BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
---------------

NGUYỄN THỊ THANH

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI RÚT GÂY
HOẠI TỬ THẦN KINH VÀ TẠO KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP LÀM
NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT VẮC-XIN PHÒNG BỆNH CHO CÁ MÚ
(Epinephelus spp)

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Hà Nội, năm 2018


Công trình được hoàn thành tại:

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. Phạm Công Hoạt
2. PGS.TS. Lê Văn Năm

Phản biện 1: ..........................................................................
Phản biện 2: ...........................................................................
Phản biện 3: ............................................................................

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện
Họp tại Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam

Mục tiêu của đề tài luận án:
- Xác định được vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá mú tại Việt Nam và một số đặc
tính sinh học của vi rút gây bệnh.
- Tạo được kháng nguyên tái tổ hợp và đánh giá khả năng sinh kích thích miễn
dịch của kháng nguyên để làm nguyên liệu phục vụ sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử
thần kinh cho cá mú.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn:
- Tính khoa học: Luận án đã xác định được vi rút gây bệnh và một số đặc tính
sinh học của chúng. Đồng thời luận án đã sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp protein T4
của vi rút gây bệnh, đánh giá tính sinh đáp ứng miễn dịch để làm cơ sở cho việc sản xuất
vắc-xin phòng bệnh cho cá mú. Dữ liệu khoa học của luận án sẽ cung cấp thêm tư liệu
giảng dạy và nghiên cứu về bệnh và định hướng sản xuất vắc- xin phòng bệnh cho cá mú
nuôi hiện nay.
- Tính thực tiễn: Đề tài đã tạo được kháng nguyên tái tổ hợp protein T4 và đánh
giá được khả năng kích thích sinh đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên tái tổ hợp làm
nguồn nguyên liệu sản xuất vắc- xin phòng bệnh cho cá mú góp phần hạn chế dịch bệnh,
tăng sản lượng cá nuôi và phát triển bền vững nghề nuôi cá mú.
Đóng góp mới của đề tài luận án:
- Lần đầu tiên tại Việt Nam đã nghiên cứu một cách toàn diện về vi rút gây bệnh
hoại tử thần kinh trên cá mú, đã xác định được 26 chủng vi rút và một số đặc tính sinh
học của vi rút gây bệnh.
- Luận án là công trình đầu tiên tại Việt Nam đã tạo được kháng nguyên protein
T4 tái tổ hợp, kháng nguyên có khả năng sinh đáp ứng miễn dịch bảo hộ cho cá mú kéo

1


dài cho đến ngày thứ 90 sau khi tiêm. Đây là cơ sở khoa học để sử dụng kháng nguyên
protein T4 tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho
cá mú..

là bệnh hoại tử thần kinh do vi rút gây ra. Hiện nay, chưa có vắc-xin phòng ngừa loại vi
rút này và biện pháp phòng ngừa chủ yếu vẫn là đảm bảo vệ sinh và cách ly các nguồn
lây nhiễm vi rút.
1.3. Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú trên thế giới và Việt Nam
1.3.1. Đặc điểm về bệnh hoại tử thần kinh ở cá biển
1.3.2. Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú trên thế giới
1.3.3. Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú tại Việt Nam
1.3.4. Các phương pháp chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh trên cá
Hiện nay để chẩn đoán bệnh VNN thường sử dụng các phương pháp: mô bệnh
học, phân lập vi rút trên tế bào, sinh học phân tử, sử dụng kính hiển vi điện tử và chẩn
đoán miễn dịch học (OIE, 2005) [15].
1.4. Tổng quan về vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh
Tác nhân gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá là Betanodavirus, nhân RNA, hình
cầu, đường kính 25-30 nm. Hệ gen có cấu trúc phân đoạn, RNA mạch đơn, tuyến tính
hai phía có hai tiểu phần. Tiểu phần lớn chứa RNA1 (3.1 kb) mã hóa cho một protein có

