BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA
VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI PHÂN LẬP TỪ THỊT HEO
Ở TP. HỒ CHÍ MINH

Họ và tên sinh viên : NGUYỄN DUY THIÊN
Ngành

: Thú Y

Niên khóa

: 2004 – 2009

Lớp

: DH04TY

Tháng 09/2009


ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA
VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI PHÂN LẬP TỪ THỊT HEO
Ở TP. HỒ CHÍ MINH

Tác giả

NGUYỄN DUY THIÊN

bạn trong phòng thí nghiệm đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua để tôi hoàn
thành tốt đề tài tốt nghiệp này.
Cảm ơn tất cả các bạn bè trong và ngoài lớp đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn
trong thời gian qua cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ trong lúc tôi thực tập tốt nghiệp.

ii


TÓM TẮT LUẬN VĂN
Qua thời gian thực hiện đề tài “Đề kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli phân
lập từ thịt heo ở Tp Hồ Chí Minh” tại Chi cục Thú y Tp Hồ Chí Minh và phòng Thí
nghiệm Kiểm Nghiệm Thú Sản và Môi Trường Sức Khỏe Vật Nuôi trường Đại học
Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh từ tháng 3 năm 2009 đến tháng 6 năm 2009, chúng tôi thu
được kết quả như sau:
Từ 110 chủng vi khuẩn lấy từ Chi cục Thú y Tp Hồ Chí Minh chúng tôi đã tiến
hành kiểm tra và định danh E. coli tại phòng thí nghiệm Kiểm Nghiệm Thú Sản và
Môi Trường Sức Khỏe Vật Nuôi. Kết quả thu được 85 chủng có khuẩn lạc điển hình
trên môi trường EMB và sinh hóa phù hợp với đặc tính của E. coli (chiếm 77,27%).
Dùng phương pháp khuếch tán trên thạch, chúng tôi kiểm tra tính nhạy cảm với
12 loại kháng sinh của 85 chủng E. coli. Qua kết quả kháng sinh đồ cho thấy rằng
những kháng sinh còn nhạy cảm với E. coli là ceftazidime (96,47%), norfloxacin
(91,76%), amoxicillin/acid clavulanic (90,59%) và gentamicin (80%).
Những kháng sinh đề kháng với hơn 1/3 số chủng E. coli là tetracycline
(85,88%),

sulfamethoxazole/trimethoprim

(67,71%),

ampicillin

2.3.1. Khái niệm và phân loại..........................................................................................7
2.3.2. Một số kháng sinh cấm và hạn chế sử dụng trong thú y .......................................8
2.3.3. Đề kháng................................................................................................................9
2.3.4. Cơ chế tác động của kháng sinh và cơ chế đề kháng của vi khuẩn với kháng sinh
.......................................................................................................................................10
2.3.4.1. Cơ chế tác động của các kháng sinh nhóm β-lactam và cơ chế đề kháng của vi
khuẩn với nhóm β-lactam ..............................................................................................10
2.3.4.2. Cơ chế tác động của các kháng sinh nhóm aminoglycoside và cơ chế đề kháng
của vi khuẩn với nhóm aminoglycoside ........................................................................11
2.3.4.3. Cơ chế tác động của các kháng sinh nhóm phenicol và cơ chế đề kháng của vi
khuẩn với nhóm phenicol ..............................................................................................12
2.3.4.4. Cơ chế tác động của các kháng sinh nhóm polypeptide và cơ chế đề kháng của
vi khuẩn đối với nhóm polypeptide...............................................................................12

iv


2.3.4.5. Cơ chế tác động của các kháng sinh nhóm tetracycline và cơ chế đề kháng của
vi khuẩn đối với nhóm tetracycline ...............................................................................13
2.3.4.6. Cơ chế tác động của các kháng sinh nhóm quinolone và cơ chế đề kháng của
vi khuẩn đối với nhóm quinolone..................................................................................13
2.3.4.7. Cơ chế tác động của các kháng sinh nhóm sulfonamide và diaminopyrimidine;
cơ chế đề kháng của vi khuẩn đối với nhóm sulfonamide và diaminopyrimidine........14
2.4. KHÁNG SINH ĐỒ.................................................................................................14
2.5. LƯỢC DUYỆT MỘT SỐ CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU VỀ SỰ MẪN CẢM
VỚI KHÁNG SINH CỦA E. COLI. .............................................................................18
2.5.1. Một số công trình nghiên cứu trong nước ...........................................................18
2.5.1.1. Trên gia súc ......................................................................................................18
2.5.1.2. Trên người ........................................................................................................21
2.5.2. Một số công trình nghiên cứu nước ngoài...........................................................22

