độ 18 – 400C vi khuẩn có thể sống đến 15
ngày. Salmonella có thể phát triển trên các môi trường nuôi cấy thông thường như LB,
PCA... Đối với những loại môi trường nuôi cấy chuyên biệt như SS agar, XLD vi
khuẩn sẽ phát triển sau 24 giờ.
Đến nay các nhà khoa học đã xác định được 2339 serotype được chia theo hệ
thống Kaffmann White dựa trên công thức kháng nguyên O và kháng nguyên H. Ngoài
một số serotype được đặt tên như Enteritidis (S. enteritidis), Typhi (S. typhi), Paratyphi
(S. paratyphi), Typhimurium (S. typhimurium), hầu hết các serotype khác được kí hiệu
dựa vào tên kháng nguyên.
Các thực phẩm có nguy cơ nhiễm Salmonella cao là trứng, thịt, sản phẩm gia
cầm, và thủy sản. Vi khuẩn này có thể gây ngộ độc thực phẩm khi hiện diện ở mât độ
106 CFU/g. Các triệu chứng thường gặp khi nhiễm Salmonella là tiêu chảy và nôn
mửa. Đặc biệt S. typhi và S. paratyphi gây nguy hiểm cho người. Theo CDC (Centers
for Disease Control and Prevention) từ năm 1996 đến năm 2002, khoảng 2 - 4 triệu ca
bị nhiễm Salmonella ở Mỹ. Ở Việt Nam tỉ lệ nhiễm Salmonella khá cao, đặc biệt trong
thực phẩm không rõ nguồn gốc (Nordstrom, 2011)
Quá trình xâm nhiễm của Salmonella được bắt đầu khi vật chủ tiêu thụ thức ăn
hay nước uống bị nhiễm khuẩn. Sau khi vượt qua được dạ dày, Salmonella xuống tới
ruột non. Sau khi xuống tới phần cuối ruột non, vi khuẩn phải xâm nhập qua lớp niêm
mạc trước khi gắn vào các tế bào biểu mô ruột. Quá trình gắn vào tế bào biểu mô ruột

6


Shigella có tính chuyên biệt kí chủ cao, chỉ xâm nhiễm và tăng trưởng trên loài linh
trưởng. Trong môi trường nước, Shigella có thể tồn tại hơn 6 tháng. Vi khuẩn này có
thể gây ngộ độc khi hiện diện trong thực phẩm với mật độ rất thấp, khoảng 10 CFU/g.
Shigella cũng có thể lây trực tiếp từ người sang người, ở Mỹ Shigella là 1 trong 3 đối
tượng chính gây ra ngộ độc thực phẩm trong năm 2008 (CDC, 2008) Các trường hợp
ngộ độc thực phẩm do Shigella thường tập trung ở các nước kém phát triển, thực phẩm
được chuẩn bị trong đều kiện vệ sinh không đảm bảo. Shigella chiếm khoảng 20% số
ca ngộ độc thực phẩm. Trong đó, rau quả và hải sản là những là những thực phẩm dễ
bị nhiễm Shigella nhất ( McEntire, 2004 và Wang, 2007).
Shigella spp được truyền từ người sang người qua đường phân - miệng hoặc
bằng cách tiếp xúc cơ thể trực tiếp, hoặc gián tiếp do ăn phải thực phẩm hoặc nước bị
ô nhiễm phân người. Các triệu chứng của bệnh vi khuẩn Shigella bao gồm tiêu chảy,
phân có máu, đau bụng và sốt. Máu và mủ trong phân phát triển như một kết quả của
các cuộc xâm lược của Shigella spp vào niêm mạc đại tràng. Một loạt các adhesins cho
phép các vi khuẩn Shigella spp tiếp xúc với các tế bào niêm mạc ruột. Sau khi qua
niêm mạc, Shigella spp sử dụng invasins nhập vào tế bào biểu mô, nơi chúng thoát
khỏi không bào vào tế bào chất và nhân. Chúng tồn tại thực bào bằng cách gây
apoptosis trong các đại thực bào.
Gen mục tiêu đặc hiệu cho vi khuẩn Shigella là gen ial: invasive-associated locus
(ial), có vai trò trong khả năng định cư và xâm nhập vào tế bào ruột (Frankel,1990).
Gen ipaH: invasion plasmid antigen là plasmid chứa trình tự kháng nguyên H. có mặt
ở trên tất cả các chủng Shigella (Vargas, 1999).
2.2.3 Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus)
Vibrio thuộc họ Vibrionaceae, là vi khuẩn Gram âm, hình que, hai đầu không đều
nhau tạo thành hình dấu phẩy, di động, kỵ khí tùy nghi, trừ V. cholerae hiện diện ở
vùng nước ngọt. Các loài Vibrio thường hiện diện trong nước biển do chúng cần ion
Na+ để phát triển. Một số loài có khả năng gây bệnh cho người như V. cholera, V.