2


kích thước 100 kDa với chức năng như là RNA polymerase. Tiểu phần nhỏ chứa RNA2
trên đó chứa hai vùng bảo tồn cao là T2 (870 bp) và T4 (420 bp) (Nishizawa và cs, 1997)
1.5. Một số biện pháp phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú
Hiện nay chưa có loại vắc-xin nào đạt được hiệu quả phòng bệnh hoại tử thần
kinh. Vì vậy những biện pháp đảm bảo vệ sinh, tránh các nguồn lây nhiễm vẫn được coi
như là biện pháp chủ yếu để tránh gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi cá mú.
1.6. Kháng nguyên tái tổ hợp và tình hình sử dụng vắc-xin phòng bệnh cho cá
1.6.1. Kháng nguyên tái tổ hợp của tác nhân gây bệnh
Kháng nguyên tái tổ hợp là kháng nguyên (protein miễn dịch) được sản xuất bằng
kỹ thuật di truyền. Trên thế giới, việc sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp để sản xuất vắcxin kiểm soát một số bệnh nguy hiểm cho cá nuôi đã được nghiên cứu từ những năm
1980. Việc ứng dụng công nghệ sinh học để sản xuất ra số lượng lớn kháng nguyên bằng

Thị Tâm và cs, 2015) [6].

3


CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Vi rút gây hoại tử thần kinh (NNV)
- Kháng nguyên protein T4 tái tổ hợp
2.1.2. Vật liệu nghiên cứu
- Tế bào GS1 (lách cá mú) của hãng Sigma (Đức)
- Vector pGEM-T và vector pET32a+ của hãng Novagen (Mỹ).
- Chủng E. coliJM109 và E. coliBL21(DE3) của hãng HV Biotek.
- Enzyme EcoRI (Invitrogen)
- Kít RT-PCR one step (Quiagen của Mỹ), kít tinh sạch DNA Qick Gel Extraction
(Invitrogen), thang DNA và protein (Invitrogen).
- Cột Nikel chelating Resin (Invitrogen)
- Cá mú chấm nâu (Epinephelus coioides), cá mú cọp (Epinephelus fuscoguttatus)
và mú chuột (Cromileptes altivelis) ở các kích cỡ khác nhau;
- Cá mú chấm nâu (Epinephelus coioides) giai đoạn cá bột, cá con (chiều dài từ
1,5 – 2 cm)
- Các loại môi trường, dụng cụ nuôi cấy tế bào: Leibovit, MEM, HANK's, FCS,
kháng sinh, kháng nấm,…
- Các loại hóa chất tinh khiết cho xét nghiệm mô bệnh học; các hóa chất sử dụng
trong kỹ thuật sinh học phân tử của các hãng: Sigma, Bio-Basic, Invitrogen, Biological
bao gồm: IPTG, ampicilin, X-gal, agarose, EDTA, SDS, cao nấm men, peptone, NaCl,
Ethidium Bromide, Ethanol, Isopropanol, Sodium acetate, acid acetic, glycine, methanol,
TBST, BSA, TBS, Tris HCl, EDTA, TAE, NaOH, T4 ligase…
2.2. Nội dung nghiên cứu

- Phương pháp tinh sạch DNA bằng gel agarose: theo PureLink® Quick Gel
Extraction Kit có trong bộ TOPO® TA Cloning Kit của hãng Invitrogen.
- Giải trình tự gen T4 bằng máy tự động ABI 3100 (Applied Biosystems). Dùng
phần mềm Blast xác định mức tương đồng của trình tự gen T4 với GenBank.
2.3.2. Phương pháp xác định đặc tính sinh học của vi rút gây hoại tử
thần kinh
- Xác định độc lực của vi rút trên tế bào: dịch vi rút pha loãng từ 10-1 đến 10-9 với
môi trường Leibovitz’s 15 (10% FCS). Giữ khay đã cấy ở 28oC để vi rút hấp phụ lên tế
bào. Độc lực của vi rút đánh giá qua chỉ số TCID50.
- Phương pháp xác định độc lực của vi rút trên cá mú: dịch vi rút pha loãng từ 10-1
đến 10-9, mỗi độ pha loãng tiêm 30 cá mú con (1,5-2 cm), liều 0,1 ml/con. Quan sát biểu
hiện lâm sàng, tỷ lệ chết và gen mã hóa kháng nguyên T4 sau 5 ngày. Khả năng gây
bệnh của vi rút đánh giá bằng chỉ số LD50.
- Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây nhiễm của vi rút trên tế bào
GS1: chọn chủng QN4 có TCID50 cao (10-6,8) để gây nhiễm trên tế bào. Mỗi chủng NNV
được nuôi cấy ở 4 ngưỡng nhiệt độ: 17, 22, 27 và 32oC, liều gây nhiễm là liều TCID50 =
10-6,8. Theo dõi và đánh giá CPE sau 5 ngày thí nghiệm.
- Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây nhiễm của vi rút trên cá
mú: Chủng QN4 có liều LD50 cao (10-7,5) được gây nhiễm vào cá mú. Lô đối chứng cá
được tiêm môi trường Leibovit”z 15. Cá nuôi ở 280C (cả ngày) và 280 (ban ngày)/240C
(ban đêm). Sau 15 ngày đánh giá tỷ lệ chết và xác định gen T4.

