ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN THỊ LOAN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC
VÀ ĐOẠN GEN MATK/ITS Ở CÂY Ô ĐẦU
(Aconitum carmichaelii Debx.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2018


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN THỊ LOAN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC
VÀ ĐOẠN GEN MATK/ITS Ở CÂY Ô ĐẦU
(Aconitum carmichaelii Debx.)
Ngành: SINH HỌC THỰC NGHIỆM
Mã ngành: 8.42.01.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN THỊ NGỌC LAN


LỜI CAM ĐOAN

văn, rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của Quý thầy/cô để luận văn
thêm hoàn thiện.
Thái Nguyên, tháng 4 năm 2018
Tác giả

Nguyễn Thị Loan


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN......................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN.............................................................................................................. ii
MỤC LỤC.................................................................................................................. iii
DANH MỤC NHỮNG TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT...................................................... iv
DANH MỤC CÁC BẢNG........................................................................................... v
DANH MỤC CÁC HÌNH........................................................................................... vi
MỞ ĐẦU..................................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài...................................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu................................................................................................. 2
3. Nội dung nghiên cứu................................................................................................ 2
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................................ 3
1.1. Giới thiệu chung về cây Ô đầu.............................................................................. 3
1.1.1. Phân loại cây Ô đầu............................................................................................ 3
1.1.2. Nguồn gốc và phân bố của cây Ô đầu tại Việt Nam........................................... 3
1.1.3. Vai trò của cây Ô đầu......................................................................................... 4
1.2. Phương pháp phân loại học phân tử...................................................................... 5
1.2.1. Giới thiệu về mã vạch DNA............................................................................... 5
1.2.2. Phân loại thực vật học bằng mã vạch DNA........................................................ 6
1.3. Nghiên cứu sử dụng phân loại học phân tử........................................................... 7
1.3.1. Nghiên cứu sử dụng phân loại học phân tử trên thế giới.................................... 7
1.3.2. Nghiên cứu sử dụng phân loại học phân tử ở Việt Nam..................................... 8

BOLD

:

The Barcode of Life Data System

BLAST

:

The Basic Local Alignment Search Tool

CIA

:

Chloroform : Isoamyl Alcohol Solution

CTAB

:

Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide

DNA

:

Deoxyribonucleic acid


matK

:

MaturaseK

NCBI

:

The

National

Center

for

Information
PCR

:

Polymerase Chain Reaction

iv

Biotechnology



Hình 3.13. Kết quả phân tích bằng BLAST đoạn DNA phân lập từ mẫu Ô
đầu Quản Bạ, Hà Giang.......................................................................32
Hình 3.14. Trình tự nucleotide vùng ITS của mẫu Ô đầu Quản Bạ, Hà
Giang và của cây Ô đầu mang mã số KU041716 trên GenBanK........32
Hình 3.15. Sơ đồ hình cây mô tả mối quan hệ di truyền giữa các loài Ô đầu
trong chi Aconitum dựa trên trình tự nucleotide của vùng ITS............33


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Việt Nam là một nước có nguồn tài nguyên thực vật đa dạng và phong
phú, đặc biệt là nguồn cây dược liệu. Trong đó, nhiều cây có giá trị làm thuốc
nhưng cũng có độc tính, được xếp trong Danh mục dược liệu độc làm thuốc
như Thầu dầu, Cà độc dược, Ô đầu ... Vì vậy, khi sử dụng những loại dược liệu
này làm thuốc cần phải đặc biệt chú ý đến cách sử dụng, liều dùng, đối tượng
dùng và phải được chế biến theo quy trình nghiêm ngặt, đúng kỹ thuật để đảm
bảo an toàn cho người sử dụng.
Ô đầu, Phụ tử chứa những thành phần có độc tính cao nhưng vẫn được
cho là những vị thuốc quý, đã được dùng khá phổ biến trong y dược học cổ
truyền. Ô đầu là củ mẹ và Phụ tử là củ con của một số loài thực vật thuộc chi
Aconitum. Hiện nay, chi Aconitum được nghiên cứu nhằm phát triển các sản
phẩm theo hướng hiện đại, cũng như nâng cao hiệu quả sử dụng các loài thuộc
chi này trong phòng và điều trị bệnh. Do đó, việc nghiên cứu đặc điểm thực vật
học sẽ giúp tiêu chuẩn hóa dược liệu, minh chứng cho cách sử dụng Ô đầu và
Phụ tử, đồng thời góp phần phát triển các dạng thuốc mới sử dụng trong điều trị
và chăm sóc sức khỏe.
Theo phương pháp truyền thống, việc giám định loài thực vật và động
vật chủ yếu dựa trên chỉ thị về hình thái. Phương pháp phân loại này trong
nhiều trường hợp còn gặp nhiều khó khăn và hạn chế như: nhiều loài có hình
thái rất giống nhau nhưng thực tế lại rất khác nhau trong hệ thống phân loại (hệ

