BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN
CÓ HOẠT TÍNH KEO TỤ SINH HỌC TỪ CÁC AO NUÔI
TÔM TẠI TỈNH TRÀ VINH

Ngành

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn

: ThS. PHẠM MINH NHỰT

Sinh viên thực hiện

: VÕ LAN HƯƠNG

MSSV : 1411100330

Lớp : 14DSH03

TP. Hồ Chí Minh, 2018


bè em, đã quan tâm sâu sắc, chia sẻ khó khăn trong quá trình thực tập và hoàn
thành báo cáo thật tốt.
Trong quá trình hoàn thiện báo cáo không tránh khỏi những thiếu xót nhất định
mà em chưa thể khắc phục nên em rất mong nhận được sự góp ý của quý thầy cô
để đề tài này được hoàn chỉnh hơn.
Em xin chân thành cảm ơn.
Sinh viên

Võ Lan Hương


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT......................................................................................... v
DANH MỤC CÁC BÀNG........................................................................................................... vi
DANH MỤC HÌNH........................................................................................................................ vii
MỞ ĐẦU.............................................................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN...................................................................................................... 3
1.1 Giới thiệu về ngành nuôi trồng thủy sản...................................................................... 3
1.2 Khó khăn của ngành nuôi trồng thủy sản................................................................... 4
1.2.1 Ảnh hưởng của dịch bệnh................................................................................................. 4
1.2.1.1 Bệnh do virus........................................................................................................................ 4
1.2.1.2 Bệnh do vi khuẩn................................................................................................................. 7
1.2.2 Ảnh hưởng của môi trường nước.................................................................................. 8
1.2.2.1 Ô nhiễm từ nguồn nitơ...................................................................................................... 8
1.2.2.2 Ô nhiễm từ lớp bùn hình thành...................................................................................... 9
1.2.2.3 Ô nhiễm từ môi trường tự nhiên.................................................................................... 9
1.2.2.4 Một số nguyên nhân khác................................................................................................ 9
1.3 Vai trò của chế phẩm vi sinh trong nuôi trồng thủy sản....................................... 9
1.3.1 Khái niệm................................................................................................................................. 9
1.3.2 Thành phần............................................................................................................................. 10

2.3.1 Dụng cụ..................................................................................................................................... 15
2.3.2 Thiết bị....................................................................................................................................... 15
2.4 Phương pháp nghiên cứu..................................................................................................... 16
2.4.1 Phương pháp thu mẫu và xử lý mẫu............................................................................ 16
2.4.2 Phương pháp phân lập........................................................................................................ 16
2.4.3 Phương pháp nhuộm Gram.............................................................................................. 18
2.4.4 Phương pháp nhuộm bào tử............................................................................................. 18
2.4.5 Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật..................................................... 20
2.4.5.1 Phương pháp cấy chuyển vi sinh vật........................................................................... 20
2.4.5.2 Phương pháp bảo quản lạnh sâu.................................................................................. 20
2.4.6 Phương pháp tăng sinh, xác định mật độ tế bào vi sinh vật............................... 20
2.4.7 Phương pháp đánh giá hoạt tính keo tụ sinh học................................................... 21
2.4.8 Phương pháp định danh.................................................................................................... 21

ii


2.4.8.1 Định danh bằng các phản ứng sinh hóa.................................................................... 21
2.4.8.2 Định danh bằng sinh học phân tử................................................................................ 31
2.4.9 Phương pháp xử lý số liệu................................................................................................. 31
2.5 Bố trí thí nghiệm....................................................................................................................... 31
2.5.1 Sơ đồ thí nghiệm.................................................................................................................... 31
2.5.2 Quy trình phân lập................................................................................................................ 31
2.5.3 Sàn lọc hoạt tính keo tụ sinh học các chủng sau định danh sơ bộ.................32
2.5.4 Định danh các chủng vi khuẩn sau sàng lọc............................................................ 32
2.5.4.1 Định danh bằng các phản ứng sinh hóa.................................................................... 32
2.5.4.2 Định danh bằng sinh học phân tử................................................................................ 33
2.5.5 Bước đầu khảo sát quy trình thu hồi hợp chất keo tụ sinh học từ vi khuẩn
34
2.5.5.1 Sơ đồ quy trình thu hồi..................................................................................................... 34


