BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TỪ ĐẤT VÀ
KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG AFLATOXIN CỦA
CÁC GỐC PHÂN LẬP ĐƯỢC

Giáo viên hướng dẫn: PGS – TS. Nguyễn Ngọc Hải
Họ và tên sinh viên: Trương Hương Thảo
Lớp: DH04DY
Niên khóa: 2004 – 2009

Tháng 9/2009


PHÂN LẬP VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TỪ ĐẤT VÀ KHẢO
SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG AFLATOXIN CỦA CÁC GỐC PHÂN
LẬP ĐƯỢC

Tác giả

TRƯƠNG HƯƠNG THẢO

Khóa luận được đệ trình đề để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Bác sỹ ngành Thú y

Giáo viên hướng dẫn:
PGS – TS. NGUYỄN NGỌC HẢI

Tháng 9/2009

-

Đánh giá sơ bộ khả năng ức chế aflatoxin của các gốc Bacillus subtilis

phân lập được từ đất: sau 7 ngày nuôi cấy chung Bacillus subtilis và Aspergillus
flavus trên môi trường thạch nước cốt dừa, quan sát bên ngoài và dưới ánh đèn UV
cho thấy một số gốc có khả năng ức chế sự sản sinh aflatoxin và sự sinh trưởng của
nấm mốc Aspergillus flavus.
-

Khảo sát khả năng ức chế aflatoxin của các gốc vi khuẩn Bacillus

subtilis phân lập được từ đất trên môi trường bắp: kết quả cho thấy một số gốc vi
khuẩn có khả năng làm giảm aflatoxin trên môi trường bắp.
-

Thử nghiệm tác động của aflatoxin lên sự phát triển của Bacillus

subtilis: sau 7 ngày nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis trong môi trường TSB có bổ
sung aflatoxin theo các nồng độ khác nhau, các ống môi trường được gửi đi phân
tích hàm lượng aflatoxin. Kết quả là hàm lượng aflatoxin trong ống TSB có nuôi
cấy vi khuẩn giảm so với hàm lượng aflatoxin trong ống TSB không nuôi cấy vi
khuẩn. Số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis nuôi cấy trong môi trường không có
aflatoxin phát triển tốt hơn trong môi trường có aflatoxin. Kết quả này cho thấy
aflatoxin có thể ức chế sự phát triển của Bacillus subtilis và vi khuẩn Bacillus
subtilis làm giảm aflatoxin theo phương thức phá huỷ aflatoxin.

iii



2.2. SƠ LƯỢC VỀ NẤM MỐC SINH ĐỘC TỐ AFLATOXIN .........................12
2.2.1. Khái niệm về nấm mốc và độc tố nấm mốc...........................................12
2.2.2. Độc tố aflatoxin......................................................................................13
CHƯƠNG 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................24
3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM ........................................................................24
3.1.1. Thời gian ................................................................................................24
3.1.2. Địa điểm .................................................................................................24
3.2. NỘI DUNG ĐỀ TÀI......................................................................................24
3.3. VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM ............................................................................24
3.3.1. Đối tượng khảo sát .................................................................................24
3.3.2. Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm ..................................................................25
3.3.3. Môi trường nuôi cấy...............................................................................25
3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................26
3.4.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất ..............................................26
3.4.2. Thí nghiệm 1: Kiểm tra khả năng sinh aflatoxin của chủng nấm mốc
Aspergillus flavus và đánh giá sơ bộ khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các gốc
Bacillus subtilis phân lập được. ................................................................................30
3.4.3. Thí nghiệm 2: Kiểm tra khả năng làm giảm aflatoxin trên môi trường
bắp của các gốc vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập được........................................31
3.4.4. Thí nghiệm 3: Thử nghiệm tác động của aflatoxin lên sự phát triển của
vi khuẩn Bacillus subtilis ..........................................................................................35
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................37
4.1. Khảo sát đặc điểm sinh học của Bacillus subtilis..........................................37
4.1.1. Đặc điểm khuẩn lạc nghi ngờ là Bacillus subtilis ..................................37
4.1.2. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis..............37
4.1.3. Khảo sát đặc điểm sinh hóa của các vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus
subtilis…………… ...................................................................................................38
v




Acid Ribonucleic

CFU

Colony Forming Units

ctv

cộng tác viên

CYA

Czapek Yeast Extract Agar

LD50

Lethal dose

Liều gây chết 50% tổng đàn

ppb

part per billion

Phần tỷ (μg/kg)