5


2.3.3. Nhóm các phương pháp biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên và
đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp
- Chuẩn bị vector pET32a+ để thực hiện phản ứng nối gen T4 (pET32a+-T4). Dùng
phương pháp sốc nhiệt để đưa vector pET32a+-T4 vào tế bào E. coliBL21.
- Tách chiết plasmid từ các khuẩn lạc sau biến nạp



CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Xác định vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú tại Việt Nam
3.1.1. Sàng lọc mẫu nhiễm vi-rút gây bệnh hoại tử thần kinh bằng phương pháp mô
bệnh học
Kết quả sàng lọc
mẫu nhiễm vi-rút gây
hoại tử thần kinh trên
51 mẫu cá mú được
trình bày ở hình 3.1 và
bảng 3.1 cho thấy có 26
mẫu xuất hiện không
bào trong các mô mắt
và mô não. Các không
bào trong mẫu kiểm tra
có dạng hình tròn hoặc
hình elip, kích thước
không bào từ 5-10µm.
Hình 3.1. Bệnh tích tế bào ở mô não và mô mắt cá (a. Cá
mú bệnh, b. Không bào trong não, c. Không bào trong mắt)
Bảng 3.1. Kiểm tra vi-rút bằng phương pháp mô bệnh học

Bệnh tích tế bào trong mô não cá
(26 mẫu)
Ký hiệu mẫu

Bệnh tích tế bào trong mô mắt cá
(17 mẫu)


BT2, BT4, BT9,
BT12
Trung bình

BT1, BT2, BT4, BT7, BT9,
BT12
Trung bình

44,44
50,00
50,98

45,45
22,22
33,33
33,33

Vi rút gây bệnh có ở tổ chức thần kinh của 26 mẫu thu thập được. Các mẫu còn lại tuy
không thấy không bào xuất hiện nhưng không nằm ngoài khả năng đang ở thời kỳ tiền
nhiễm. Do đó chúng tôi tiếp tục việc xác định vi rút bằng phương pháp sinh học phân tử
để xác định gen mã hóa kháng nguyên của NNV.
3.1.2. Xác định mẫu cá nhiễm vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh bằng phương pháp
RT-PCR

7


Bảng 3.2. Xác định vi-rút gây bệnh hoại tử thần kinh bằng phương pháp RT-PCR

Số mẫu dương tính với gen T4 của NNV

QN4, KH4, KH5, BT2,
BT3 xuất hiện băng có
kích thước khoảng 420 bp
tương ứng với kích thước
đoạn gen T4. Mẫu HP1,
NĐ2 không xuất hiện
băng vạch.

Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm RT-PCR của một số mẫu bệnh phẩm nghi nhiễm NNV

(Giếng 1-10: các mẫu lần lượt HP1, HP2, NĐ3, NĐ2, QN2, QN4, KH4, KH5, BT2,
BT3, Giếng 11: marker)
3.1.3. Xác định vi rút trên tế bào
Đề tài đã sử dụng dòng tế bào GS1 để đánh giá khả năng gây nhiễm của NNV,
với 27 mẫu dương tính với gen T4, chúng tôi đã xác định được 26 chủng vi rút (hình 3.3,
bảng 3.3). Mẫu HP11 không có biểu hiện bệnh tích ở mô não và mô mắt.