TSB

: Trypto-casein soy broth

COD

: Chemical Oxygen Demand

DO

: Dessolved Oxygen

BOD

: Biochemical oxygen Demand

TSS

: Turbidity & suspendid solids

DNA

: Deoxyribonucleic acid

PCR

: Polymerase Chain Reaction

NCBI

Hình 2.9: Thử nghiệm Nitrate........................................................................................................ 39
Hình 2.10: Môi trường TSB có bổ sung NaCl......................................................................... 40
Hình 2.11: Môi trường TSB ở 500C và 600C............................................................................ 40
Hình 2.12: Quy trình tinh sạch chất kết tụ sinh học............................................................... 44
Hình 3.1: Hoạt tính keo tụ sinh học của 22 chủng vi khuẩn phân lập.............................28
Hình 3.2: Kết quả định danh chủng 9.4 bằng phương pháp giải trình tự rDNA.........31
Hình 3.3: Kết quả tách chiết hoạt tính keo tụ sinh học từ chủng 9.4............................... 32

vii


MỞ ĐẦU
1.

Đặt vấn đề
Qua nhiều năm, ngành nuôi tôm ở Việt Nam đã có những bước phát triển đáng

kể đóng góp một phần không nhỏ trong việc phát triển kinh tế của đất nước. Tuy giá
trị kinh tế của ngành nuôi trồng thủy sản mang lại khá lớn nhưng để phát triển lớn
mạnh hơn nữa, ngành nuôi trồng thủy sản phải vượt qua không ít thách thức do thực
tế với quy mô nuôi nhỏ lẻ, ít được đầu tư đồng bộ về cơ sở hạ tầng, kỹ thuật dẫn đến
việc kiểm soát môi trường và dịch bệnh trong toàn vùng nuôi gặp nhiều khó khăn.
Hơn nữa, những hiện tượng thời tiết cực đoan như nắng nóng kéo dài, mưa lớn, hạn
hán, thay đổi cường độ và tần suất của bão…do tác động của biến đổi khí hậu xuất
hiện ngày càng nhiều ảnh hưởng không nhỏ đến môi trường nước nuôi tôm dẫn đến
sản lượng và chất lượng tôm nuôi giảm.
Để khắc phục hiện tượng trên nhiều nghiên cứu đã được thực hiện như xử lý
nước thải nuôi trong thủy sản bằng cụm vi tảo, ứng dụng men vi sinh, loại bỏ chất
hữu cơ khỏi các vùng nước ven biển bị ô nhiễm bằng thực vật xử lý môi trường,…
Trong đó công nghệ biofloc được ứng dụng rộng rãi hơn cả. Công nghệ biofloc


Nội dung nghiên cứu
 Phân lập các chủng vi khuẩn có hoạt tính keo tụ sinh học từ các ao nuôi tôm
tại tỉnh Trà Vinh.
 Xác định hoạt tính keo tụ sinh học.
 Sàng lọc hoạt tính keo tụ sinh học của các chủng.
 Định danh.
 Tinh sạch chất kết tụ sinh học.

4.

Phạm vi nghiên cứu
Các ao nuôi tôm ở Hòa Minh, xã Long Hưng 1, huyện Châu Thành, thành phố

Trà Vinh.

2


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1 Giới thiệu về ngành nuôi trồng thủy sản
Trà Vinh là tỉnh ven biển thuộc vùng Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) với
tổng diện tích tự nhiên là 2.288,09 km 2, dân số (năm 2010) là 1.005.856 người, mật
độ dân số 440 người/km2. Ở vị trí nằm kẹp giữa 2 con sông lớn là sông Cổ Chiên và
sông Hậu, một mặt giáp biển Đông (dài 65 km), có 2 cửa sông quan trọng là Cung
Hầu và Định An, hệ thống sông, kênh, rạch chằng chịt với tổng chiều dài 578 km
diện tích lưu vực tự nhiên là 21.265 ha và khoảng 98.597 ha ngập nước (từ 3-5
tháng/năm), có luồng cho tàu biển trọng tải lớn vào sông Hậu qua địa bàn huyện
Duyên Hải đã được Thủ tướng phê duyệt. Vùng biển Trà Vinh rộng 45.536 hải lý
vuông, nguồn lợi thủy sản rất phong phú với nhiều loài có giá trị kinh tế cao; trữ

