TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
VIỆN CN SINH HỌC & CN THỰC PHẨM

NGUYỄN THỊ NGÂN HÀ

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN
CÓ HOẠT TÍNH CAO TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN
CHƢỢP MẮM CÁT HẢI

LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Hà Nội – Năm 2017


TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
VIỆN CN SINH HỌC & CN THỰC PHẨM

NGUYỄN THỊ NGÂN HÀ

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN
CÓ HOẠT TÍNH CAO TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN
CHƢỢP MẮM CÁT HẢI

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Mã số:

15BCNTP-06

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC :
1. TS. Bùi Thị Thu Hiền

Tôi xin dành những dòng cuối để cảm ơn bố mẹ, chồng con và những ngƣời
thân trong gia đình đã dành thời gian cho tôi, thay tôi làm mọi công việc gia đình và
luôn động viên tôi yên tâm học tập, công tác. Tôi cũng dành sự trân trọng với bạn
bè, đồng nghiệp đã luôn ở bên tôi trong những lúc khó khăn để vƣơn lên trong học
tập, công tác và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong thời gian thực hiện luận
văn.
Hà Nội, ngày 18 tháng 9 năm 2017
Ngƣời viết báo cáo

Nguyễn Thị Ngân Hà

II


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT .............................. VI
DANH MỤC CÁC BẢNG ....................................................................................VII
DANH MỤC HÌNH ............................................................................................. VIII
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
CHƢƠNG 1- TỔNG QUAN.....................................................................................3
1.1

KHÁI QUÁT VỀ NƢỚC MẮM ....................................................................3

1.1.1

Khái niệm ................................................................................................3

1.1.2



1.3.2

Quy trình sản xuất .................................................................................17

1.4.

MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ LĨNH VỰC SẢN XUẤT NƢỚC MẮM TỪ

CÁ…. .....................................................................................................................22
1.4.1 Nghiên cứu bổ sung protease trong sản xuất nƣớc mắm ........................22
1.4.2 Nghiên cứu tạo hƣơng nhờ vi sinh vật trong sản xuất nƣớc mắm ..........24
1.5.

VAI TRÕ CỦA VI SINH VẬT TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT NƢỚC

MẮM. ....................................................................................................................25
1.6.

CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN CHẤT LƢỢNG NƢỚC MẮM ........27

1.6.1

Ảnh hƣởng của độ muối .......................................................................27

1.6.2

Ảnh hƣởng của nhiệt độ ........................................................................28

1.6.3


2.2.2

Thiết bị dùng trong nghiên cứu.............................................................30

2.3.

MÔI TRƢỜNG PHÂN LẬP VÀ NUÔI CẤY VI SINH VẬT ...................31

2.4.

PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................................31

2.4.1

Định lƣợng và phân lập vi khuẩn hiếu khí tổng số ...............................31

2.4.2

Sàng lọc các chủng vi khuẩn chịu mặn có hoạt t nh protease định

t nh ….................................................................................................................32
2.4.3

Sàng lọc các chủng vi khuẩn có khả năng sinh hƣơng định t nh ......32

2.4.4

Giải trình tự đoạn ARNr 16S ................................................................33


IỆN NUÔI CẤY TỚI

HẢ NĂNG SINH TRƢỞNG CỦA CÁC CHỦNG VI

HUẨN M1, M2, H10

3.3.

VÀ H12 ..................................................................................................................49
3.3.1

Ảnh hƣởng của nhiệt độ .......................................................................49

3.3.2

Ảnh hƣởng của pH ...............................................................................50

IV


3.3.3
3.4.