Hemsl và A. carmichaelii Debx. Theo một số nghiên cứu, tên khoa học của cây
Ô đầu trồng ở Sa Pa - Lào Cai là Aconitum carmichaelii Debx. Việc xác định
tên khoa học của cây Ô đầu trồng ở các địa phương khác cũng chưa được thực


hiện. Do đó, cần có nghiên cứu định danh tên khoa học chính xác của cây Ô
đầu [3], [5].
1.1.3. Vai trò của cây Ô đầu
Trong cây Ô đầu có 3 thành phần hóa học chủ yếu là: alcaloid,
polysaccharid, flavonoid, trong đó alcaloid là thành phần chính. Trong các bộ
phận của cây như: thân cây, rễ củ, lá cây, hoa, quả và hạt đều có các hợp chất
alcaloid, acid hữu cơ, đường tự do, acid amin. Aconitin là một loại alkaloid
chính có trong củ Ô đầu. Ngoài ra, trong củ Ô đầu còn có tinh bột, đường,
manit, chất nhựa, các acid hữu cơ chất béo và sterol. Ở thân, lá và hoa cây Ô
đầu có chất carotenoid, sterol và flavonoid, ở hạt có thêm chất béo [30].
Cây Ô đầu là loại dược liệu có tính độc cao [12], [21], [33]. Cây Ô đầu
chứa chất gây độc ở hầu hết các bộ phận, nhiều nhất là ở củ [34]. Trong dược
thư Việt Nam, củ của cây Ô đầu được chia thành hai loại là củ lớn và củ nhỏ.
Củ nhỏ được gọi là phụ tử, củ lớn được gọi là Ô đầu. Phụ tử có độc tính kém
hơn Ô đầu. Ô đầu có tác dụng giảm đau, tăng cường miễn dịch, chống oxy hóa,
gây hạ đường huyết, chống tăng sinh tế bào, chống ung thư, tác dụng trên tim
mạch, chống viêm, chống tiêu chảy, kháng nấm và kháng virus [14], [29].
Theo y học dân tộc, Ô đầu có vị cay tê, tính nóng, rất độc, có tác dụng
trợ dương bổ hoả, trừ phong hàn, táo thấp. Trong đông y, Ô đầu được dùng để
chữa các chứng phong tê, chân tay nhức mỏi, tê bại... Thường chỉ dùng làm
thuốc uống khi đã qua chế biến cẩn thận và được dùng với liều nhỏ, có sự chỉ
định và theo dõi thận trọng của thầy thuốc. Tây y dùng làm thuốc ho và chữa
chứng ra mồ hôi nhiều [35], [36].
Hiện nay, trên thị trường đã có một số sản phẩm làm từ cây Ô đầu như:
Bát vị quế phụ, cồn xoa bóp Jamda của công ty Cổ phần Traphaco dùng để trị

nhận biết thành phần và cấu trúc của các gen đặc hữu ở sinh vật. Trong đó, kỹ
thuật dựa trên phân tích DNA là phương pháp đạt hiệu quả cao trong việc định
loại và giám định loài [32].


Năm 2003, Hebert P.D., nhà nghiên cứu tại Đại học Guelph ở Ontario,
Canada, đã đề xuất mã vạch DNA (DNA Barcode, chỉ thị DNA) giống như một
cách để xác định loài. Mã vạch DNA được sử dụng là một đoạn DNA ngắn từ
một phần của hệ gen và được dùng giống như cách một máy quét nhận diện
được các loài [20].
Một mã vạch DNA điển hình đảm bảo được các yêu cầu:
(1) Hiệu suất nhân bản cao và trình tự có tính đặc hiệu.
(2) Có tính phổ biến.
(3) Có khả năng phân biệt được nhiều loài một cách đồng thời.
Việc kết hợp giữa chỉ thị phân tử DNA và chỉ thị hình thái sẽ nhanh
chóng xác định được sự khác biệt giữ sinh vật này với sinh vật khác một cách
chính xác [20], [28].
Mã vạch DNA là một đoạn gen ngắn, chuẩn của các loài sinh vật đã
được xác định nằm trong Ngân hàng gen, nó được sử dụng để định danh các
loài sinh vật chưa biết bằng phương pháp so sánh với trình tự DNA của Ngân
hàng gen (Genbank) [15], [19].
1.2.2. Phân loại thực vật học bằng mã vạch DNA
Việt Nam là một nước có nguồn tài nguyên thực vật đa dạng và phong
phú, đặc biệt là nguồn cây dược liệu. Hệ thực vật rất đa dạng, gồm thực vật có
hạt (hạt trần và hạt kín) cùng với rêu, dương xỉ và các loài có quan hệ gần với
dương xỉ. Tổng số các loài khác nhau rất nhiều, một tính toán gần đây thấy
rằng hiện nay có khoảng 380.000 loài thực vật sống trên cạn, có khoảng
352.000 loài thực vật hạt kín, 1.300 loài thực vật hạt trần và 13.000 loài rêu với
dương xỉ [2]. Như vậy, với một số lượng loài rất lớn thì việc phân loại và định
danh sẽ rất khó khăn.