triệt để, tình hình dịch bệnh xảy ra rải rác suốt vụ nuôi, ở hầu hết vùng nuôi, gây
thiệt hại lớn cho người nuôi, chủ yếu các bệnh do virus gây ra như: WSSV, MBV,
YHV, TSV hay bệnh do vi khuẩn: bệnh phát sáng, bệnh gan thận mủ …
1.2.1.1 Bệnh do virus
a. Whiter Spot Syndrome Virus - WSSV
 Nguyên nhân: Do virus gây hội chứng đốm trắng (Whiter Spot Syndrome
Virus) gây ra
 Cách thức: Virus gây hội chứng đốm trắng khi xâm nhập vào tôm sẽ cư trú
ở nhiều bộ phận của tôm như mô nội bì, mô dạ dày, mang, buồng trứng, tinh hoàn,
hệ thống thần kinh, mắt, chân bơi và các bộ phận khác. Sau khi xâm nhập vào tế
bào chủ, virus này tiến hành tự nhân bản dựa trên cơ sở vật chất và năng lượng của
tế bào. Thông qua quá trình này, số lượng virus tăng lên rất nhanh, đồng thời làm
thay đổi hoạt động bình thường của tế bào. Khi quan sát dưới kính hiển vi các tế
bào bị nhiễm virus thường có nhân phình to. Virus phát triển đến giai đoạn phá vỡ
nhân và giết chết tế bào, virus lan truyền ra môi trường nước, đi tìm ký chủ khác và
lại tiếp tục xâm nhập, tấn công. (Trần Thị Việt Ngân, 2002 )
 Tác hại: Tôm bị bệnh đốm trắng dễ dàng phát hiện ở tôm nhỏ và sắp trường
thành, thường xuất hiện ở tầng mặt và dạt vào bờ, bỏ ăn, hoạt động kém, các phần
phụ bị tổn thương, nắp mang phồng lên và vỏ có nhiều sinh vật bám. Khi tôm bị
bệnh có dấu hiệu sức khỏe yếu đồng thời các đốm trắng xuất hiện, tỷ lệ tôm phát
bệnh trong vòng 3 – 10 ngày lên đến 100% và tôm chết hầu hết ở ao nuôi.

4


b. Monodon Baculovirus MBV
 Nguyên nhân: Tác nhân gây bệnh là virus type A Monodon Baculovirus
 Cách thức: Vào giai đoạn đầu, sau khi tế bào vật chủ nhiễm MBV nhân tế
bào vẫn bình thường, chỉ có biến đổi nhỏ ở tế bào chất. Sau đó nhân tế bào sưng
lên, xuất hiện thể ẩn trong nhân. Tế bào chất mất dần chức năng và hình thành giọt