Khảo sát đặc tính chịu mặn của các chủng vi khuẩn ...........................50

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CHẾ PHẨM VI SINH SỬ DỤNG TRONG

SẢN XUẤT NƢỚC MẮM TỪ CÁC CHỦNG VI HUẨN M1 VÀ H12...........51
3.4.1


TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam

CH

Cát Hải

Môi trƣờng NA

Môi trƣờng Nutrient Agar

Môi trƣờng MRS

Môi trƣờng De Man, Rogosa and Sharpe

CFU/ gram

Tổng số khuẩn lạc / gam

CT

Công thức

VI


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Tên các loại nƣớc mắm và tỷ lệ phối trộn tạo sản phẩm ở cá nƣớc khác
nhau .............................................................................................................................3

25% NaCl...........37

Hình 3.3: Hình ảnh số lƣợng và các loại khuẩn lạc vi khuẩn hiếu kh mọc trên môi
trƣờng NA

25% NaCl. Hình ảnh chụp từ c ng nồng độ pha loãng mẫu ở chƣợp

lên men ở tháng 1 A và chƣợp lên men tháng 12 B . ...........................................38
Hình 3.4: hả năng sinh protease của 87 chủng vi khuẩn phân lập từ chƣợp mắm .40
Hình 3.5: hả năng sinh protease của một số chủng vi khuẩn hoạt t nh cao ..........40
Hình 3.6: Điện di đồ sản phẩm PCR nhân đoạn gen mã hóa 16S rARN từ ADN tổng
số. ..............................................................................................................................43
Hình 3.7:

huẩn lạc và tế bào chủng M1.

huẩn lạc chụp sau 48 giờ nuôi cấy, tế

bào chụp sau 24 giờ nuôi cấy ....................................................................................44
Hình 3.8:

huẩn lạc và tế bào chủng M2.

huẩn lạc chụp sau 48 giờ nuôi cấy, tế

bào chụp sau 24 giờ nuôi cấy ....................................................................................45
Hình 3.9: Cây phát sinh chủng loại của chủng M1 và M2 và các loài vi khuẩn thuộc
nhóm Bacillus amyloliquefaciens xây dựng dựa trên đoạn gene 16S rRNA............46
Hình 3.10: huẩn lạc và tế bào chủng H12 ..............................................................47
Hình 3.11: Cây phát sinh chủng loại của chủng H12 với các loài có quan hệ họ hàng

“chăm sóc” hàng ngày với các hoạt động khấy đảo, phơi nắng, kéo rút… Để sản
xuất ra 1 l t nƣớc mắm thành phẩm thì công nhân phải tốn rất nhiều “mồ hôi và
công sức” nhƣng hiệu quả kinh tế mang lại không cao, thị trƣờng tiêu thụ hạn chế,
phản hồi từ ngƣời tiêu d ng không tốt nhƣ: vị quá mặn, màu không ổn định, bao bì
đơn giản không bắt mắt, thiếu quảng bá hình ảnh thƣơng hiệu…

1


Nhằm rút ngắn chu kỳ sản xuất, nâng cao hƣơng vị và chất lƣợng nƣớc mắm,
đáp ứng yêu cầu ngày càng cao của thị trƣờng, góp phần giảm giá thành trong sản
xuất nƣớc mắm theo phƣơng pháp truyền thống là vấn đề cần thiết hiện nay.
Xuất phát từ yêu cầu đó tôi đã tiến hành đề tài : “Phân lập và tuyển chọn các
chủng vi khuẩn có hoạt tính cao trong quá trình lên men chượp mắm Cát Hải”.

2


CHƢƠNG 1- TỔNG QUAN
Khái quát về nuớc mắm

1.1

1.1.1 Khái niệm
Nƣớc mắm là một dung dịch bao gồm các acid amin, muối NaCl và các chất
thơm, đƣợc tạo thành do quá trình thủy phân protein cá nhờ hệ enzyme protease và
vi sinh vật có trong cá.
Nƣớc mắm là sản phẩm truyền thống của Việt Nam. Nƣớc mắm có từ lâu
đời, nó đã gắn liền với đời sống hàng ngày, mang nét đặc trƣng rất riêng.
1.1.2 Các loại nƣớc mắm