trên toàn thế giới (Wang, 2007).
Bên cạnh đó, các phương pháp thử nhanh và tự động hóa trong phân tích vi sinh
vật cũng dần được sử dụng phổ biến nhằm tăng hiệu quả của việc phân tích vi sinh vật
so với phương pháp truyền thống. Các phương pháp này là kết quả của việc ứng dụng
các phương pháp vi sinh, sinh hóa, hóa lý, miễn dịch học, huyết thanh học để hoàn
thiện việc phân lập, phát hiện sớm, mô tả, và định lượng vi sinh vật cũng như sản
8


phẩm của chúng trong những mẫu nước và thực phẩm. Đồng thời, một số phương pháp
này đã được AOAC (Association of Official Agriculture Chemists) công nhận. Hầu
hết các phương pháp nhanh và nhạy dùng trong công nghiệp hiện nay đều dựa trên
phương pháp phân tích miễn dịch, phân tích nucleic acid, hoặc kỹ thuật phát quang
sinh học. Các phương pháp này có thể sử dụng độc lập hoặc phối hợp với nhau (Trần
Linh Thước, 2006).
2.3.1. Phương pháp đếm khuẩn lạc
Đối với vi sinh vật đơn bào, ta có thể xem mỗi khuẩn lạc là kết quả của sự phát
triển từ một tế bào ban đầu. Vì vậy đếm số khuẩn lạc có thể biết được số lượng tế bào
vi sinh vật trong thể tích ban đầu. Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp đếm
khuẩn lạc được tiến hành theo các bước sau:


Bước 1: Pha loãng mẫu

Pha loãng mẫu theo TCVN 4887-89. Pha loãng mẫu cho đến khi có được đậm
độ pha loãng cần thiết đủ đếm được số khuẩn lạc trên đĩa theo dự tính.


Bước 2: Đổ đĩa


Làm tròn số kết quả có được, chỉ giữ lại 2 số có nghĩa.
Biểu thị kết quả dưới dạng thập phân giữa 1,0 và 9,9 nhân với 10n (n là số mũ
thích hợp của 10).
2.3.2. Phương pháp Real-time PCR
Phương pháp Real-time PCR hay còn có tên gọi khác là Q-PCR (Quantitative
PCR) nghĩa là PCR định lượng. Thực chất đây là sự kết hợp giữa phương pháp PCR
truyền thống và kĩ thuật phát hiện tín hiệu huỳnh quang các sản phẩm khuếch đại sau
mỗi chu kì phản ứng. Phương pháp real-time PCR có độ nhạy cao, định lượng chính
xác số bản sao trong phản ứng PCR vì vậy có thể cắt giảm bớt các thí nghệm kiểm tra
sau PCR. Trong PCR truyền thống, sản phẩm khuếch đại được phát hiện bằng cách
chạy điện di DNA trên agarose gel sau khi phản ứng kết thúc ngược lại phương pháp
real-time PCR cho phép phát hiện và định lượng sản phẩm khuếch đại khi tiến trình
phản ứng đang diễn ra dựa trên cơ sở phản ứng huỳnh quang, trong đó sự tăng lên về
số lượng DNA tương ứng với sự tăng lên của tín hiệu huỳnh quang.
Trong kỹ thuật real-time PCR, chất phát huỳnh quang chính là chìa khóa kỹ thuật
được thêm vào trong mix PCR. Khi trong tube phản ứng có sản phẩm khuếch đại thì
chất phát huỳnh quang này phải làm thế nào để phát được tín hiệu huỳnh quang đúng
với lượng sản phẩm tạo thành, và không phát tín hiệu khi không có sản phẩm khuếch
đại. Trong real-time PCR, người ta thường sử dụng các loại thuốc nhuộm liên
kết DNA sợi đôi (SYBR Green) để phát huỳnh quang, và các probe hoặc mồi đặc
hiệu chuỗi (trình tự) được đánh dấu huỳnh quang (TaqMan PCR). Thiết bị ổn nhiệt
chu kỳ (máy PCR) đặc biệt được gắn với một module phát hiện tín hiệu huỳnh quang
để theo dõi tiến trình phản ứng khi sự khuếch đại xảy ra. Tín hiệu huỳnh quang đo
được phản ánh số lượng sản phẩm được khuếch đại trong mỗi chu kỳ (Nguyễn Hoàng
Lộc, 2007).
10