I. Tài liệu trong nước .....................................................................................................39
II. Tài liệu nước ngoài ...................................................................................................42
PHỤ LỤC ......................................................................................................................43

vi


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Các kháng sinh cấm sử dụng trong thú y ................................................... 8
Bảng 2.2.Các kháng sinh hạn chế sử dụng trong thú y .............................................. 9
Bảng 2.3. Bảng đánh giá đường kính vòng vô khuẩn chuẩn (Quinn và ctv, 1998). 17
Bảng 4.1: Kết quả phân lập E. coli trên một số môi trường sinh hóa ...................... 28
Bảng 4.2: Mức độ mẫn cảm của E. coli với từng loại kháng sinh thử nghiệm ....... 31

vii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1. E. coli dưới kính hiển vi quang học............................................................ 4
Hình 2.2. E. coli dưới kính hiển vi điện tử ................................................................. 4
Hình 3.1. 12 loại kháng sinh được đặt trên 2 đĩa petri chứa môi trường MHA ....... 26
Hình 4.1. Khuẩn lạc E. coli đặc trưng trên môi trường EMB ................................. 28
Hình 4.2. Khuẩn lạc E. coli trên môi trường Rapid’E. coli ...................................... 29
Hình 4.3. Khuẩn lạc E. coli mọc trên môi trường thạch NA sau 370C/ 24h ............ 30
Hình 4.4. Kết quả thử IMViC của khuẩn E. coli trên từng loại môi trường ............ 30
Hình 4.5. Vòng vô khuẩn của 12 loại kháng sinh trên 2 đĩa petri sau 24h/370C ..... 32

viii



đến sự đề kháng kháng sinh của các vi khuẩn, trong đó có E. coli. Vì vậy, hiểu biết về
mức độ mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn E. coli vấy nhiễm trong thịt
heo sẽ góp phần định hướng việc dùng kháng sinh cho người chăn nuôi và là một
thông tin hữu ích cho các cơ quan quản lí thực phẩm cũng như người tiêu dùng nhằm
hạn chế việc lan truyền các chủng E. coli kháng thuốc cho cộng đồng.

1


Xuất phát từ những vấn đề trên, được sự đồng ý của Khoa Chăn nuôi Thú Y, Bộ
môn Nội Dược, với sự hướng dẫn của TS. Võ Thị Trà An và BSTY. Nguyễn Thanh
Tùng, chúng tôi thực hiện đề tài “Đề kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli phân lập
từ thịt heo ở Tp Hồ Chí Minh”.
1.2. MỤC ĐÍCH
Tìm hiểu mức mẫn cảm của vi khuẩn E. coli đã được Chi cục Thú y Tp Hồ Chí
Minh phân lập từ thịt heo đối với một số kháng sinh thường dùng, để từ đó góp phần
cho công tác phòng, chống bệnh và hạn chế lan tràn đề kháng kháng sinh.
1.3. YÊU CẦU
Kiểm tra và định danh các chủng E. coli mà Chi cục Thú y Tp Hồ chí Minh đã
phân lập được từ thịt heo trên địa bàn Tp Hồ Chí Minh.
Thử kháng sinh đồ các chủng E. coli thu thập được đối với một số kháng sinh.

2


Chương 2
CƠ SỞ LÝ LUẬN KHOA HỌC
2.1. TỔNG QUAN VỀ E. COLI
2.1.1. Hệ thống phân loại
Vi khuẩn E. coli được phân loại như sau:

penicillin G và penicillin V), nhóm aminoside, nhóm polypeptide (colistin), nhóm
tetracycline, nhóm sulfonamide, nhóm quinolone và nhóm phenicol (Nguyễn Như Pho,
2001). E. coli bị tiêu diệt bởi kháng sinh khi chúng còn nhạy cảm với kháng sinh đó.
Vì vậy, để điều trị có hiệu quả, người chăn nuôi nên làm kháng sinh đồ để biết E. coli
có nhạy cảm với kháng sinh đó hay không.