Thái Lan

Nam-pla

Malaysia

Budu

Tỷ lệ 3 : 1 - 3 : 2 = Cá : Muối (6-12 tháng)
Tỷ lệ 5 : 1 = Cá : Muối (5-12 tháng)
Tỷ lệ 5 : 1 - 3 : 1 = Cá : Muối

đƣờng + me (3-12

tháng)
Philippine

Patis

Tỷ lệ 3 : 1 - 4 : 1 = Cá : Muối (3-12 tháng)

Các loại nƣớc mắm ở Việt Nam
Trên thị trƣờng Việt Nam hiện nay có rất nhiều thƣơng hiệu nổi tiếng về
nƣớc mắm truyền thống, nhƣng đặc trƣng nhất và mang nét riêng của mỗi vùng
miền vẫn là nƣớc mắm Cát Hải (Hải Phòng , nƣớc mắm Phan Thiết (Bình Thuận),

3




4


Bảng 1.2:

m lượng a it amin trong nước mắm mg ml Đỗ Đình

ọc, 1990)

Theo Đỗ Đình Học 1990 hàm lƣợng axit amin trong ba loại nƣớc mắm
bảng 1.2), các chất có đạm trong nƣớc mắm bao gồm nitơ toàn phần, nitơ axit
amin, nitơ các chất bay hơi chủ yếu là NH3 … Ngƣời ta đã dựa vào lƣợng nitơ toàn
phần để phân hạng nƣớc mắm. Nƣớc mắm có thành phần dinh dƣỡng cao là vì nó
có đầy đủ các axit amin mà đặc biệt là các axit amin thiết yếu nhƣ valin, lơxin,
isolơxin, threonin, methionin, lysin, phenylalanin, triptophan và histidin.
Các th nghiệm nhỏ chế biến nƣớc mắm từ cá cơm đại diện cho cá nổi và cá
lƣợng đại diện cho cá đáy cho thấy hàm lƣợng các axit amin ở nƣớc cá cơm cao
hơn nhiều ở cá lƣợng là xistin, lysin, histidin, axit aspactic, treonin và alanin. Riêng
phenylalanin, xerin, tyrisin thì ở cá lƣợng cao hơn cá cơm một t. Từ đó cho ta thấy
thành phần hóa học của nƣớc mắm có khác nhau theo các nguyên liệu đem chế

5


biến, các axit amin có hàm lƣợng cao trong nƣớc mắm cá cơm và cá lƣợng là:
tyrosin, lơxin

isolơsin, lysin và xêrin; với hàm lƣợng trung bình là axit glutamic,


peptid → axit amin. Do vậy, trong sản xuất nƣớc mắm, quá trình thủy phân là yếu
tố mở đầu cho việc hình thành mùi vị và màu sắc của sản phẩm. Phản ứng thủy
phân tạo ra các axit amin sau đó các axit amin biến đổi theo bốn chiều hƣớng khác
nhau theo sơ đồ.
(1)
Vi sinh vật gây hƣơng
(2)

Thủy phân
Axit amin

Protein

(3)

Protease

Tạo mùi

Tạo vị ngọt đặc trƣng
Oxy hóa phi enzyme
Melanoidin

(4)
NH3
7

Mùi vị đặc trƣng

Màu

đặc trƣng màu sắc; mùi; vị cho nƣớc mắm truyền thống mà ở phƣơng pháp sản xuất
nƣớc mắm ngắn ngày và nƣớc mắm công nghiệp không thể có. Trong quá trình ủ
chín xảy ra hàng loạt các phản ứng thủy phân ở các cấp độ khác nhau, kết hợp với

