BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ VI KHUẨN
CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI DẦU DIESEL

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: LAI TRUNG TÍN

Niên khóa

: 2009 – 2013

Tháng 6/2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ VI KHUẨN
CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI DẦU DIESEL



i


TÓM TẮT
Dầu mỏ là một trong những nguồn năng lượng chính không thể thay thế, đang dần
bị cạn kiệt bởi nhu cầu sử dụng ngày càng nhiều, kèm theo đó là lượng dầu thất thoát
vô ích ngày càng lớn. Quá trình thất thoát không những buộc con người phải sử dụng
tiết kiệm, mà còn đe dọa đến chất lượng cuộc sống của con người do gây ô nhiễm môi
trường, ảnh hưởng trực tiếp đến sự sống của mọi sinh vật trên Trái Đất.
Tuy không thể hạn chế nhu cầu sử dụng dầu của con người, nhưng nhằm góp phần
giải quyết vấn nạn ô nhiễm môi trường do dầu tràn, đề tài: “Phân lập và tuyển chọn
một số vi khuẩn có khả năng phân giải dầu diesel” được thực hiện. Đề tài sử dụng các
phương pháp thu thập mẫu, phân lập và làm thuần, nhuộm Gram và thử nghiệm sinh
hóa, định danh bằng kỹ thuật giải trình tự gene và tiến hành bố trí thí nghiệm phân giải
dầu để kiểm tra hoạt tính phân giải của các vi khuẩn thu thập được.
Với những phương pháp trên, 17 dòng vi khuẩn Gram âm khác nhau đã được phân
lập trong 12 mẫu đất và nước, trong đó, có 3 mẫu cho kết quả phân giải tốt nhất là 2 mẫu
đất tại 2 trạm xăng dầu tại Đà Nẵng và quận Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh, 1 mẫu
nước sông Sài Gòn, quận Bình Thạnh. Dòng vi khuẩn Enterobacter gergoviae trong
mẫu đất tại Đà Nẵng (ĐĐA) cho kết quả phân giải dầu nhanh nhất sau 5 ngày ở tỷ lệ
dịch khuẩn và dầu là 50 µl và 10 µl. Các hydrocarbon thơm, mạch vòng được các vi
khuẩn Enterobacter gergoviae và Stenotrophomonas maltophilia sử dụng triệt để.

ii


SUMMARY
Oil is one of the sources of main energy cannot be replaced, which is gradually
exhausted by the high demands and the useless losses. The oil loss is not only forced

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU .................................................................................................. 1
1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................................. 1
1.2 Yêu cầu ...................................................................................................................... 2
1.3 Nội dung thực hiện .................................................................................................... 2
CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3
2.1 Tổng quan về dầu ...................................................................................................... 3
2.1.1 Dầu – nguồn năng lượng không thể thay thế.......................................................... 3
2.1.1.1 Thành phần hóa học............................................................................................. 3
2.1.1.2 Vai trò của dầu..................................................................................................... 8
2.1.2 Hiện tượng tràn dầu, các nguyên nhân chính ......................................................... 8
2.1.2.1 Khái niệm tràn dầu .............................................................................................. 8
2.1.2.2 Các nguyên nhân chính ....................................................................................... 8
2.1.3 Một số vụ tràn dầu điển hình .................................................................................. 9
2.1.3.1 Trên thế giới ........................................................................................................ 9
2.1.3.2 Ở Việt Nam.......................................................................................................... 9
2.1.4 Ảnh hưởng của hiện tượng tràn dầu ..................................................................... 10
2.1.4.1 Đối với kinh tế ................................................................................................... 10
2.1.4.2 Đối với môi trường ............................................................................................ 10
2.1.4.3 Đối với sức khỏe con người .............................................................................. 10
2.1.5 Biện pháp khắc phục tràn dầu .............................................................................. 10
2.1.5.1 Biện pháp cơ học ............................................................................................... 10
2.1.5.2 Biện pháp hóa học ............................................................................................. 10
iv


2.1.5.3 Biện pháp sinh học ............................................................................................ 11
2.2 Sự phân giải dầu của vi khuẩn ................................................................................. 12
2.2.1 Cơ chế của sự phân giải ........................................................................................ 12
2.2.2 Các vi khuẩn có khả năng phân giải dầu .............................................................. 14
2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng sự phân giải dầu................................................................ 15

