ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

DƯƠNG TRUNG THÀNH

NHÂN DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN
GEN MÃ HÓA ANTHOCYANIDIN REDUCTASE
CỦA CÂY CHÈ (Camellia sinensis)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

THÁI NGUYÊN - 2018


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

DƯƠNG TRUNG THÀNH

NHÂN DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN
GEN MÃ HÓA ANTHOCYANIDIN REDUCTASE
CỦA CÂY CHÈ (Camellia sinensis)
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số: 8420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Huỳnh Thị Thu Huệ
2. TS. Hoàng Thị Thu Yến

THÁI NGUYÊN - 2018

dạng sinh học hệ gen, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam, đã tận tình chỉ dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài
nghiên cứu khoa học này.
Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Dương
Trung Dũng – Khoa Nông học – Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên đã
giúp đỡ tôi trong thời gian tôi thu thập vật liệu nghiên cứu làm đề tài.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể gia đình, bạn bè và
đồng nghiệp đã luôn cổ vũ, động viên tôi trong suốt thời gian qua.
Tác giả

Dương Trung Thành


iii
iiii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................
i

LỜI

CẢM

ƠN........................................................................................................ii
LỤC

MỤC

............................................................................................................iii


Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU..............................................................
3
1.1. SƠ LƯỢC VỀ CÂY CHÈ.............................................................................
3
1.1.1. Nguồn gốc, lịch sử phát triển của cây chè ...................................... 3
1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây chè ....................................................... 4
1.1.3.
Giá
trị
của
....................................................................................... 7

cây

chè

1.2. TÌNH HÌNH SẢN XUẤT VÀ NGHIÊN CỨU CHÈ TRÊN THẾ
GIỚI

VÀ

VIỆT

NAM......................................................................................... 9
1.2.1. Tình hình sản xuất chè trên thế giới và Việt Nam .......................... 9
1.2.1.1. Tình hình sản xuất chè trên thế giới............................................. 9
1.2.1.2. Tình hình sản xuất chè ở Việt Nam ........................................... 11
1.2.2. Tình hình nghiên cứu chè trên thế giới và ở Việt
Nam...........................14


anthocyanidin
reductase...............................................................................................................2
0


iv
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................23
2.1. Vật liệu nghiên cứu ......................................................................................23
2.1.1. Nguyên liệu ................................................................................... 23
2.1.2. Hóa chất .....................................................................................................23
2.1.3. Thiết bị .......................................................................................................24
2.2. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................24
2.2.1. Phương pháp tách chiết RNA tổng số......................................................24
2.2.2. Điện di RNA tổng số.................................................................................25
2.2.3. Tổng hợp cDNA........................................................................................26
2.2.4. Nhân gen ANR bằng kĩ thuật PCR ...........................................................26
2.2.5. Tinh sạch sản phẩm PCR..........................................................................28
2.2.6. Tách dòng gen ANR ..................................................................................29
2.2.7. Xác định trình tự gen.................................................................................32
2.2.8. Xử lí số liệu bằng các phần mềm chuyên
dụng................................................33
2.2.9. Thiết kế vector biểu
hiện....................................................................................33
2.3. Sơ đồ nghiên
cứu...................................................................................................34
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.....................................................35
3.1. Khuếch đại gen ANR từ mẫu chè nghiên cứu.............................................35
3.2. Tạo dòng gen, xác định và phân tích trình tự gen mã hóa
anthocyanidin
reductase...............................................................................................................3

Complementary DNA

DMSO

Dimethyl sulfoxide

Dimethyl sulfoxide

C

Catechin

Catechin

CsANR

Gen ANR của chè

ANR gene of Camellia sinensis

DNA

Axit Deoxiribonucleic

Deoxyribonucleic Acid

dNTP

dNTP



Epigallocatechin

EGCG

Epigallocatechin-3-O-gallate

Epigallocatechin-3-O-gallate

EtBr

Ethidium Bromide

Ethidium Bromide

GC

Gallocatechin

Gallocatechin

Kb

Kilô bazơ

Kilo base

LAR

Leuacoanthocyanidin reductase


Phản ứng chuỗi trùng hợp

Polymerase Chain Reaction

Primer F Mồi xuôi

Primer forward

Primer R Mồi ngược

Primer reverse

RNA

Axit Ribonucleic

Ribonucleic Acid

RNase

Enzyme phân hủy RNA

Ribonuclease

TAE

TAE

Tris Acetate EDTA

pJET1.2 .................................................................................. 29
Bảng 2.7. Thành phần phản ứng cắt plasmid .......................................... 32
Bảng 3.1. Kết quả kiểm tra nồng độ RNA tổng số ....................................
36
Bảng 3.2. Sự sai khác trình tự nucleotide gen ANR của chè Trung du xanh
với