8


hoạt động của các chủng vi sinh vật tạo lên sự biến đổi theo chiều hƣớng có lợi và
hình thành mùi vị đặc trƣng cho nƣớc mắm.
Qua các tài liệu tổng quan cho thấy hệ vi sinh vật đóng vai trò quan trọng và
có tính chất quyết định đến việc hình thành hương vi đặc trưng của nước mắm.
Nguồn nguyên liệu, quy trình sản xuất khác nhau sẽ có những hệ vi sinh vật gây
hương khác nhau. Trong pham vi luận văn sẽ hoàn thiện quy trình tạo hương nước
mắm đặc sản Cát Hải (từ cá quẩn, cá nhâm) bằng chế phẩm vi sinh.
1.2. Nguyên liệu sản xuất nƣớc mắm
1.2.1

Cá
Nguyên liệu ch nh d ng để sản xuất nƣớc mắm là các loại cá. Nó đóng vai

trò quan trọng, quyết định nhiều đến phần chất lƣợng và giá thành của nƣớc mắm,
do vậy, việc lựa chọn loại cá để đƣa vào sản xuất cũng là một vấn đề đáng quan tâm
và đƣợc nhà sản xuất hết sức coi trọng.
Nƣớc mắm chủ yếu đƣợc sản xuất từ các loại cá biển nhỏ nhƣ: cá nục, cá
tráp, cá liệt, cá tạp… là những loài cá có giá trị kinh tế thấp. Tuy nhiên, việc sử
dụng loại cá gì còn phụ thuộc vào từng vùng miền, từng mùa vụ khác nhau.
Các loài cá nhƣ cá Quẩn (cá Nục – Chi cá Nục Decapterus thuộc họ cá Khế
Carangidae), cá Nhâm (cá Trích – Clupeidae đƣợc phần lớn cơ sở sản xuất nƣớc
mắm lựa chọn, nguyên nhân chính là loài cá này có nguồn cung cấp dồi dào, giá
thành rẻ, d kiếm. Mặt khác, nƣớc mắm làm từ cá Nhâm cho màu nƣớc mắm đẹp

Thành phần hóa học của cá ở từng cơ quan, bộ phận có sự khác nhau.
Bảng 1.4: Thành ph n hóa học của cá
Thành phần
Nƣớc

Protein

Lipid

Muối vô cơ

Thịt cá

48 – 85,1

10,3 – 24,4

0,1 – 5,4

0,5 – 5,6

Trứng cá

60 – 70

20 – 30

1 – 11

1–2

TT

Nƣớc

Protein

Lipit

Tên loại cá
1

Nục sổ

76.80

21.75

0.85

2

Mối thƣờng

77.50

19.26

1.80

3

1.21

6

Cơm

75.14

11.25

2.10

7

Mòi

76.60

9.37

14.40

8

Lẹp

81.84

10.00


protein

này hòa

tan

trong

nuớc,

trong dung dịch muối trung tính có nồng dộ ion thấp
Histidine

2.0

2.6

3.8

2.2

Phenylalanine

3.9

5.3

4.5

5.4

Leucine

8.4

10.2

8.2

8.4


Valine

6.0

7.6

5.0

8.1

1.2.2 Nƣớc
Lƣợng nƣớc cho vào trong quá trình thủy phân phải phù hợp thì quá trình
thủy phân nhanh hơn. Lƣợng nƣớc cho vào trong quá trình thủy phân tốt nhất là
khoảng 30 – 40% so nguyên với nguyên liệu, khi cho nƣớc vào nên cho 5 – 10%
muối NaCl và duy trì nhiệt độ thủy phân 540C – 580C trong suốt thời gian lên men
là 64 – 72 giờ.
1.2.3 Muối
Muối là nguyên liệu quan trọng cho quá trình sản xuất nƣớc mắm, thiếu
muối nƣớc mắm sẽ không hình thành đƣợc.
Nhờ khả năng hút nƣớc nên muối đƣợc dùng tồn trữ thực phẩm, ức chế đƣợc
vi sinh vật phát triển trong thực phẩm trừ các loại vi sinh vật chịu mặn
Yêu cầu của muối trong quá trình sản xuất nƣớc mắm phải là muối ăn
(NaCl), muối càng tinh khiết càng tốt. Tốt nhất là muối kết tinh hạt nhỏ, có độ rắn
cao, màu trắng óng ánh, không đóng cục, không có vị đắng chát.