được lựa chọn như: gen atpF-atpH, gen matK, gen rbcL, gen rpoB, gen rpoC1,
psbK-psbI và gen trnH-psbA. Dựa trên những đánh giá có khả năng thu được,


chất lượng và mức độ phân biệt giữa các loài, nhiều nghiên cứu đã đưa ra kết
luận gen có mức độ phân biệt loài cao đó là gen rbcL và matK [23].
Hiện nay, việc điều trị các bệnh khác nhau thì thuốc thảo dược được sử
dụng rộng rãi ngày càng nhiều, ngành công nghiệp dược liệu cũng phát triển.
Với nhiều lý do mà hiện nay các loại dược liệu có thể bị pha trộn làm giảm đi
hiệu quả của thuốc. Dược liệu bị thay thế bởi các thành phần chứa độc tính nên
một số trường hợp có thể thể gây nguy hiểm đến tính mạng. Các loại thuốc thảo
dược được sử dụng ngày càng tăng vì vậy xác định chính xác nguồn gốc của
các loại dược liệu là điều cần thiết. Li M. và cộng sự (2011) đã tiến hành
nghiên cứu xác định nguyên liệu thảo dược bằng mã vạch DNA [24]. He J và
cộng sự (2010) cũng sử dụng mã vạch DNA để nghiên cứu xác định một số
mẫu cây dược liệu trong chi Aconitum [19]. DNA là một đại phân tử ổn định và
được tìm thấy trong tất cả các mô. Do đó, sự phát triển của các dấu hiệu nhận
biết dựa trên DNA là rất quan trọng để xác định cây thuốc [27].
1.3.2. Nghiên cứu sử dụng phân loại học phân tử ở Việt Nam
Ở Việt Nam, việc phân loại học phân tử các loài sinh vật nói chung và
thực vật nói riêng đã được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu trong thời
gian gần đây [1], [8], [15]. Khi nghiên cứu tính đa dạng sinh học cây họ Gừng
ở vùng Núi Cấm hướng đến ứng dụng trong việc điều chế các thuốc chữa
bệnh, các nhà nghiên cứu thu thập hơn 20 mẫu cây họ Gừng có tên bắt đầu
bằng chữ "ngải" tại vùng Núi Cấm, An Giang. Các mẫu có đặc điểm là hình
thái của chúng tương đối giống nhau. Vì vậy, trình tự ITS và matK đã được sử
dụng để định danh các mẫu này chính xác hơn [7].
Vũ Đình Duy (2013) tiến hành nghiên cứu mối quan hệ di truyền của
một số loài Thông (Coniferales) ở Việt Nam trên cơ sở xác định trình tự
nucleotide vùng gen rbcL (Rubilose-1,5 Bisphophate Carboxylase). Tổng số

năng phân biệt tốt hơn vùng gen ITS, vùng gen matK có thể được sử dụng để
phân biệt các dưới loài của chi Codonopsis [13], [40].


Bùi Thanh Tùng và cộng sự (2017) đã sử dụng phương pháp giải trình tự
DNA để xác định tên khoa học của cây Ô đầu của Việt Nam. Kết quả đã giải
được trình tự gen của cây Ô đầu và khi so sánh với trình tự gen của loài A.
carmichaelii Debx. thấy có sự tương đồng đến 99%. Đây là căn cứ khoa học để
xác định tên khoa học của cây Ô đầu trồng ở tỉnh Hà Giang là: A. carmichaelii
Debx. họ Ranunculaceae [17].
Như vậy, việc sử dụng mã vạch DNA trong phân loại học đã và đang
được ứng dụng rộng rãi. Phương pháp này còn góp phần rút ngắn thời gian
trong phân loại và định danh loài mới của sinh vật. Hiện nay, mã vạch DNA
còn giúp các loài có cùng nguồn gốc bằng phân tích sự đa hình di truyền.
1.4. Sơ lược về gen matK và ITS
Gen maturase K (MatK) là gen mã hóa enzyme maturase, một protein kết
nối các intron. Gen matK là một trong số các gen trong lục lạp có mặt ở hầu hết
thực vật. Hiện nay, matK cũng đang được xem là một gen có những đóng góp
lớn cho việc phát triển hệ thống phân loại phân tử và cho tiến hóa. Vì vậy,
gen matK được coi như một chỉ thị phân tử để giám định loài cũng như nghiên
cứu mối quan hệ giữa các loài thực vật.