4.4 Thí nghiệm hoạt tính phân giải ................................................................................ 40
4.5 Giải trình tự gene ..................................................................................................... 46
CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................... 48
5.1 Kết luận.................................................................................................................... 48
5.2 Đề nghị .................................................................................................................... 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 49
PHỤ LỤC

vi


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CFU

: Colony Forming Unit

ctv

: cộng tác viên

ĐC

: đối chứng

g/l

: gam/lít

LDC


vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Nhiệt độ sôi và nhiệt độ kết tinh của các N – parafine .................................... 4
Bảng 2.2 Tỷ lệ các nguồn gây tràn dầu ........................................................................... 8
Bảng 2.3 Một số vụ tràn dầu trên thế giới ...................................................................... 9
Bảng 2.4 Thống kê lượng dầu tràn ở Việt Nam .............................................................. 9
Bảng 2.5 Một số vi khuẩn có khả năng phân giải dầu .................................................. 14
Bảng 3.1 Kí hiệu mẫu, nơi lấy mẫu .............................................................................. 16
Bảng 3.2 Hướng dẫn đọc kết quả trong bộ thử nghiệm sinh hóa IDS14 GNR ............ 21
Bảng 4.1 Tổng số vi khuẩn trên môi trường Sodium Benzoat ..................................... 24
Bảng 4.2 Tổng số vi khuẩn trên môi trường Acetamide ............................................... 26
Bảng 4.3 Đặc điểm khuẩn lạc mọc trên môi trường Sodium Benzoat.......................... 28
Bảng 4.4 Đặc điểm khuẩn lạc mọc trên môi trường Acetamide ................................... 28
Bảng 4.5 Thử nghiệm sinh hóa các vi khuẩn trên môi trường Sodium Benzoat ......... 34
Bảng 4.6 Thử nghiệm sinh hóa các vi khuẩn trên môi trường Acetamide ................... 35
Bảng 4.7 Kết quả định danh vi khuẩn của kit sinh hóa................................................. 37
Bảng 4.8 Chỉ số OD của dịch khuẩn trong môi trường có và không có dầu ................ 38
Bảng 4.9 Kết quả ghi nhận sự đồng nhất giữa dịch khuẩn và dầu theo thời gian......... 43
Bảng 4.10 Thành phần dầu trước và sau có vi khuẩn phân giải ................................... 45
Bảng 4.11 So sánh kết quả định danh bằng giải trình tự và thử nghiệm sinh hóa ........ 46

viii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Cơ chế hoạt động của chất phân tán .............................................................. 11

tràn dầu, không những làm lãng phí nguồn năng lượng không thể thay thế này, mà còn
ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi trường, đặc biệt là môi trường sinh thái biển.
Tràn dầu do nhiều nguyên nhân như: rò rỉ mỏ dầu tự nhiên do các tác động ngoại
cảnh, mà chủ yếu là do động đất, dịch chuyển các khối địa chất dưới lòng đại dương, rỏ
rỉ tại các giàn khoang khai thác dầu, tai nạn khi vận chuyển dầu, rơi vãi dầu khi sử dụng.
Có nhiều biện pháp xử lý tràn dầu như dùng phao ngăn dầu chuyên dùng, tre nứa để vây
dầu, chống lan rộng đồng thời dùng các thiết bị chuyên dụng hút dầu, hiện đại hơn,
người ta dùng vệ tinh định vị dầu loang, hướng gió để xác định dầu tràn và áp dụng các
biện pháp thu gom dầu, hoặc cũng có thể các chất phân tán dầu ngăn chặn lan tràn khắp
nơi. Ngoài ra một biện pháp khác, đó là áp dụng các kỹ thuật công nghệ sinh học để xử
lý hiện tượng tràn dầu.
Thế kỷ XXI là kỷ nguyên của phát triển công nghệ sinh học giải quyết các vấn đề
liên quan đến lương thực – an ninh lương thực, nâng cao sức khỏe con người, thú nuôi,
cũng như bảo vệ, phòng chống, xử lý ô nhiễm môi trường. Hiện tượng tràn dầu là một
vấn nạn lâu dài và mang tính chất thất thường, nên các biện pháp xử lý hậu quả cần được
tối ưu hóa, góp phần giảm chi phí đầu tư, nguồn nhân lực, công sức và thời gian. Trong
tự nhiên, vi khuẩn là nhóm sinh vật có điều kiện sống đa dạng nhất, chúng có mặt ở khắp
nơi, kể cả trong dầu, chúng phân giải dầu làm cơ chất chuyển hóa năng lượng cho bản
thân.Áp dụng những kiến thức liên quan đến vi khuẩncó thể nuôi cấy, phân lập, định
danh và nhân số lượng các chủng vi khuẩn có thể tồn tại trong dầu, để giải quyết vấn đề
tràn dầu. Vì vậy, đề tài “Phân lập, tuyển chọn một sốvi khuẩn có khả năng phân giải
dầu” được thực hiện.