TSA

Trypticase Soya Agar

Bảng 5-1: Kết quả phân lập Bacillus subtilis từ đất .................................................50

viii


DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 4.1: Số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis của thí nghiệm 3 .........................46
Biểu đồ 4.2: Ảnh hưởng của vi khuẩn Bacillus subtilis lên hàm lượng aflatoxin....48

ix


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1: Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis ...........................................................4
Hình 2.2: Hình dạng tế bào sinh dưỡng và vị trí bào tử.............................................5
Hình 2.3: Công thức hoá học của sufactin .................................................................9
Hình 2.4: Công thức hoá học của agrastatin ..............................................................9
Hình 2.5: Công thức hoá học của iturin ....................................................................9
Hình 2.6: Quá trình sinh trưởng của nấm mốc.........................................................13
Hình 2.7: Công thức hoá học của một số aflatoxin..................................................16
Hình 2.8: Sơ đồ phân tử aflatoxin gắn vào chuỗi ADN...........................................18
Hình 3.1: Kết quả thử lecithinase.............................................................................29
Hình 3.2: kết quả thử nitrate.....................................................................................29
Hình 3.3: Kết quả thử citrate ....................................................................................29
Hình 3.4: Kết quả thử VP.........................................................................................29
Hình 3.5: Kết quả thử maltose .................................................................................29
Hình 4.1: Vi khuẩn phân lập từ đất trên môi trường TSA .......................................37
Hình 4.2: Hình dạng Bacillus subtilis sau khi nhuộm Gram....................................38
Hình 4.3: Khuẩn lạc Aspergillus flavus sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường thạch

1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Nấm mốc và độc tố nấm mốc (mycotoxin) trong thức ăn chăn nuôi có ảnh
hưởng rất lớn đến năng suất vật nuôi. Nấm mốc phát triển trong ngũ cốc, nguyên
liệu và thức ăn chăn nuôi không những làm giảm giá trị dinh dưỡng của thức ăn mà
còn sản sinh ra các độc tố gây bệnh cho con người và vật nuôi. Hiện nay các nhà
khoa học đã phát hiện trên 300 loại độc tố mycotoxin từ hơn 100 loài nấm mốc.
Trong các loại độc tố nấm mốc đó, phải kể tới aflatoxin (Dương Thanh Liêm,
2008).
Aflatoxin có rất nhiều tác hại trên con người cũng như trên gia súc như gây
suy giảm miễn dịch, rối loạn chức năng, thoái hoá gan thận, ung thư trên động vật
thí nghiệm mà còn gây chết gia súc, gia cầm nếu nhiễm phải lượng lớn. Trong điều
kiện khí hậu nước ta (nóng ẩm gió mùa) rất thuận lợi cho sự phát triển của nấm mốc
sinh độc tố aflatoxin nếu như các loại nguyên liệu, thức ăn gia súc không được bảo
quản tốt. Nếu điều này xảy ra sẽ gây tổn thất rất lớn cho chăn nuôi, nguy hiểm nhất
là gián tiếp ảnh hưởng đến sức khoẻ con người.
Để hạn chế sự sản sinh aflatoxin trong thức ăn chăn nuôi, người ta đã sử
dụng nhiều phương pháp, trong đó, phương pháp sinh học bổ sung vi khuẩn
Bacillus subtilis cũng đã được áp dụng. Bacillus subtilis tiết ra hoạt chất sinh học có
khả năng ức chế nấm mốc và aflatoxin.
Được sự phân công của khoa Chăn Nuôi Thú Y, trường Đại học Nông Lâm
Tp.HCM, sự đồng ý của phòng vi sinh khoa Chăn Nuôi Thú Y và sự hướng dẫn của
thầy Nguyễn Ngọc Hải, chúng tôi tiến hành đề tài: ”Phân lập vi khuẩn Bacillus
subtilis từ đất và khảo sát khả năng kháng aflatoxin của các gốc phân lập được”.

1


1.2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI
Phân lập và tìm ra gốc Bacillus subtilis từ đất có khả năng ức chế aflatoxin,
phục vụ cho nghiên cứu ứng dụng Bacillius subtilis kiểm soát aflatoxin trong chăn

trọt, chăn nuôi, công nghệ sinh học … (trích dẫn bởi Nguyễn Ngọc Thanh Xuân,
2006).