4


2.1.3. Nuôi cấy phân lập vi khuẩn E.coli
E. coli là vi khuẩn hiếu khí hoặc hiếu khí tùy nghi. Chúng có thể sinh trưởng ở
nhiệt độ 15 - 40oC, nhưng nhiệt độ thích hợp nhất là 37oC, pH từ 6,4 - 7,4. Mọc tốt
trên môi trường thạch dinh dưỡng, sau 24 giờ cho khuẩn lạc tròn, ướt, trắng đục,
đường kính khoảng 2 - 3 mm. Để lâu vi khuẩn tự thay thế khóm S bằng khóm R, khô
dẹt, rìa hơi nhăn. E. coli không gây tan chảy trên thạch gelatin. Trên thạch máu có
chủng E. coli gây dung huyết, có chủng không. Trong canh dinh dưỡng chúng tạo vẩn
đục đều sau lắng cặn, mùi phân thối, một số tạo váng mỏng.
Các môi trường có thể dùng để chẩn đoán phân biệt E. coli bao gồm: môi
trường EMB (Eosin Methylen Blue) tạo khuẩn lạc màu tím ánh kim; môi trường MCK
(Mac Conkey) cho khuẩn lạc đỏ hồng; môi trường BGA tạo khuẩn lạc màu vàng; môi
trường TSI (hoặc KIA) thì cho acid/acid (vàng/vàng); trên môi trường Rabit’ E. coli
cho khuẩn lạc màu tím hoặc đỏ hồng.
2.1.4. Cấu trúc kháng nguyên
E. coli có cấu trúc kháng nguyên gồm kháng nguyên thân O, kháng nguyên
lông H, kháng nguyên capsule K và kháng nguyên lông bám (pili) F (Tô Minh Châu,
Trần Thị Bích Liên, 1999).
Chúng có khoảng trên 160 loại kháng nguyên thân O, là kháng nguyên chịu
nhiệt. Cấu tạo gồm hỗn hợp lipid, polisaccharide và protein. Lipid xác định độc tính
colitoxin, polysaccharide xác định tính đặc thù của huyết thanh và protein mang tính
chất kháng nguyên. Kháng nguyên O được chia làm 4 nhóm lớn gồm OI, OII, OIII,

nguyên yếu.
Ngoài ra, E. coli còn tiết ra một số độc tố khác như độc tố thần kinh (verotoxin
hay vasotoxin) có tính chất kháng nguyên. Đây là độc tố gây bệnh phù.
2.2. PHÂN LOẠI E. COLI
Các chủng E. coli ở người được chia thành 6 nhóm khác nhau:
(Enterotoxingenic E. coli: E. coli sinh độc tố ruột),
E. coli gây bệnh đường ruột),
huyết đường ruột),

ETEC

EPEC (Enteropathogenic E. coli:

EHEC (Enterohaemorrhagic E. coli: E. coli gây xuất

EAEC (Enteroaggregative E. coli: E. coli kết tập ở ruột),

(Enteroinvasive E. coli: E. coli xâm lấn niêm mạc ruột),

EIEC

DAEC (“Diffuse-

Adhering” E. coli). Ở gia súc các chủng E. coli gây bệnh được xếp vào 4 nhóm:
ETEC, EPEC, EHEC và AEEC (Attaching and Effacing E. coli: E. coli kết dính và
phá hủy tế bào thượng bì ruột). Đối với các chủng E. coli gây bệnh trên heo, người ta
chỉ phát hiện được các chủng tương tự như ETEC, EHEC và AEEC (Nguyễn Ngọc
Hải, 1999).
6



gồm

sulfadiazine,

sulfadimerazine,

sulfadimidine,

sulfapyridine…
Nhóm macrolide gồm spiramycin, tylosin, erythromycin, tiamulin...

7


Nhóm quinolone gồm oxolinic, flumequin, norfloxacin, enrofloxacin, acid
nalidixic…
Nhóm polypeptide gồm colistin, polymyxin, bacitracin…
Nhóm nitro-imidazoles gồm dimetridazol, ronidazol…
Nhóm nitrofuranes gồm furaltadone, furazolidone…
2.3.2. Một số kháng sinh cấm và hạn chế sử dụng trong thú y
Theo qui định mới nhất của Bộ NN&PT Nông thôn Việt Nam, nhiều kháng sinh
thuộc các họ khác nhau đã bị cấm sử dụng hoặc hạn chế sử dụng trong chăn nuôi thú
y. Chi tiết được liệt kê trong Bảng 2.1 và Bảng 2.2.
Bảng 2.1. Các kháng sinh cấm sử dụng trong thú y
TT
1
2