5


 Nguyên nhân: Tác nhân gây bệnh là Taura Syndrome Virus
 Cách thức: Tôm bị hội chứng Taura thường diễn biến qua 3 thời kỳ của
bệnh
Thời kỳ cấp tính: Tôm postlarvae hay tôm lớn của loài P.vannamei khi bị
bệnhcho thấy sự chuyển màu đỏ nhợt, đặc biệt là đuôi và các chân bơi, nên người
nông dân Ecuador đã đặt tên cho bệnh này, khi xảy ra lần đầu, là bệnh đỏ đuôi - Tail
Red Diseasse. Sự thay đổi màu là do sự phình to của sắc tố đỏ trong biểu mô vỏ. Sự
dày mọng của các mép chân bơi, chân bò và đuôi tôm, là dấu hiệu đầu tiên của sự
hoại tử cục bộ. Tôm bệnh còn có một số dấu hiệu khác như: mềm vỏ, ruột rỗng và
thường chết khi lột xác. Khi dịch bệnh xảy ra, một số loài chim biển sẽ tấn công ao
có tôm bệnh. Ở tôm he chân trắng (P.vannamei), giai đoạn cấp tính có tỷ lệ chết cao
(40 – 90%). Trong khi đó loài P. stylirostris đã có sức đề kháng, chống lại sự cảm
nhiễm của loại virus này.
Thời kỳ chuyển tiếp: Dù giai đoạn chuyển tiếp của Taura Syndrome chỉ diễn ra
trong trong thời gian ngắn, nhưng cũng thể hiện một số dấu hiệu: Có nhiều điểm bị
thương tổn mầu nâu, đen trên vỏ kitin, màu đen là của sắc tố melanin, là sản phẩm
cuối cùng của cơ chế hoạt động miễn dịch tự nhiên ở tôm. Ở thời kỳ này tôm bệnh
có thể có, hay không có hiện tượng mềm vỏ và đổi màu đỏ của các phần phụ. Tôm
bệnh ở thời kỳ này vẫn có thể bắt mồi bình thường.
Thời kỳ mãn tính: Những con tôm bị bệnh do cảm nhiễm Taura Syndrome
nhưng sống sót qua thời kỳ cấp tính và thời kỳ chuyển tiếp, thì sẽ bước sang thời kỳ
mãn tính. Thời kỳ này có thể kéo dài cho đến cuối đời của những con tôm bị bệnh.
Tôm bị bệnh ở thời kỳ mãn tính, sau vài lần lột xác, cơ thể trở lại bình thường, các
dấu hiệu bệnh lý ở các thời kỳ trước biến mất, nhưng trong cơ thể tôm vẫn mang
virus gây bệnh cho đến hết cuộc đời. Tuy nhiên, không có các dấu hiệu đặc thù để
có thể dùng làm cơ sở sàng lọc những cá thể mang virus. Nếu các con tôm mang
mầm bệnh thành thục, khi tham gia sinh sản có thể truyền virus gây bệnh Taura cho

Quan sát bằng kính hiển vi thấy vi khuẩn phát sáng di chuyển trong cơ, máu
tôm. Có đốm sáng rất nhỏ và nhiều trên phần cơ thịt của tôm. Tôm chậm lớn, có thể
bị đóng rong ở mang và vỏ. Tôm chết đáy rải rác tuỳ vào mức độ nặng nhẹ của
bệnh. Nếu nhiễm bệnh 100% đàn tôm trong giai đoạn 45 ngày nuôi đầu, có thể chết
hàng loạt. Tôm ấu trùng nhiễm bệnh có màu trắng đục, nhiễm bệnh nạng thì lắng
dưới đáy bể ương và chết hàng loạt.
b.

Hoại tử gan tụy

7


 Nguyên nhân:
Bệnh vi khuẩn hoại tử gan tụy Necrotizing Hepatopancreatitis Peru - NHP gây
ra bởi loài vi khuẩn gây bệnh, cơ thể loại Rickettsia, kích thước tương đối nhỏ, đa
hình thể, gam âm nội bào bắt buộc Phương thức lan truyền bệnh theo phương ngang
qua nguồn nước ao bị ô nhiễm (trong phân) và hoặc cảm nhiễm qua đường miệng
(ăn thịt đồng loại).
 Triệu chứng: Các dấu hiệu lâm sàng về tổng quan có thể cho biết tôm nuôi
nhiễm bệnh NHP: tuyến tiêu hóa (gan tụy) bị suy yếu từ nhợt nhạt đến trắng, quan
sát có các dấu hiệu: lờ đờ, giảm hấp thụ thức ăn, hệ số chuyển đổi thức ăn cao, bỏ
ăn, giảm tăng trưởng rõ, tỉ lệ trọng lượng chiều dài kém (“đuôi mỏng”), gầy mòn,
vỏ mềm, thân nhũn, mang sậm hoặc đen, teo gan tụy. Kiểm tra ở mép ao, tôm bị
nhiễm rỗng ruột và bề mặt nặng mùi do ngoại ký sinh gia tăng và các bệnh viêm
nhiễm cơ hội khác (nghĩa là đốm đen). Bệnh do vi khuẩn liên quan đến vỏ bao gồm
tổn thương loét biểu bì hoặc mòn phần phụ bị đen, và tế bào sắc tố phát triển dẫn
đến xuất hiện rìa đen ở chân đuôi và chân bụng. Gan tụy bị teo và có một số đặc
điểm sau: mềm và ướt, giữa đầy dịch, xanh xám và sọc đen (tế bào ống bị đen). Tỉ
lệ chết tăng dần hơn 90% có thể xảy ra trong vòng 30 ngày khi bắt đầu có dấu hiệu