2.1.2. Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis
2.1.2.1. Đặc điểm phân loại
Theo phân loại của Bergey (1994) vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc:
Bộ : Eubacteriales
Họ : Bacillaceae
Giống : Bacillus
Loài : Bacillus subtilis

2.1.2.2. Đặc điểm phân bố
Bacillus subtilis là vi khuẩn hoại sinh được phân bố hầu hết trong tự nhiên
như đất, nước, không khí, thực vật bị phân hủy… và cỏ khô nên còn được gọi là
trực khuẩn cỏ khô. Tuy nhiên dưới hầu hết những điều kiện thì Bacillus subtilis bất
hoạt và tồn tại ở dạng bào tử (Nguyễn Lân Dũng, 2001).
3


2.1.2.3. Đặc điểm hình thái
Vi khuẩn Bacillus subtilis có dạng trực khuẩn ngắn và nhỏ, hai đầu tròn, bắt
màu Gram dương, kích thước 0,5 – 0,8µm x 1,5 - 3µm, thường đứng đơn lẻ hoặc
tạo thành chuỗi ngắn. Vi khuẩn có khả năng di động, có 8 – 12 chiên mao, sinh bào
tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào sinh dưỡng, kích thước 0,9 – 0,6µm. Vị trí của bào
tử trong tế bào sinh dưỡng không theo một nguyên tắc chặt chẽ nào, có thể lệch tâm
hoặc gần tâm nhưng không chính tâm (Nguyễn Lân Dũng, 2001).

Hình 2.1: Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis
( />
2.1.3. Đặc điểm nuôi cấy

2.1.6. Bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis
Bào tử vi khuẩn là một dạng biến đổi đặc biệt của tế bào sinh dưỡng trong
một giai đoạn nào đó của quá trình sinh trưởng của vi khuẩn. Mỗi tế bào chỉ tạo
thành một bào tử (trích dẫn bởi Nguyễn Khắc Tuấn, 1996).

Hình 2.2: Hình dạng tế bào sinh dưỡng và vị trí bào tử
của vi khuẩn Bacillus subtilis

5


( />
2.1.6.1. Cấu tạo bào tử
Gồm màng ngoài, lớp vỏ, màng trong và khối tế bào chất đồng nhất trong
cùng.
Vỏ gồm nhiều lớp, có tác dụng ngăn chặn sự thẩm thấu của nước và các chất
hòa tan trong nước.
Trong các bào tử tự do không tồn tại sự trao đổi chất, vì vậy có thể giữ ở trạng
thái tiềm sinh trong nhiều năm (Tô Minh Châu, 2000).
Bào tử khác tế bào sinh dưỡng về cấu trúc, thành phần hoá học và tính chất
sinh lý.
Bảng 2-1: Sự khác nhau giữa tế bào dinh dưỡng và bào tử của Bacillus subtilis
Đặc tính
Cấu trúc

Tế bào sinh dưỡng

Bào tử

Tế bào Gram (+), điển

Cao

Chịu bức xạ

Kém

Mạnh

Yếu

Cao

Dễ nhuộm

Phương pháp đặc biệt

Hoạt tính các chất hóa học và
acid
Khả năng bắt màu thuốc
nhuộm

(trích dẫn bởi Tô Minh Châu, 2000)

6


2.1.6.2. Đặc điểm và tác dụng của bào tử
Bào tử vi khuẩn không thực hiện chức năng sinh sản mà chỉ là một thể biến
đổi của tế bào nhằm bảo tồn, đổi mới và nâng cao sức sống của vi khuẩn. Bào tử là
một hình thức tiềm sinh của vi khuẩn, có sự đề kháng cao với các nhân tố bất lợi

tử.
Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử sẽ nảy mầm và phát triển thành một tế
bào mới có sức sống mạnh mẽ hơn (Nguyễn Khắc Tuấn, 1996).

7


2.1.7. Tính chất đối kháng với vi sinh vật gây bệnh
2.1.7.1. Đối kháng với nấm
Mỗi loài sinh vật khác nhau sẽ thích hợp ở điều kiện môi trường khác nhau,
sinh khuẩn lạc khác nhau. Thay đổi môi trường hoặc các yếu tố môi trường bất lợi
tức là làm thay đổi điều kiện sống sẽ hạn chế hoặc ức chế sự phát triển của vi sinh
vật. Thực tế khi môi trường nuôi cấy nấm bệnh có sự hiện diện của Bacillus subtilis
với một số lượng lớn sẽ xảy ra sự cạnh tranh chất dinh dưỡng, cạnh tranh không
gian sống giữa vi khuẩn và nấm. Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn (trong 24 giờ) sẽ
sử dụng phần lớn các chất dinh dưỡng trong môi trường, đồng thời tạo ra một số
loại kháng sinh nên sự sinh trưởng của nấm bị ức chế (Nguyễn Lân Dũng và Hoàng
Đức Nhuận, 1976, trích dẫn bởi Nguyễn Ngọc Thanh Xuân, 2006).
Phương thức diệt nấm và các tác nhân gây bệnh của vi khuẩn Bacillus
subtilis như sau :
-

Đầu tiên vi khuẩn Bacillus subtilis tạo thành khối xung quanh tác

nhân gây bệnh ngăn chặn không cho chúng bám vào vật thể chủ để gây bệnh.
-

Sau đó, Bacillus subtilis tiết ra hỗn hợp gồm nhiều lipopeptid (được

gọi là serenade) để làm thủng vách tế bào và màng tế bào chất của tác nhân gây


nấm, bản chất là lipopeptide được chiết từ môi trường nuôi cấy vi khuẩn Bacillus
subtilis. Iturin diệt nấm bằng cách tác động lên màng tế bào chất, làm tan màng, tạo
thành những lổ thủng trên đó để làm mất tính thẩm thấu chọn lọc của màng.