Tên hoá chất, kháng sinh

Ciprofloxacin

8

Ofloxacin

9

Carbadox

10

Olaquidox

11

Bacitracin Zn

12

Tylosin phosphate

(Nguồn: Thông tư số 15/2009/TT-BNN, Bộ NN&PT NT, 17 tháng 3 năm 2009)
8


Bảng 2.2. Các kháng sinh hạn chế sử dụng trong thú y
TT

Tên thuốc, hoá chất, kháng sinh


Amprolium/ethopate

9

Nicarbazin

10

Flavophospholipol

11

Salinomycin

12

Avilamycin, Monensin

(Nguồn: Thông tư số 15/2009/TT-BNN, Bộ NN&PT NT, 17 tháng 3 năm 2009)
2.3.3. Đề kháng
Sự đề kháng với kháng sinh được phân loại gồm đề kháng tự nhiên và đề kháng
thu được.
Đề kháng tự nhiên là hiện tượng một số vi khuẩn luôn luôn không chịu sự tác
động của một số kháng sinh. Ví dụ như trực khuẩn mủ xanh Pseudomonas aeruginosa
kháng với penicillin G, tụ cầu vàng Staphylococcus aureus không chịu tác dụng của
colistin. Một số vi khuẩn không có vách như Mycoplasma không chịu tác dụng của
kháng sinh ức chế quá trình tổng hợp vách tế bào như penicillin, cephalosporin,
vancomycin. E. coli đề kháng tự nhiên với các kháng sinh lincosamide, imidazole và
các kháng sinh thuộc nhóm macrolide.

2.3.4.1. Cơ chế tác động của các kháng sinh nhóm β-lactam và cơ chế đề kháng
của vi khuẩn với nhóm β-lactam (Võ Thị Trà An, 2007)
Các penicillin ức chế sự tổng hợp thành tế bào vi khuẩn bằng cách can thiệp
vào các enzyme transpeptidase (transpeptidase có vai trò trong sự tạo các liên kết của
chuỗi peptidoglycan). Các enzyme này liên kết với một nhóm protein gọi là PBP
(penicillin – binding protein) nằm ở ngoài màng nguyên sinh chất. Vì vậy, điểm tác
động của các kháng sinh nhóm β-lactam là PBP. Mức độ mẫn cảm của vi khuẩn với
10


một kháng sinh trong nhóm này tùy thuộc vào mức độ gắn kết với PBP, khả năng xâm
nhập vào tế bào (pH môi trường hơi acid gia tăng khả năng này) và khả năng kháng
các enzyme β-lactamase. Ngoài ra, β-lactam không chỉ ức chế những kết nối cuối
cùng của peptidoglycan trong tổng hợp thành tế bào vi khuẩn mà còn gây tiết
lipoteichoic acid tạo phản ứng tự ly giải hay tự sát của vi khuẩn do hư hại
peptidoglycan. Mặc dù cho tới nay cơ chế tác động của penicillin chưa hoàn toàn được
làm sáng tỏ, nhưng người ta biết rằng các penicillin khác nhau sẽ tác động lên các
enzyme khác nhau của quá trình tổng hợp thành tế bào. Điều này giải thích một phần
lý do tại sao một số penicillin có tác dụng kháng khuẩn đến một số nhóm vi khuẩn
trong khi một số penicillin khác thì không hoặc ít có khả năng này. Các loài vi khuẩn
khác nhau có các PBP khác nhau và khả năng gắn kết giữa các penicillin với các PBP
cũng khác nhau (Võ Thị Trà An, 2007).
Sự đề kháng với các kháng sinh của nhóm β-lactam chủ yếu là do sự hiện diện
của enzyme β-lactamase làm hư hỏng vòng lactam hoặc sự hiện diện của các enzyme
thay thế nhóm PBP của vi khuẩn mà penicillin không gắn kết được.
2.3.4.2. Cơ chế tác động của các kháng sinh nhóm aminoglycoside và cơ chế đề
kháng của vi khuẩn với nhóm aminoglycoside (Võ Thị Trà An, 2007)
Muốn tác động đến vi khuẩn, trước hết aminoglycoside phải xâm nhập vào tế
bào vi khuẩn. Tiến trình này chủ yếu là quá trình vận chuyển tích cực cần năng lượng
và oxy. Điều này giải thích một số đặc tính liên quan đến phổ tác động và đặc tính

cơ chế giảm thể hiện porin màng tế bào OmpA và OmpC (outer membrane porin) cũng
đã được phát hiện ở Pseudomonas aeruginosa.
2.3.4.4. Cơ chế tác động của các kháng sinh nhóm polypeptide và cơ chế đề kháng
của vi khuẩn đối với nhóm polypeptide (Võ Thị Trà An, 2007)
Các polymyxin có hoạt tính sát khuẩn với phổ kháng khuẩn hẹp. Colistin và
polymyxin B có tác động sát khuẩn trên vi khuẩn G- vì receptor của chúng là
phosphatidyl ethanolamin trên màng nguyên sinh chất chỉ có ở vi khuẩn G-. Các
polymyxin là những chất hoạt động bề mặt dạng cation với khả năng làm hư hỏng cấu
trúc phospholipid của màng tế bào và tăng quá trình thẩm thấu như những chất tẩy.
Dạng proton hóa của polymyxin có khả năng trung hòa độc tố do các coliform gây ra
trong bệnh viêm vú, nhưng dường như chỉ hiệu quả trong giai đoạn đầu.
Sự đề kháng của vi khuẩn với các kháng sinh nhóm polypeptide nhìn chung rất
hiếm. Tuy nhiên đã có một số ghi nhận về sự đề kháng trên vi khuẩn (Võ Thị Trà An,
2007).