Hình 3.3. Bệnh tích của tế bào GS1 sau khi gây nhiễm NNV
A: Tế bào sau gây nhiễm NNV 2 ngày, tế bào kết hạt và co tròn,
B: Tế bào sau gây nhiễm NNV 7 ngày,
C: Không bào trong tế bào GS1 gây nhiễm NNV sau 2 ngày.

8


Từ ngày thứ 2 tế bào có hiện tượng kết hạt, co tròn, hình thành nhiều hạt không bào kích
thước đa dạng; sau 5 ngày tế bào chết cục bộ ở khắp bề mặt đĩa nuôi cấy và tới ngày thứ
7, toàn bộ tế bào bị phá hủy hoàn toàn bởi hiện tượng tan bào (hình 3.3).
Bảng 3.3. Xác định vi rút gây hoại tử thần kinh gây nhiễm trên tế bào GS1
STT

2
QN4
_
+
+
+
++
+++
++++
3
HP2
_
_
+
+
+
++
+++
4
HP4
_
+
+
+
++
+++
++++
5
HP6
_

+
++
+++
9
HP11
_
_
_
_
_
_
_
10
NĐ1
_
+
+
+
++
+++
++++
11
NĐ3
_
_
+
+
+
++
+++

+
+
+
++
+++
++++
16
NĐ10
_
_
+
+
+
++
+++
17
NĐ11
_
_
+
+
+
++
+++
18
KH4
_
_
+
+

22
BT3
_
+
+
+
++
+++
++++
23
BT4
+
+
+
++
+++
++++
24
BT7
_
+
+
+
++
+++
++++
25
BT9
+
+



Hình 3.5. Thiết kế vector
tái tổ hợp pGEMT- T4
A: Điện di sản phẩm tinh
sạch gen T4 (giếng1: sản
phẩm T4 tinh sạch; giếng
M: 1kb Plus Ladder); B:
sơ đồ thiết kế vector tách
dòng gen T4

Sản phẩm sau tinh sạch có kích thước khoảng 420bp tương đương kích thước gen T4
(Hình 3.5A). Tách dòng bằng vector pGEM-T Easy, vector tái tổ hợp được thiết kế theo
Hình 3.5B. Vector tái tổ hợp pGEM-T-T4 được biến nạp vào E. coli JM109. Lựa chọn
các khuẩn lạc trắng và nuôi trong môi trường LB lỏng (bổ sung ampicilin 100µg/ml) để
tách plasmid tái tổ hợp và cắt, tinh sạch gen T4. Sản phẩm DNA plasmid tách từ các
khuẩn lạc trắng được kiểm tra trên gel agarose 1% thể hiện ở Hình 3.6 (A), kiểm tra sản
phẩm PCR khuếch đại gen T4 thể hiện trong Hình 3.6 (B), kiểm tra sản phẩm cắt bằng
enzyme giới hạn thể hiện trong Hình 3.6 (C).

Hình 3.6. Điện di kiểm tra sản phẩm T4 tái tổ hợp
(A): DNA plasmid tách từ 3 khuẩn lạc trắng (giếng 1,2,3);
(B): Kiểm tra sản phẩm PCR của gen T4 từ 3 plasmid tái tổ hợp (giếng 1,2,3)
(C): Kiểm tra đoạn DNA gen T4 chèn vào DNA của 3 plasmid tái tổ hợp cắt bằng
emzyme EcoRI (giếng 1,2,3)
Giếng M: Thang chuẩn1kb Plus Ladder;
Kết quả hình 3.6 (C): các giếng 1-3 xuất hiện vạch có kích thước khoảng 420bp tương
đương với kích thước gen T4, có khả năng chúng tôi tách dòng thành công gen T4.
Sau khi xác định trình tự gen T4, chúng tôi sử dụng phần mềm Blast để xác định mức độ
tương đồng của trình tự gen T4. Kết quả cho thấy đoạn gen T4 mã số HM017077.1 có độ