1


1.2 Yêu cầu
Thu thập, phân lập và chọn lọc các vi khuẩn tồn tại trong mẫu đất và nước tại những
nơi có dầu tràn.
Nhuộm Gram xác định hình thái và khảo sát một số phản ứng sinh hóa, nhằm định

Nhiệt độ sôi và nhiệt độ kết tinh của các N – parafine được trình bày trong bảng 2.1
Iso – parafine
Các iso – parafine trong dầu mỏ có cấu trúc đơn giản, mạch chính dài, mạch phụ ít
và ngắn. Các nhánh phụ thường là gốc methyl, với các iso – parafine 1 nhánh phụ thì
thường dính vào Carbon thứ 2 hoặc thứ 3, đối với các iso parafine 2, 3 nhánh phụ thì xu
hướng tạo ra Carbon bậc 3 nhiều hơn bậc 4, nếu có nhiều hơn 3 nhánh phụ, thì các
nhánh phụ này nằm cách nhau 3 nguyên tử Carbon.
o Các hợp chất naphthene
Naphthene là hợp chất vòng no, phổ biến trong dầu mỏ, hàm lượng 30% - 60%,
naphtene dầu mỏ có 3 dạng chính:
Loại vòng 5 cạnh

3


Loại vòng 6 cạnh

Loại nhiều vòng ngưng tụ hoặc qua cầu nối

Nhiệt độ sôi của dầu mỏ phụ thuộc nhiều vào số nhánh phụ của naphthene.
Bảng 2.1 Nhiệt độ sôi và nhiệt độ kết tinh của các N - parafine
N – parafine

Công thức

Nhiệt độ sôi (0C)

Nhiệt độ kết tinh (0C)

Hexadecan


Eicosan

C20H42

345,3

36,7

Heneicosan

C21H44

355,1

40,5

Docosan

C22H46

367

44,4

Tricosan

C23H48

378,3


419,4

59

Octacosan

C28H58

428,7

61,4

Nonacosan

C29H60

437,7

63,7

Triacotan

C30H62

443,4

65,8

(Đinh Thị Ngọ và Nguyễn Khánh Diệu Hồng, 2010)

biến chất càng thấp thì Hydrocarbon lai hợp càng nhiều.
Tetraline và indan là 2 loại lai hợp đơn giản nhất, gồm 1 vòng thơm và 1 vòng
naphtene kết hợp.

Những Hydrocarbon lai hợp phức tạp hơn (một vòng thơm ngưng tụ với hai vòng
naphtene trở lên) số lượng ít trong dầu, trong những cấu trúc như vậy, nhánh phụ gắn

5


vào vòng thơm thường là nhóm methyl, nhánh phụ gắn vào vòng naphthene thường là
mạch thẳng dài.
 Các hợp chất phi Hydrocarbon
Theo Đinh Thị Ngọ và Nguyễn Khánh Diệu Hồng (2010), các hợp chất phi
Hydrocarbon là các hợp chất mà trong cấu trúc ngoài Carbon và Hydro còn có lưu
huỳnh, nitơ và oxy. Trong dầu non, độ biến chất thấp, hàm lượng các phi Hydrocarbon
cao hơn so với dầu già, độ biến chất cao.
o Các hợp chất của lưu huỳnh trong dầu mỏ
Các hợp chất chứa lưu huỳnh phố biến nhất trong dầu mỏ, những loại dầu ít lưu
huỳnh thường có hàm lượng lưu huỳnh không quá 0,3% - 0,5%, những loại dầu nhiều
lưu huỳnh thường có hàm lượng lưu huỳnh từ 1% - 2% trở lên.
Hiện nay, trong dầu mỏ có khoảng 250 loại hợp chất lưu huỳnh, gồm các họ:
Lưu huỳnh dạng mercaptane có mặt trong phần nhẹ của dầu mỏ (dưới 2000C), ở
nhiệt độ khoảng 3000C dễ bị phân hủy thành H2S và các sulphur, nhiệt độ cao hơn nữa,
chúng bị phân hủy thành H2S và Hydrocarbon không no, tương ứng với gốc hydrocarbon
của nó.
Loại lưu huỳnh dạng sulphur có thể chia thành: các sulphur nằm trong cấu trúc vòng
no (thiophane) hoặc không no (thiophene) với các gốc Hydrocarbon thơm naphtene,
trong đó, sulphur vòng no là dạng chủ yếu trong phân đoạn có nhiệt độ sôi trung bình.
Những sulphur có gốc Hydrocarbon chứa 1, 2, nhiều vòng hay loại lai hợp với naphlene