các

trình

tự

đã

công

bố

trên

Genbank

........................................ 41
Bảng 3.3. Sự sai khác trình tự amino acid của gen mã hóa anthocyanidin
reductase ở giông chè Trung du xanh với các trình tự đã công
bố trên Genbank ...........................................................................
44



XhoI ......................................................................................... 46
Hình 3.9. Kết quả PCR kiểm tra plasmid pET32a(+)_ANR .................. 47


1

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Chè (Camellia sinensis (L) O. Kuntze) là loại cây công nghiệp lâu năm,
có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới và Á nhiệt đới, là cây trồng xuất hiện từ lâu
đời, được trồng khá phổ biến ở nhiều quốc gia như Trung Quốc, Nhật Bản,
Việt Nam ... Sản phẩm từ cây chè đã và đang được sử dụng rộng rãi trên
khắp thế giới dưới nhiều công dụng khác nhau nhưng phổ biến nhất vẫn là đồ
uống. Theo thống kê, chè là thức uống phổ biến thứ hai trên thế giới chỉ sau
nước, với hương vị độc đáo và những tác dụng có lợi cho sức khỏe con người.
Nước chè là thức uống tốt, có tác dụng giải khát, chống lạnh, có tác dụng bảo
vệ sức khỏe con người khắc phục sự mệt mỏi của cơ thể, kích thích hoạt động
của hệ thần kinh trung ương, kích thích vỏ đại não làm cho tinh thần minh
mẫn sảng khoái, hưng phấn trong những thời gian lao động căng thẳng cả về
trí óc và chân tay, kích thích hệ tiêu hóa, chữa một số bệnh đường ruột, lợi
tiểu (do chứa theofilin, theobromin), kích thích tiêu hoá mỡ, chống béo phì,
chống sâu răng, hôi miệng, chống lão hóa, phòng ngừa ung thư (do chứa
catesin), phòng ngừa bệnh tăng huyết áp, tiểu đường và ngăn ngừa
cholesteron tăng cao… Ngoài ra, chè còn có khả năng bảo vệ da khỏi tác hại
của tia cực tím, chè cũng được cho là ức chế sự xâm nhiễm và sinh sản của
HIV. Hầu hết các đặc tính có lợi cho sức khỏe được liệt kê ở trên đã được
chứng minh là do các hợp chất polyphenol có trong chè.
Chính vì các đặc tính ưu việt trên, chè đã trở thành sản phẩm đồ uống
phổ thông trên toàn thế giới, sản phẩm chè từ lâu đã trở thành một trong
những nét văn hóa đặc trưng của nhiều quốc gia, đặc biệt là các quốc gia


polyphenol.

reductase (ANR) là enzyme quy định tổng hợp nên

epicatechin, phân lập và xác định trình tự gen tổng hợp epicatechin là bước
đầu tiên tạo tiền đề nghiên cứu chức năng của gen ANR, nhằm góp phần làm
sáng tỏ giá trị của polyphenol nói riêng và cây chè nói chung đối với con
người. Ở chè Việt Nam, gen mã hóa anthocyanidin reductase vẫn chưa
được phân lập và nghiên cứu về chức năng. Xuất phát từ thực tế trên, chúng
tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nhân dòng và thiết kế vector biểu hiện gen
mã hóa anthocyanidin reductase của cây chè (camellia sinensis)”.

2. Mục tiêu đề tài
Tạo dòng, xác định, phân tích trình tự và thiết kế vector biểu hiện gen
mã hóa Anthocyanidin reductase phân lập từ cây chè trồng tại Thái Nguyên.
3. Nội dung nghiên cứu
+ Khuếch đại gen ANR mã hóa anthocyanidin reductase từ chè.
+ Tạo dòng gen, xác định và phân tích trình tự gen ANR thu được.
+ Thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa anthocyanidin reductase.