10-6,8

HP6

10-4,3
10-5
10-4,8

10-4,4
10-4,9
10-4,8

10-4,3
10-4,8
10-4,7

10-4,5
10-4,9
10-4,9

10-4,3
10-4,9
10-4,8

6
7

HP7
HP8


10

NĐ1
NĐ3

10-6,8
10-3

10-6,8
10-3,1

10-7
10-3

10-6,9
10-3

10-6,8
10-3

1
2

QN2

3
4
5

HP2


10-4,3

10-4,2

10-4,3

10-4,3

14

NĐ7
NĐ8

10-4,8

10-4,9

10-4,9

10-4,9

10-4,9

15

NĐ10

10-3



10-6,8
10-3

10-6,8
10-3,1

10-6,9
10-3

10-6,8
10-3

10-4,8

10-4,9

10-4,9

10-5

10-4,9

10-4,8
10-5,9

10-4,8
10-5,9

10-4,7


10-2,7

NĐ5

KH4
KH5

18
19

KH9

20

BT2
BT3

21
22

BT4

23
24

BT7
BT9
BT10


1

QN2

10-6,2

10-6,2

10-6,1

10-6,2

2

QN4

10-7,5

10-7,6

10-7,5

10-7,5

3

HP7

10-7,5


6

BT7

10-6,5

10-6,5

10-6,4

10-6,5

7

KH4

10-3,7

10-3,6

10-3,6

10-3,6

8

BT10

10-2,5


Hình 3.8. Mật độ tế bào sống sót sau khi gây nhiễm NNV
Kết quả trình bày ở hình 3.8 cho thấy, 220C là ngưỡng nhiệt độ phù hợp nhất cho
sự nhân lên của vi rút và quá trình gây nhiễm của vi rút trên tế bào GS1.
3.2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây bệnh của vi rút trên cá
mú
Khả năng gây bệnh của NNV ở nhiệt độ 28oC (cả ngày và đêm) được thể hiện ở bảng 3.8
cho thấy: lô cá mú được gây nhiễm chủng QN4 có tỷ lệ chết tích lũy là 82,1% sau 3
ngày, 100% sau 6 ngày theo dõi. Đối chứng tỷ lệ chết là 10% sau 15 ngày theo dõi. Qua
bảng cho thấy tác nhân gây chết cá là NNV chủng QN4 với sự xuất hiện của gen T4.
Bảng 3.8. Khả năng gây bệnh của NNV trên cá mú ở 28oC cả ngày và đêm
Tỷ lệ chết của cá mú (%)

Xác định gen T4

Thời
gian
(ngày)

Lần
1

Lần 2

Lần 3

TB

Đối chứng

0


6

100

100

100

100

6,6

+

-

Lô thí
Đối chứng
nghiệm

9

6,6

-

12

10,0

Lần 1

Lần 2

Lần 3

TB

Đối chứng

Lô đối
chứng

Đối chứng

0

0

0

0

0

0

-

-


-

9

6,6

-

12

10,0

-

15

10,0

-

Ghi chú: +: có gen T4

-: không có gen T4

Ở nhiệt độ 28oC (ban ngày) và 24oC (ban đêm), tỷ lệ chết của cá sau 3 ngày là
85,5% và sau 6 ngày cá chết hoàn toàn. Lô đối chứng sau 15 ngày tỷ lệ chết là 10%. Tác
nhân gây bệnh có gen T4, chính là NNV chủng QN4 đã gây nhiễm.
3.3 Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin
phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú.

Kết quả Hình 3.10 (A): các giếng số 1, 2, 3 và 4 đều xuất hiện hai băng, một băng
có kích thước khoảng 420bp (kích thước gen T4) và một băng có kích thước khoảng
3015bp (kích thước vector pGEM-T Easy). Hình 3.10 (B) cho thấy các giếng số 1, 2, 3
chỉ xuất hiện một băng vạch duy nhất có kích thước tương đương vector pET 32a +
khoảng 5900bp. Như vậy chứng tỏ đã cắt thành công plasmid tái tổ hợp pGEMT-T4 và
plasmid pET32a+ tạo ra các vị trí tương thích để gắn gen T4 vào vector pET32a+. Băng
vạch có vùng gen T4 kích thước 420bp và băng vạch có vector pET32a+ kích thước
5900bp được cắt để tinh sạch. Các sản phẩm cắt plasmid pGEMT-T4 và vector pET32a+
được điện di trên gel agarose 1%, kết quả được thể hiện ở Hình 3.11.