Hình 2.5: Công thức hoá học của iturin
( />
9


2.1.7.2. Đối kháng với vi khuẩn
Ngoài nấm gây bệnh ra thì Bacillus subtilis cũng đối kháng với vi khuẩn gây
bệnh như Escherichia coli. Khi nuôi cấy chung trên môi trường TSB thì Bacillus
subtilis có khả năng tổng hợp một số chất kháng sinh nên sẽ ức chế quá trình sinh
trưởng và phát triển của Escherichia coli.
Nguyễn Quỳnh Nam năm 2006 đã tiến hành thí nghiệm nuôi cấy Bacillus
subtilis và Escherichia coli trên môi trường TSB và theo dõi số lượng Escherichia
coli qua các thời điểm 0 giờ, 12 giờ, 24 giờ và 36 giờ. Kết quả cho thấy: số lượng
Escherichia coli tăng dần khi nuôi cấy trên môi trường TSB không có Bacillus
subtilis. Còn khi nuôi cấy chung Bacillus subtilis và Escherichia coli trên môi
trường TSB thì số lượng Escherichia coli giảm dần theo thời gian.

2.1.8. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về tác dụng đối kháng với
Aspergillus của Bacillus subtilis
Trong nước
Nguyễn Hữu Phúc và cộng sự năm 1993 đã sử dụng vi khuẩn Bacillus
subtilis để ức chế sinh trưởng và sản xuất aflatoxin của Aspergillus flavus,
Aspergillus parasiticus trên bột đậu phộng (trích dẫn bởi Nguyễn Ngọc Thanh
Xuân, 2006).
Nguyễn Đình Đào năm 1993 đã tiến hành kiểm tra khả năng đối kháng của

làm giảm độc tố aflatoxin trên môi trường bắp. Ở tỷ lệ nuôi cấy bào tử nấm
mốc/bào tử vi khuẩn là 1/103 thì hàm lượng aflatoxin giảm 50 lần (5ppb so với đối
chứng là 250ppb). Tỷ lệ vịt chết khi ăn thức ăn nhiễm aflatoxin được xử lý vi khuẩn
Bacillus subtilis giảm 55% so với đối chứng và giảm đáng kể những tổn thương gan
về mặt đại thể cũng như vi thể. Vịt ăn thức ăn nhiễm aflatoxin được xử lý vi khuẩn
Bacillus subtilis gan chỉ sưng nhẹ, xuất huyết cục bộ và một vài điểm hoại tử, mô
gan bị thoái hoá mỡ nhẹ hơn so với lô đối chứng gan sưng to, xuất huyết gần như
toàn bộ, hoại tử, tế bào gan bị thoái hóa mỡ nặng.
Ngoài nước

11


Norio Kimura (1990) đã sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis để ngăn chặn sự
phát triển và sinh độc tố của các chủng Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus
trên bột đậu phộng và bắp. Các chủng Bacillus subtilis NK 330 và NK – C – 3 ức
chế mạnh mẽ sự phát triển nấm mốc và tổng hợp aflatoxin. Khả năng ức chế này
thay đổi tuỳ theo từng chủng vi khuẩn (trích dẫn bởi Nguyễn Ngọc Thanh Xuân,
2006).

2.2. SƠ LƯỢC VỀ NẤM MỐC SINH ĐỘC TỐ AFLATOXIN
2.2.1. Khái niệm về nấm mốc và độc tố nấm mốc
2.2.1.1. Nấm mốc
Theo Lê Anh Phụng (2001), mấm mốc là vi sinh vật (vi nấm) có cấu tạo gần
giống với giới thực vật, sống ký sinh hay hoại sinh trên nhiều loại chất khác nhau,
đặc biệt là các chất hữu cơ, đơn giản nhất là hydratcacbon.
Người ta tìm thấy nấm mốc ở khắp mọi nơi từ phân, đất, trên các cây cối
mục nát, quần áo, giày dép, trên ngũ cốc, ngay cả trên cơ thể sống của động vật và
con người.
Nấm mốc không chứa diệp lục tố, cơ thể dạng sợi có vách ngăn hoặc không