1.2.2.2 Ô nhiễm từ lớp bùn hình thành
Hầu hết các chất trong nước nuôi tôm lắng đọng dưới đáy tạo thành một lớp
bùn ô nhiễm. Thành phần lớp bùn chủ yếu là các chất hữu cơ như protein, lipid, các
chất khoáng và vitamin, vỏ tôm lột xác,… Lớp bùn này luôn ở trong tình trạng ngập
nước yếm khí làm các vi sinh vật yếm khí phát triển mạnh, phân hủy các hợp chất
trên tạo thành các sản phẩm như H 2S, NH3, CH4… ảnh hưởng đến độ pH của nước
và kìm hãm sự phát triển của tôm.
Hơn nữa tôm luôn có xu hướng tránh khỏi vùng này và tập trung vào những
khu vực sạch sẽ hơn. Do việc tập trung vào một vùng sẽ làm giảm bớt diện tích cho
ăn, cũng như tăng tính cạnh tranh trong khi ăn. Nếu như toàn bộ đáy ao bị dơ bẩn
thì con tôm bị bắt buộc phải sống trong môi trường ô nhiễm. Lớp bùn dơ bẩn còn
tác động lên nước trong ao nuôi làm giảm chất lượng nước.
1.2.2.3 Ô nhiễm từ môi trường tự nhiên

9


Khi mưa xuống nước chảy qua mặt đất đồng thời với dòng chảy đã hòa tan
và cuốn theo nó các chất gây ô nhiễm nhu chất rắn, kim loại nặng, dầu mỡ, phân
bón, thuốc trừ sâu,.. cùng với nước thải sinh hoạt từ các hộ dân cư, bệnh viện… hay
do các sản phẩm của hoạt động sống của sinh vật và kể cả xác chết của chúng đã
gây ảnh hưởng xấu đến chất lượn nước nuôi thủy sản và sức khỏe của vật nuôi.
1.2.2.4 Một số nguyên nhân khác
Dư lượng của các chất kháng sinh, dược phẩm, thuốc trị liệu và kích thích tố
hay vật chất lơ lửng trong ao nuôi nhuyễn thể hay từ lồng bè, kim loại nặng, hóa
chất từ các vùng công nghiệp,… cũng là các nguyên nhân gây ô nhiễm nguồn nước.
1.3 Vai trò của chế phẩm vi sinh trong nuôi trồng thủy sản.
1.3.1 Khái niệm
Chế phẩm vi sinh hay probiotics là hỗn hợp vi sinh vật có lợi cho tôm bằng
cách biến đổi hệ vi sinh vật xung quanh hoặc liên quan đến vật chủ, bằng cách nâng

( Verschuere et al, 2000; Gullian et al, 2003; Tinh et al, 2007 ). Nên nhớ rằng khả
năng gắn kết trên ruột và bề mặt thành ruột là một quá trình rất cần thiết cho vi
khuẩn cư trú trên ruột và chính là giai đoạn đầu của quá trình xâm nhiễm của vi
khuẩn khác ( Verschuere et al, 2000 ). Do đó, việc cạnh tranh vị trí gắn kết có thể
được xem như là một hàng rào đầu tiên của hệ thống phòng chống lại sự xâm nhiễm
của vi khuẩn gây bệnh ( Tinh et al, 2007 ).
1.3.3.2 Sản xuất các chất ức chế
Một quần thể vi sinh vật đều có thể tạo ra cơ chế hóa học có khả năng tiêu
diệt hoặc ức chế các quần thể vi sinh vật khác. Chính sự hiện diện của các vi khuẩn
có khả năng sản xuất ra các chất ức chế trong ruột của vật chủ tạo nên một hàng rào
bảo vệ chống lại các bệnh cơ hội ( Verschuere et al, 2000; Tinh et al, 2007 ).
Các nhân tố ức chế được các vi khuẩn probiotic sản xuất ra bao gồm: kháng
sinh, bacteriocin, siderophone, lysozyme, protease, hydroperoxide, thay đổi giá trị
pH bằng cách tạo ra các acid hữu cơ ( Verschuere et al, 2000 ).
1.3.3.3 Cạnh tranh các nguồn năng lượng
Sự cạnh tranh diễn ra giữa vi sinh vật probiotic và các vi khuẫn gây bệnh chủ
yếu là sự cạnh tranh các ion sắt vì hầu như tất cả các vi sinh vật đều cần sắt để phát
triển ( Verschuere et al, 2000 ). Siderophore là một tác nhân giữ ion sắt chuyên biệt
có trọng lượng phân tử thấp có khả năng phân hủy sắt kết tủa và biến nó thành sắt