12


1.2.4. Enzyme protease
Quá trình chế biến nƣớc mắm các thành phần cơ thịt cá bị biến đổi mà chủ

13


có hoạt t nh khá mạnh, có khả năng thủy phân rộng rãi đối với các loại peptid. Đâu
là nhóm thủy phân enzyme trung t nh, pH tối th ch từ 5-7.
Hệ enzyme serin-protease
Hệ này tồn tại nhiều trong nội tạng cá, điển hình là enzyme trypsin. Ở giai
đoạn đầu của quá trình sản xuất nƣớc mắm hệ enzyme hoạt động yếu, sau phát triển
dần và đạt giá trị cực đại vào tháng thứ 3 rồi giảm dần đến khi chƣợp ch n. Hệ
enzyme này luôn bị ức chế bởi chuỗi các acid amin trong cấu trúc của enzyme.
Enzyme serin-protease hoạt động mạnh ở pH từ 5-10, mạnh nhất ở pH 9.
Hệ enzyme acid-protease
Có trong thịt và nội tạng cá, điển hình là enzyme cathepsin D. Hệ enzyme
này d bị ức chế bởi nồng độ muối khoảng 15% nên thƣờng nó chỉ tồn tại một thời
gian ngắn ở thời kỳ đầu của quá trình thủy phân. Loại enzym này đóng vai trò thứ
yếu trong quá trình sản xuất nƣớc mắm.
Nguồn thu nhận enz me protease:
Enzyme Protease phân bố chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn…gồm
nhiều loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyces và
một số và một số loại nấm men.


Vi khuẩn
Lƣợng protease sản xuất từ vi khuẩn đƣợc ƣớc t nh vào khoảng 500 tấn,
chiếm 59% lƣợng enzyme đƣợc sử dụng .
Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidase
hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên, do đó
protease của vi khuẩn có t nh đặc hiệu cơ chất cao. Chúng có khả năng phân hủy tới
80% các liên kết peptide trong phân tử protein .
Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là

Xạ khuẩn
Về phƣơng diện tổng hợp protease, xạ khuẩn đƣợc nghiên cứu t hơn vi
khuẩn và nấm mốc. Tuy nhiên, ngƣời ta cũng đã tìm đƣợc một số chủng có khả
năng tổng hợp protease cao nhƣ: Streptomyces grieus, S. fradiae, S. Trerimosus...
Các chế phẩm protease từ xạ khuẩn đƣợc biết nhiều là pronase Nhật đƣợc
tách chiết từ S. grieus, enzyme này có đặc t nh đặc hiệu rộng, có khả năng thủy
phân tới 90% liên kết peptide của nhiều protein thành amino acid. Ở Liên Xô cũ ,
ngƣời ta cũng tách đƣợc chế phẩm tƣơng tự từ S. grieus có tên là protelin.
Từ S. fradiae cũng có thể tách chiết đƣợc keratinase thủy phân karetin. Ở
Mỹ, chế phẩm đƣợc sản xuất có tên là M-Zim d ng trong sản xuất da. Protease từ S.
fradiae cũng có hoạt t nh elastase cao, do đó chúng đƣợc d ng trong công nghiệp
chế biến thịt.
Hầu hết các protease phân cắt protein ở các liên kết đặc hiệu, vì thế có thể sử
dụng các enzyme này theo chiều phản ứng tổng hợp để tổng hợp các liên kết
peptide định trƣớc. Yếu tố tăng cƣờng quá trình tổng hợp bao gồm pH, các nhóm
carboxyl hoặc nhóm amine đƣợc lựa chọn để bảo vệ, khả năng kết tủa sản phẩm,
phản ứng trong hệ hai pha lỏng.

15