Hình 3.11. Tinh sạch sản phẩm cắt plasmid pGEM-T-T4 và vector pET32a+
Giếng 1: gen T4 sau khi tinh sạch, Giếng 2: plasmid pET32a+ sau tinh sạch
M: 1kb Plus Ladder

15


Phản ứng nối gen được thực hiện ở 40C, ủ từ 14 đến 16h. Để kiểm tra sự tạo thành vector
tái tổ hợp pET32a+-T4, sản phẩm nối gen được biến nạp vào tế bào E. coli JM 109. Sàng
lọc chủng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp trên môi trường LB có bổ sung kháng sinh
Ampicillin (100µg/ml), nuôi ở 37oC trong 16h, kết quả được thể hiện ở hình 3.12. Sau
16 giờ tiến hành chọn sáu khuẩn lạc sang nuôi cấy trong 3ml môi trường LB lỏng có bổ
sung kháng sinh Ampicillin (100µg/ml), nuôi lắc với tốc độ 150 vòng/phút ở 370C trong
16h. Sau đó tách plasmid, điện di trên gel agarose 1%, kết quả ở hình 3.13.

Hình 3.12. Đĩa khuẩn lạc sau khi
chuyển gen pET32a+-T4 vào E.
coli JM109
Tiến hành PCR với cặp mồi
P1 và R3 để kiểm tra sáu

hợp pET32a+-T4 đề tài đã lựa
chọn bốn trong sáu dòng vi
khuẩn để biến nạp vào chủng vi
khuẩn biểu hiện E. coli BL21
(DE3). Vi khuẩn biến nạp được
nuôi cấy trên môi trường LB
thạch (bổ sung kháng sinh
Ampicillin 100µg/ml), nuôi ở
37oC từ 12 đến 16h, kết quả thể
hiện ở hình 3.15

Hình 3.15. Đĩa khuẩn lạc sau khi biến nạp
pET32a+-T4 vào E.coli BL21.
Để kiểm tra khả năng biến nạp của plasmid pET32a+-T4 vào tế bào E. coli
BL21(DE3), chúng tôi tiến hành sàng lọc bằng cách tách plasmid và kiểm tra PCR. Sản
phẩm tách plasmid được điện di trên gel agarose 1%, kết quả thể hiện ở hình 3.16

Hình 3.16. Điện di đồ plasmid tái tổ hợp
tách từ chủng E. coli BL21(DE3) mang
vector pET32a+-T4

Hình 3.17. Kiểm tra khả năng biến nạp vector
tái tổ hợp pET32a+ -T4 vào chủng E. coli
BL21(DE3).

Giếng 1-4: Plasmid các dòng từ 1 đến 4; Giếng 1-4: Sản phẩm PCR plasmid các dòng từ 1
Giếng M:GeneRulerTM 1kb DNA Ladder
đến 4, Giếng M: GeneRulerTM 1kb DNA Ladder

Thực hiện phản ứng PCR kiểm tra các mẫu plasmid mang vector pET32a+-T4. Kết quả

ứng IPTG 2h, 4h và 6h; giếng 6,7,8:
protein dòng 4 cảm ứng IPTG trong 2h,
4h và 6h. Giếng M: Broad-way Multi
prestained protein Marker

Kết quả hình 3.18: Giếng 1 và 5 không xuất hiện vạch protein lạ. Giếng 2,3,4 xuất hiện
một băng vạch protein đậm có kích thước khoảng 17 kDa. Giếng số 6,7,8 xuất hiện một
băng vạch protein đậm có kích thước khoảng 25 kDa tương ứng với kích thước lý thuyết
protein T4. Như vậy dòng số 2 đã biểu hiện thành công gen T4.
Kết quả hình 3.19 cho thấy: Giếng số 1,5 không xuất hiện các vạch protein lạ. Các giếng
2,3,4,6,7,8 xuất hiện một băng vạch protein đậm có kích thước là 25 kDa tương ứng với
kích thước lý thuyết của kháng nguyên protein T4.
Từ các kết quả trên cho thấy đã biểu hiện thành công gen T4 trong vi khuẩn E.
coli BL21(DE3) ở các dòng vi khuẩn BL21- pET32a+-T4 số 2, 3, 4; protein tái tổ hợp có
kích thước là 25 kDa tương ứng với kích thước lý thuyết của kháng nguyên protein T4
của NNV.