11


mà vi sinh vật có thể sử dụng được. Do đó, các chũng vi khuẩn vô hại có thể sản
xuất siderophore được sử dụng như probiotic cạnh tranh với các vi khuẩn gây bệnh
có thể sản xuất siderophore đồng thời cạnh tranh các ion sắt trong môi trường ion
sắt hiện diện hạn chế ( Verschuere et al, 2000; Tinh et al, 2007 ). Hiệu quả của các
vi sinh vật probiotic này làm tăng tính kháng Vibrio đã được kiểm chứng trên ấu
trùng cá bơn ( Verschuere et al, 2000 )
1.3.3.4 Tăng cường sự hấp thu dinh dưỡng

hóa thức ăn tốt hơn. Cuối cùng là tác dụng chữa trị và phòng một số bệnh phổ biến
trên thủy sản.
1.4 Vi khuẩn keo tụ sinh học và vai trò trong nuôi trồng thủy sản
1.4.1 Khái niệm keo tụ sinh học
Keo tụ sinh học (Bioflocculant) là sản phẩm được hình thành trong quá trình
phát triển của vi khuẩn, nấm, tảo (Desouky và cộng sự, 2008). Protein,
polysaccharide, glycoprotein, nucleic acid và một vài đại phân tử khác là thành phần
chính của chất keo tụ sinh học (Lin J và Harichund C, 2012).
1.4.2 Giai đoạn hình thành
Sự keo tụ bao gồm 2 giai đoạn:
 Keo tụ ẩn: bằng mắt thường quan sát vẻ bên ngoài ta không thể nhận biết bất
cứ một biến đổi nào, mặc dù trong thực tế các hạt keo đã chập lại với nhau
tập hợp thành các hạt lớn hơn.
 Keo tụ rõ: là giai đoạn thấy rõ sự biến đổi về màu sắc, ánh quang rồi chuyển
đổi đến trạng thái đục mờ và cuối cùng tạo ra kết tủa.
1.4.1 Vi khuẩn sản xuất keo tụ sinh học
Vi khuẩn sản xuất chất keo tụ sinh học là những loài vi khuẩn có thể sử dụng
chất dinh dưỡng trong môi trường để tổng hợp các hợp chất đa phân tử trong tế bào
dưới sự hoạt động của các enzyme đặc biệt, sau đó chúng có thể được bài tiết ra
ngoài và tồn tại trong môi trường hoặc trên bề mặt vỏ tế bào vi khuẩn, các hợp chất
này có khả năng tạo sự kết tụ với các chất khác nhau và tạo thành một khối nhầy
lắng xuống dưới đáy
Gần đây, chất keo tụ sinh học được ứng dụng nhiều trong việc loại bỏ chất
rắn lơ lửng ở các ngành công nghiệp, sinh hoạt, vật liệu xây dựng, xử lý nước thải

13


chăn nuôi vì hiệu quả cao, ít tốn kém, không độc hại với con người và môi trường.
Sự kết tụ các vật chất này giúp làm giảm các chỉ tiêu như COD và một phần độ đục

 Kaolin (Trung Quốc)
 CaCl2 (Trung Quốc)
 Glycerol (Trung Quốc)
 Peptone (Trung Quốc)
 Yeast extract (Himedia, Ấn Độ)
 Meat extract (Himedia, Ấn Độ)

15