o Chất nhựa và asphaltene
Các chất nhựa và asphaltene trong dầu mỏ là những hợp chất mà trong cấu trúc
ngoài Carbon và Hydro còn có đồng thời lưu huỳnh, oxy và nitơ, các hợp chất này có
trọng lượng phân tử rất lớn, nên có mặt ở các phân đoạn có nhiệt độ sôi cao và cặn dầu.
o Nước lẫn trong dầu
Nước trong dầu sau khi tách sơ bộ phần còn lại là nhũ tương, là loại kỵ nước, luôn
có mặt trong các hợp chất có cực, các acid, các chất nhựa, asphaltene, những chất chỉ tan
trong dầu, không tan trong nước (Đinh Thị Ngọ và Nguyễn Khánh Diệu Hồng, 2010).

7


2.1.1.2Vai trò của dầu
Dầu mỏ là nguồn cung cấp năng lượng chủ yếu của mọi quốc gia, là nguồn nguyên,
nhiên liệu cho các ngành công nghiệp như: sản xuất cao su, sợi tổng hợp, chất dẻo, các
chất hoạt động bề mặt, các chất trung gian, phân bón… Ngoài ra còn một số tác dụng
phi năng lượng như dầu nhờn, mỡ, nhựa đường…
Vai trò của dầu mỏ đối với cuộc sống rất quan trọng, cũng vì vậy dầu mỏ ảnh hưởng
trực tiếp đến tình hình kinh tế, chính trị, xã hội của các quốc gia trên thế giới, đặc biệt là
các quốc gia sở hữu các mỏ dầu, trong đó có Việt Nam.
2.1.2 Hiện tượng tràn dầu, các nguyên nhân chính
2.1.2.1 Khái niệm tràn dầu
Tràn dầu là hiện tượng giải phóng Hydrocarbon dầu mỏ dạng lỏng khỏi các nơi
chứa dầu thiên nhiên cũng như các nơi chứa dầu nhân tạo ra ngoài môi trường, chủ yếu
là môi trường nước (thông tư 2262/TT-MTG của bộ Khoa học công nghệ và môi trường
ngày 29/12/1995).
2.1.2.2 Các nguyên nhân chính
Bảng 2.2 Tỷ lệ các nguồn gây tràn dầu
Nguồn gốc


này cho thấy, cuộc sống sinh hoạt và kinh doanh của con người tác động tiêu cực đến
thiên nhiên, bên cạnh đó còn có những rò rỉ nội sinh như động đất, dịch chuyển các khối
địa chất,…