12


2.3.4.5. Cơ chế tác động của các kháng sinh nhóm tetracycline và cơ chế đề kháng
của vi khuẩn đối với nhóm tetracycline (Võ Thị Trà An, 2007)
Các tetracycline có tác dụng tĩnh khuẩn bằng cách ức chế tổng hợp protein của
tế bào vi khuẩn. Sau khi khuếch tán qua màng tế bào vi khuẩn, một hệ thống vận
chuyển tích cực sẽ đưa thuốc vào bên trong nguyên sinh chất. Tại đây, các tetracycline
gắn kết với tiểu đơn vị 30S của ribosome, sau đó chúng cản trở ARN vận chuyển
mang aminoacyl (aminoacyl – transfer ARN) gắn với điểm tiếp nhận trên phức hợp
ribosome – ARN thông tin.
Có hai cơ chế chính dẫn đến đề kháng thu được với kháng sinh nhóm
tetracycline ở vi khuẩn. Cơ chế thứ nhất là thông qua hệ thống bơm thoát dòng (Tet A,
B, C, D, E, H, G…), có nghĩa là chuyển kháng sinh từ trong tế bào ra bên ngoài, làm
giảm nồng độ kháng sinh trong tế bào chất của vi khuẩn. Cơ chế thứ hai là thông qua

hóa dihydrofolate thành tetrahydrofolate bằng cách gắn với enzyme dihydrofolate
reductase. Từ đó ngăn cản vi khuẩn tổng hợp puridine và ADN. Hai loại kháng sinh
này thường phối hợp với nhau để nâng cao tác dụng sát khuẩn.
Đề kháng với sulfonamide do đột biến điểm ở chromosome xảy ra chậm và có
thể cản trở sự xâm nhập của thuốc vào tế bào vi khuẩn, hoặc tạo thành các enzyme
dihydropteroate không nhạy cảm hoặc sản xuất quá nhiều PABA. Đề kháng thông qua
plasmid phổ biến hơn với các dihydropteroate synthetase (DHPS) đề kháng với
sulfonamide. Đề kháng với trimethorpim qua gene nằm trên chromosome có thể do
việc sản xuất quá mức dihydrofolate reductase, hoặc những đột biến trong gene folA
mã hóa cấu trúc của dihydrofolate reductase, hoặc đột biến gây bất hoạt thymidylate
synthetase. Đề kháng với trimethoprim thường gặp ở nhóm vi khuẩn
Enterobacteriaceae khi chúng thu nhận gene (dfr) mã hóa cho enzyme dihydrofolate
reductase đề kháng với trimethoprim do vị trí hoạt động bị biến đổi.
2.4. KHÁNG SINH ĐỒ
Kháng sinh đồ là một sự phân tích trong phòng thí nghiệm cho phép xác định
hoạt tính của một hoặc nhiều kháng sinh đối với loại vi khuẩn đã phân lập được.
Người ta có thể làm kháng sinh đồ bằng hai phương pháp là pha loãng hoặc khuếch
tán. Phương pháp pha loãng được thực hiện trên môi trường lỏng hoặc thạch và là
phương pháp định lượng. Phương pháp khuếch tán được tiến hành trên môi trường
thạch và là phương pháp định tính (Sabin và Dernuet, 1995).
Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng lên kết quả kháng sinh đồ. pH của môi trường
nuôi cấy ảnh hưởng lên hoạt tính của một vài loại kháng sinh. Kháng sinh thuộc họ
14


aminoside và họ macrolide sẽ tăng hoạt tính trong môi trường acid. pH thích hợp cho
kháng sinh đồ là từ 7,2 - 7,4.
Độ dày của thạch trong đĩa petri cũng là một yếu tố quan trọng để cho kết quả
chính xác trong phương pháp khuếch tán trên thạch do nồng độ kháng sinh khuếch tán
từ các đĩa kháng sinh sẽ thay đổi theo độ dày của thạch. Độ dày của thạch trên môi