3

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. SƠ LƯỢC VỀ CÂY CHÈ
1.1.1. Nguồn gốc, lịch sử phát triển của cây chè
Cây chè có tên khoa học là Camellia sinensis (L) O. Kumtze và thuộc hệ
thống phân loại như sau :
Ngành:

trên thế giới ngày nay đã có trên 4000 năm lịch sử.
Những công trình nghiên cứu của Đjêmukhatze (1961- 1976) so sánh về
thành phần các chất catechin trong lá chè có nguồn gốc khác nhau, các loại
chè được trồng trọt và chè mọc hoang dại đã kết luận rằng: Những cây chè
mọc hoang dại từ cổ xưa, tổng hợp chủ yếu là epicatechin (-) và epicatechin
galat, ở chúng phát triển chậm khả năng tổng hợp epigalocatechin (-) và các
galat của nó để tạo thành galocatechin (+). Nghiên cứu các cây chè dại ở Việt
Nam cho thấy chúng cũng tổng hợp chủ yếu là epicatechin (-) và epicatechin
galat (chiếm


4

70% tổng số các loại catechin). Năm 1976, Viện sĩ thông tấn Viện Hàn Lâm
khoa học Liên Xô, sau những nghiên cứu về tiến hóa của cây chè, bằng phân
tích chất catechin trong chè mọc hoang dại ở các vùng chè Tứ Xuyên, Vân
Nam Trung Quốc, và các vùng chè cổ Việt Nam (Suối Giàng, Nghĩa Lộ, Lạng
Sơn, Nghệ An …) đã kết luận: Cây chè cổ Việt Nam tổng hợp các catechin
đơn giản nhiều hơn cây chè Vân Nam. Từ đó có sơ đồ tiến hóa cây chè thế
giới như sau: Chi Camellia  chè Việt Nam  chè Vân Nam lá to (chè Trung
Quốc)  chè Assam (Ấn Độ) [3].
Như vậy, có thể kết luận Việt Nam là một trong những cái nôi của cây
chè. Người Việt Nam biết đến chè sớm hơn nhiều so với các nước, tục uống
chè của người Việt Nam đã trở thành một nét văn hóa độc đáo, chiếm vị trí
quan trọng trong giao tiếp, lễ nghi…
1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây chè
Cây chè có bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội 2n = 30, thuộc loại cây thân gỗ
hoặc thân bụi và có một số đặc điểm sinh học sau đây [3]:
a. Đặc điểm hình thái
Thân: Thẳng và tròn, phân nhánh liên tục thành một hệ thống cành và

đỏ và rễ hút hay rễ hấp thụ màu vàng ngà.
b. Đặc điểm sinh lý, sinh thái của cây chè
Nhiệt độ không khí thuận lợi cho sự sinh trưởng và phát triển của chè là
22 - 28oC, độ ẩm không khí tương đối thích hợp là 80 - 85 %. Hàm lượng
nước cần thiết cho cây chè biến động tùy từng giống chè. Loại đất thích hợp
cho trồng chè dày 60 - 100 cm; mực nước ngầm dưới 100 cm; độ chua pH:
4,5 5,5; ty lệ mùn 3 - 4 %.