8


2.1.3 Một số vụ tràn dầu điển hình
2.1.3.1 Trên thế giới
Bảng 2.3 Một số vụ tràn dầu trên thế giới
Tràn/bể chứa

Vị trí

Thời gian

Tấn dầu thô

Vịnh War

Vịnh Ba tư

21/1/1991

136.000 – 1.500.000

Giếng Ixtoc I

Vịnh Mexico


1991

260.000

Castillo de

Vịnh Saldanha, Nam

Belver

Phi

6/8/1983

252.000

Amoco Cadiz

Brittany, Pháp

16/3/1978

223.000

Amoco Haven

Địa Trung Hải

1991


200

270

550

Đất liền

4040

5300

7500

Sự cố hàng hải

500

500

1500

Tàu chở dầu

2300

3500

7500


Dầu tràn thấm vào đất ảnh hưởng đến quá trình nảy mầm, làm chậm tiến độ sinh
trưởng và phát triển bình thường của cây. Tác động xấu đến hệ sinh thái, đặc biệt là hệ
sinh thái môi trường nước bao gồm biển và sông ngòi, các váng dầu trên mặt nước tạo
lớp ngăn cách, hạn chế lượng oxy khuếch tán, tăng độ nhớt làm các sinh vật nước chết,
ảnh hưởng đến chuỗi thức ăn trong hệ sinh thái biển, các loài chim bị dầu thấm vào lông
làm giảm tác dụng giữ nhiệt và nổi trên mặt nước, khó di chuyển, ảnh hưởng đến khả
năng nở của trứng chim.
2.1.4.3 Đối với sức khỏe con người
Dầu tràn thấm vào đất, đi vào mạch nước ngầm, ảnh hưởng đến sức khỏe con người,
ảnh hưởng gián tiếp qua lượng thức ăn từ biển, làm tăng nguy cơ ung thư và các bệnh
liên quan đến tim mạch.
2.1.5 Biện pháp khắc phục tràn dầu
2.1.5.1 Biện pháp cơ học
Theo Peter (1995), dùng phao ngăn dầu chuyên dụng, tre nứa che chắn, vây dầu,
tránh dầu lan rộng, sau đó tiến hành bơm, hút thủ công, và chứa trong các phương tiện
đơn giản.
Một cách khác, dùng rơm rạ thả xuống nơi có dầu để hút bớt dầu, sau đó vớt lên đất
liền xử lý. Trường hợp khi xảy ra các vụ đâm tàu, vỡ kho chứa, trước tiên cần xử lý
lượng dầu chưa tràn, đưa về dự trữ ở nơi an toàn, sau đó tiếp tục xử lý dầu tràn.
2.1.5.2 Biện pháp hóa học
Để giải quyết tràn dầu, có thể dùng các chất phân tán, các chất phá nhũ tương hóa
dầu – nước, các chất keo tụ và hấp phụ dầu…

10


Chất phân tán là các chất hoạt động bề mặt, bao gồm hydrophilic (phần ưa nước) và
oleophilic (phần ưa dầu), có tác dụng như một chất tẩy rửa, làm giảm lực căng phân giới
giữa dầu và nước tạo điều kiện dễ phân tán và phân hủy dầu.


(Pseudomonas

putia;

Pseudomonas

aeruginosa); Serratia marcescens; Stenotrophomonas maltophilia.
Xạ khuẩn: Streptomyces sp.; Actinomyces sp.
Nấm:Aspergillus sp.; Fusarium sp.; Penicillium sp.; Rhodosporidium sp.;
Saccharomyces sp.; Torulopsis sp.; Trichoderma sp.
Một chế phẩm vi sinh vật được sử dụng hiện nay là: Enretech – 1 (Peter, 1995).
2.2 Sự phân giải dầu của vi khuẩn
2.2.1 Cơ chế phân giải

Hình 2.3 Quá trình phân giải n – alkane của vi khuẩn
(http://www.metamicrobe.com/petroleum-microbiology/)

o Sự suy thoái các hợp chất thơm
Sự suy thoái các hợp chất chứa một hay nhiều vòng thơm của vi khuẩn được chia
làm ba bước: chuyển đổi vòng thơm thành các hợp chất trung gian và loại bỏ các nhóm
thế, sau đó oxy hóa vòng bằng enzyme dioxygenase (bao gồm phân vòng oxygenolytic
của các hợp chất thơm như: catechol, protocatechuate, gentisate), cuối cùng là sự phân
hạch vòng không theo chu kỳ dần đến nhân trung tâm.
12


o Sự suy thoái các hydrocarbon chuỗi dài
Các hydrocarbon chuỗi dài C10 – C18 thường được sử dụng nhanh hơn các hợp chất
thơm, sự xuống cấp n – alkane nhờ sự kích hoạt oxy phân tử kết hợp cùng với enzyme
oxygenase theo ba cách:

Sử dụng polycyclic hydrocarbon (PAH)

Rhodococcus

Sử dụng polycyclic hydrocarbon (PAH)

Actinobacteria
Nocardioidaceae

Bacteroidetes

Flavobacteria
Rhodobacteriaceae
Alcaligenaceae
Comamonadaceae

Proteobacteria

Flavobaterium
Yeosuana

Đặc điểm phân giải
Arthrobacter spp. làm suy giảm các hydrocarbon thơm khác nhau

Sử dụng hydrocarbon thơm đa vòng và heterocyclic.
Y. aromativorans GW1 – 1T làm giảm nồng độ benzylpyrene

Paracoccus

Sử dụng hydrocarbon mạch thẳng


Alcanivorax

Xanthomonadaceae

Rhodanobacter

Sống trong nước biển, phân hủy các alkane và dẫn xuất của alkane
Rhodanobacter spp. sử dụng benzylpyrene

Stenotrophomonas S. maltophilia sử dụng PAH

(http://www.metamicrobe.com/petroleum-microbiology)

14