SYBR Green màu huỳnh quang chèn vào sợi đôi DNA là một loại màu huỳnh
quang có ái lực rất cao khi có sự hiện diện của sợi đôi DNA và ái lực này là do khả

thiểu và các thao tác hậu khuếch đại được loại bỏ (Phạm Hùng Vân. 2009 ).
2.3.2.2. Phân tích tổng quát một phản ứng real-time PCR
Để hiểu được real-time PCR như thế nào, chúng ta bắt đầu bằng một đường cong
khuếch đại mẫu (Hình 2.3). Trong hình này, số chu kỳ PCR được trình bày trên trục x,
và tín hiệu huỳnh quang từ phản ứng khuếch đại, tỷ lệ với số lượng sản phẩm được
khuếch đại trong tube, được trình bày ở trục y. Đường cong khuếch đại có 2 pha, một
pha hàm mũ (exponential phase) được tiếp theo bởi một pha ổn định (plateau phase).
Trong suốt pha hàm mũ, số lượng sản phẩm PCR xấp xỉ gấp đôi trong mỗi chu kỳ.
Tuy nhiên, khi phản ứng diễn ra thành phần phản ứng sẽ bị tiêu hao, cuối cùng làm
cho một hoặc nhiều thành phần bị hạn chế. Ở điểm này phản ứng chậm lại và đi vào
pha ổn định (các chu kỳ 28-40, Hình 2.3).

12


Hình 2.3 Đường cong khuếch đại của phản ứng real-time PCR
Đầu tiên, tín hiệu huỳnh quang duy trì ở mức độ nền (background), và việc tăng
tín hiệu huỳnh quang là không thể phát hiện được (các chu kỳ 1-18, Hình 2.3) cho dù
sản phẩm tích lũy theo hàm mũ. Sau đó, sản phẩm khuếch đại tích lũy đủ để đạt tới
một hiệu suất cho phép phát hiện được tín hiệu huỳnh quang. Số chu kỳ để đạt được
hiệu suất này gọi là chu kỳ ngưỡng (threshold cycle, CT). Do giá trị CT được đo trong
pha hàm mũ khi các tác nhân phản ứng không bị hạn chế, nên real-time qPCR có thể
được sử dụng để tính toán chính xác và tin cậy số lượng khởi đầu của khuôn mẫu hiện
diện trong phản ứng. CT được xác định chủ yếu bởi số lượng của khuôn mẫu hiện diện
ở lúc bắt đầu phản ứng khuếch đại. Khi lượng khuôn mẫu nhiều thì chỉ cần một vài
chu kỳ khuếch đại để tích lũy sản phẩm đủ cho một tín hiệu huỳnh quang ở trên mức
độ nền. Vì vậy, phản ứng sẽ có CT thấp hơn hoặc sớm. Ngược lại, nếu lượng khuôn
mẫu lúc bắt đầu phản ứng quá ít, thì số chu kỳ khuếch đại cần nhiều hơn để tín hiệu
huỳnh quang tăng trên đường nền. Vì vậy, phản ứng sẽ có CT cao hoặc muộn. Các
dạng quan hệ này là cơ sở định lượng của real-time PCR (Nguyễn Hoàng Lộc, 2007).