6

c. Sinh trưởng và phát triển của cây chè
Sự phát triển của cây chè chia làm hai chu kỳ: Chu kì phát triển lớn
gồm suốt đời sống cây chè từ khi hạt nảy mầm đến khi cây chết và chu kì phát
triển nhỏ bao gồm các giai đoạn sinh trưởng, phát triển lặp lại nhiều lần trong
một năm.
d. Thành phần hóa học của lá chè
Thành phần hóa học của lá chè rất đa dạng, bao gồm một lượng lớn là
nước, các thành phần hữu cơ và vô cơ khác. Trong đó, các polyphenol có vai
trò rất quan trọng, quyết định đến màu sặc và hượng vị của chè [48].
Nước là thành phần quan trọng và chủ yếu trong búp chè, chiếm 75 80% khối lượng lá chè, hàm lượng phụ thuộc vào giống chè, thời vụ và độ non
già của lá chè. Nước trong nguyên liệu chè tham gia trực tiếp vào nhiều phản
ứng thủy phân, oxi hóa khử, liên quan trực tiếp đến các quá trình hóa sinh
trong búp chè và có ảnh hưởng đến sự hoạt động của các enzyme.Trong chế
biến chè, nước có vai trò quan trọng trong các quá trình biến đổi, tạo nên mùi
vị và hình dạng của búp chè, nó có liên quan trực tiếp đến chất lượng chè
nguyên liệu và chất lượng chè thành phẩm.
Chất khô chiếm 18 - 25 % khối lượng lá chè, gồm có các polyphenol,
pectin, chất xơ (xenlulo), protein, amino acid, các alcoloit (cafein, theofilin,
theobromin), các enzyme (enzyme oxi hóa và enzyme thủy phân) và chất tro.

Trong chè có các thành phần hóa học giàu chất dinh dưỡng, có tác dụng
tốt đối với cơ thể con người, do đó chè xanh đã trở thành nguyên liệu quan
trọng để chế biến nhiều loại thức ăn đồ uống khác nhau ở rất nhiểu nước trên
thế giới. Phần lớn lá chè xanh được sử dụng làm đồ uống. Chè được pha chế
đúng cách là một loại đồ uống lý tưởng rất tốt đối với cơ thể do có chứa đầy
đủ các loại vitamin, muối khoáng, protein và các chất hữu cơ có lợi khác.
Ngày


8

nay khuynh hướng sử dụng chè xanh trong chế biến thức ăn rất được phát
triển. Các loại bánh kem chè xanh, bánh gatô chè xanh, kem chè xanh, thạch
chè xanh, mỳ ăn liền chè xanh, sandwich chè xanh đang được tiêu thụ mạnh ở
các nước Nhật Bản, Hàn Quốc, Anh, Mỹ, Úc. Trung Quốc và Việt Nam có các
loại bánh nướng chè xanh, bánh dẻo chè xanh… [49].
b. Giá trị dược tính của chè
Nước chè có thể làm giảm các quá trình viêm như viêm khớp, viêm gan
mãn tính, tăng cường tính đàn hồi của thành mạch máu giúp ngăn ngừa tai
biến mạch máu não, nhồi máu cơ tim. Uống chè giảm nguy cơ tim mạch,
chống lão hóa, chống nhiễm độc. Mới đây nhất, các nhà khoa học còn phát
hiện ra chè còn có tác dụng chống khả năng gây ung thư của các chất phóng
xạ. Người ta đã trích ly các chất trong chè để điều chế các thuốc trợ tim, cầm
máu, lợi tiểu…Chất cafein và một số hợp chất alcaloit trong chè có tác dụng
kích thích hệ thần kinh trung ương làm cho tinh thần minh mẫn, tăng hoạt
động các cơ, nâng cao năng lực làm việc và giảm mệt mói sau khi lao động.
Những giá trị tiềm ẩn của cây chè vẫn còn đang được quan tâm nghiên cứu
[49].
c. Giá trị về mặt kinh tế
Chè là cây công nghiệp dài ngày, trồng một lần cho thu hoạch nhiều

Năm

Diện tích (ha)

Năng suất (Tạ/ha)

Sản lượng (Tấn)

2010

3.145.178

14,637

4.603.515

2011

3.400.104

14,040

4.773.895

2012

3.504.972

14,364


14,525

5.954.091

Nguồn: http:// FAOSTAT.FAO.ORG (21/3/2018)


10

Bảng 1.2. Diện tích, năng suất, sản lượng chè của một số nước trên thế
giới năm 2016.
Nước

Diện tích (ha)

Năng suất (Tạ/ha) Sản lượng (Tấn)