18


Sự biểu hiện protein của
gen T4 được khẳng định lại
bằng phương pháp lai
Western blot với kháng thể
đặc hiệu kháng NNV. Kết
quả cho thấy vị trí phản ứng
giữa protein tái tổ hợp T4
với kháng thể đặc hiệu
chuẩn tương ứng tại vạch
điện di có kích thước

19


Xác định nhiệt độ nuôi cấy
Chủng
E.
coli
BL21-pET32a+- T4
ở 28oC, 30oC và
37oC, thu mẫu sau
4h cảm ứng. Kết
quả thể hiện ở hình
3.22 cho thấy ở
28oC
và
30oC
không xuất hiện
băng protein ở kích
thước 25 kDa, nhiệt
độ nuôi 37oC thì đã
biểu hiện được
protein tái tổ hợp
T4.
Hình 3.22. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng biểu hiện
protein tái tổ hợp T4 (giếng 1, 2, 3: lượng protein khi nuôi ở
28oC, 30oC và 37oC, M: thang protein chuẩn).
Xác định nồng độ chất cảm ứng IPTG
IPTG được bổ sung vào
môi trường với các nồng
độ từ 1- 6 mM. Kết quả

nghiệm đánh giá khả năng tạo
kháng thể trung hoà nhằm tạo
nguyên liệu sản xuất vắc-xin
phòng bệnh cho cá mú.
Hình 3.24. Điện di protein T4 tinh sạch trên gel SDSPAGE (M: Thang protein chuẩn, giếng 1-5: kháng nguyên
T4 thu ở pha 1, 2, 3, 4, 5)
3.3.4. Đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp
3.3.4.1. Đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp
trên thỏ
Khả năng kích thích tạo kháng thể trung hòa của kháng nguyên E.coliBL21- pET32a+-T4
và protein tái tổ hợp T4 trên thỏ được trình bày trong Bảng 3.10 và bảng 3.11.
Bảng 3.10. Hiệu giá kháng thể trung hòa vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh ở
mô hình in vitro
Thời gian thu
Độ pha loãng huyết thanh thỏ được
Đối
huyết thanh
Đối chứng âm (CPE %)
gây miễn dịch để trung hòa liều gây
chứng
thỏ sau khi
nhiễm 104 TCID50
dương
gây miễn dịch
(CPE
E.coli BL21- Protein tái tổ
E.coli BL21Protein tái tổ hợp
(ngày)
%)
pET32a+-T4*


0

0

1: 200

1: 50

35

98

0

0

1: 800

1: 200

45

98

0

0

1: 800

protein T4 tái tổ hợp có hiệu giá trung hòa là 1:100.
Kết quả xác định hiệu giá kháng thể trung hòa vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh ở
mô hình in vivo được trình bày ở Bảng 3.11.
Bảng 3.11. Hiệu giá kháng thể trung hòa vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh ở
mô hình in vivo
Đối chứng
Thời gian thu
dương
huyết thanh
thỏ sau khi
Nhiễm
Chết
gây miễn
bệnh
(%)
dịch (ngày)
(%)

Đối chứng âm (tỷ lệ
nhiễm bệnh %)
E.coli
BL21pET32a+T4

Protein
T4 tái tổ
hợp

Huyết thanh của thỏ được gây miễn dịch
E.coli
BL21- pET32a+-T4

15

100

100

0

0

ND

+

ND

+

25

100

100

0

0

1: 100


0

0

1: 100

-

1: 50

+

60

100

100

0

0

1: 50

+

1: 10

+


trung hòa NNV QN2 (104 TCID50)
Lô thí nghiệm
30
45
15 ngày
60 ngày 75 ngày 90 ngày
ngày
ngày
Đối chứng dương
+
+
+
+
+
+
Dịch chiết cá gây miễn dịch
với E.coliBL21-pET32a+-T4
Dịch chiết cá gây miễn dịch
với protein T4 tái tổ hợp
Dịch chiết cá gây miễn dịch
với E.coliBL21-pET32a+-T4 + 1:64
1:256
1:128
1:128
1:64
1:8
NNV cường độc
Dịch chiết cá gây miễn dịch
với protein T4 tái tổ hợp+ 1:16
1:128

23