2.240.594

10,778

2.414.802

Ấn Độ

585.907

21,372

1.252.174


144.015

Việt Nam

118.824

20,198

240.000

Nhật Bản

44.078

18,195

80.200

Iran

20.403

36,759

75.000

Argentina

37.720

phát triển gần 100 năm (1918 - 2017), được coi là một trong những ngành sản
xuất có mầm mống công nghiệp sớm nhất ở nước ta trong số các ngành chề
biến công nghiệp dài ngày. Trải qua gần một thế ky tồn tại và phát triển,
ngành chè Việt Nam đã trở thành một ngành sản xuất quan trọng. Sự phát
triển của ngành chè Việt Nam có thể chia thành một số giai đoạn sau [3]:
* Giai đoạn 1890 - 1945
Ngay sau khi chiếm Đông Dương, người Pháp đã phát triển sản xuất
chè nhằm khai thác tiềm năng phát triển cây trồng nhiệt đới ở Việt Nam.
Những đồn điền chè đầu tiên ở Việt Nam được thành lập tại Tĩnh Cương Phú Thọ với diện tích 60 ha, ở Đức Phổ - Quảng Nam 250 ha. Tính đến năm
1938, Việt Nam có 13.405 ha chè với sản lượng 6.100 tấn chè khô. Diện tích
chè phân bố chủ yếu ở trung du, miền núi (Bắc bộ) và cao nguyên Trung bộ,
trong đó trên
75% diện tích do người Việt Nam quản lý.
Năm 1939, Việt Nam đạt sản lượng 10.900 tấn chè khô, đứng hàng thứ
6 trên thế giới sau Ấn Độ, Trung Quốc, Srilanka, Nhật Bản và Indonexia.
Đặc điểm nổi bật của thời kỳ này là diện tích chè phân tán mang tính tự
cấp, tự túc, kỹ thuật canh tác sơ sài, kỹ thuật quảng canh là chính.
Ở giai đoạn này có 3 cơ sở nghiên cứu chè được thành lập. Đầu tiên là
trạm nghiên cứu chè Phú Hộ (Phú Thọ) thành lập năm 1918. Sau đó vào năm


12

1927 là trạm nghiên cứu chè Plâycu (Gia Lai - Kontum) và trạm nghiên cứu
chè Bảo Lộc (Lâm Đồng) được thành lập năm 1931.
* Giai đoạn 1945 - 1954
Đây là giai đoạn suy thoái của ngành sản xuất chè Việt Nam. Do ảnh
hưởng của chiến tranh, các vườn chè bị bỏ hoang, sản xuất chè đình trệ làm
cho diện tích chè, sản lượng chè đều giảm sút.
* Thời kỳ 1954 - 1990

nhưng năng suất chè giảm, đời sống người làm chè gặp nhiều khó khăn.
Tước thực trạng đó, Tổng công ty chè Việt Nam được thành lập, thống
nhất quản lý ngành chè. Một số liên doanh liên kết sản xuất với nước ngoài
(Nhật Bản, Đài Loan, Bỉ, Anh, Malaixia) được thành lập, công nghệ chế biến
bước đầu được đổi mới, thị trường xuất khẩu bắt đầu mở rộng sang các nước
Tây Âu, Bắc Mỹ, Nhật Bản, thị trường xuất khẩu truyền thống (các nước
thuộc Liên Xô cũ, Đông Âu…) cũng được mở lại, giá chè bước đầu ổn định,
tạo niềm tin cho người làm chè.
Những năm gần đây, Việt Nam đã có nhiều cơ chế chính sách đầu tư ưu
tiên phát triển cây chè. Cây chè được xem là cây cây trồng có khả năng xóa
đói, giảm nghèo và làm giàu của nhiều hộ dân. Do đó diện tích, năng suất và
sản lượng chè không ngừng tăng lên. Theo báo cáo của Cục Trồng trọt, năm
2016 cả nước có 133,4 nghìn ha trồng chè, năng suất 86,9 tạ/ha, đạt sản lượng
1.025,2 nghìn tấn. Xuất khẩu chè năm 2016 đạt 130,9 nghìn tấn, trị giá 217,2
triệu USD.
Bảng 1.3. Tình hình diện tích, năng suất, sản lượng chè ở Việt Nam
trong những năm gần đây


14

Năm

Diện tích

Năng suất

Sản lượng

Xuất khẩu


129,8

79,5

936,3

141,44

2014

132,1

83,4

981,9

133,00

2015

133,6

86,0

1.010

132,50

2016