trnK ex1

matK

trnK ex2

trnK intron



Hình 1.2. Cấu trúc vùng gen ITS
Hiện nay, ITS được coi là một trong những chỉ thị phân tử để xác định
phát sinh loài hữu ích nhất cho cả thực vật và động vật, bởi vì tính chất phổ
biến của ITS, sự thừa kế lưỡng cực và những thay đổi tiến hóa tương đối cao
hơn do các ràng buộc chức năng ít hơn. Một ưu điểm nữa là vùng ITS1 và ITS2
có thể được khuếch đại bằng phản ứng PCR một cách riêng biệt với các mồi đặ
hiệu cho từng vùng. Điều này tạo điều kiện dễ dàng khuếch đại ITS từ mẫu
DNA có chất lượng kém hoặc bị suy thoái. Ngoài ra các mồi khác có thể
khuếch đại cả hai vùng ITS1 và ITS2. Với các ưu thế như sự sẵn có của mồi, sự
hiện diện của nhiều bản sao trong tế bào, tính phổ quát cao và khả năng phân
biệt loài tốt, vùng ITS đã được xem như là một chỉ thị phân tử tiềm năng cho
mã vạch trong thực vật [20], [28], [32]. Vì vậy, vùng ITS được sử dụng để giám


định chính xác và hiệu quả các loài thực vật trong cùng họ với các đặc điểm
sống và nguồn gốc tiến hóa khác nhau. Trong đó, việc sử dụng vùng ITS2 để
xác định cây thuốc và họ hàng gần của cây đã càng chứng tỏ về tiềm năng của
gen này như một DNA mã vạch hữu ích cho thực vật [18], [19], [23].


Chương 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu, hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu
Vật liệu nghiên cứu của đề tài là mẫu cây Ô đầu thu tại Quản Bạ, Hà
Giang được trồng tại vườn Thực nghiệm, khoa Sinh học, Trường Đại học Sư
phạm Thái Nguyên.
2.1.2. Hóa chất và thiết bị
Thang DNA 1kb (GeneShun Biotech), Kit Gel QIAquick , các hóa chất

Bước 1: Lát cắt được ngâm vào dung dịch nước javen trong 10 - 15 phút
để tẩy sạch nội chất của tế bào.
Bước 2: Rửa sạch javen bằng nước cất (2 - 3 lần).
Bước 3: Ngâm mẫu bằng axit axetic để sạch nước javen còn dính lại (nếu
không javen sẽ làm mất màu thuốc nhuộm).
Bước 4: Rửa sạch axit axetic bằng nước cất (rửa 2 lần)
Bước 5: Nhuộm đỏ mẫu bằng dung dịch cacmin trong khoảng 30 phút.
Bước 6: Rửa qua mẫu bằng nước cất (2-3 lần).
Bước 7: Nhuộm mẫu bằng dung dịch xanh metylen trong khoảng 30 giây.
Bước 8: Rửa mẫu bằng nước cất (2-3).
Bước 9: Lên kính, quan sát và chụp ảnh tiêu bản.
* Phương pháp chụp ảnh hiển vi và phân tích giải phẫu
Ảnh được chụp trên kính hiển vi kết nối máy tính sử dụng phần mềm
Microscope manger tại phòng thí nghiệm Thực vật học khoa Sinh học với các
độ phóng đại khác nhau và kết hợp với chụp ảnh bằng máy ảnh kỹ thuật số.
Sử dụng thuật ngữ để mô tả hình thái và cấu tạo giải phẫu theo các tài
liệu của các tác giả: Nguyễn Bá, 2010 (Hình thái học thực vật) [2]; Trần Công
Khánh, 1981 (Thực tập hình thái và giải phẫu thực vật) [9]; Đỗ Tất Lợi, 2004
(Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam) [12].


2.2.3. Phương pháp phân tử
* Phương pháp tách chiết DNA tổng số
DNA tổng số của cây Ô đầu được tách chiết theo quy trình thực hiện
gồm các bước cụ thể như sau [22]:
- Ủ đệm chiết ở 650C trước khi tách 30 phút.
- Cân 0.5 g mẫu lá, vệ sinh mẫu bằng cồn 70%.
- Nghiền cẩn thận trong 0,5 ml đệm chiết thành dạng bột mịn, chuyển ngay vào
ống eppendorf 2 ml.
- Bổ sung 1 ml đệm tách chiết đảo nhẹ thành hỗn hợp đồng nhất. Ủ 650C trong 1


ITS-R

TAGAATTCCCCGGTTCGCTCGCCGTTACT

matK-F

CGATCTATTCATTCAATATTTC

matK-R

TCTAGCACACGAAAGTCGAAGT

0,28 kb
0,9 kb

Thành phần phản ứng PCR được trình bày trong bảng 2.2.
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR
STT

Hóa chất

Thể tích (µl)

1

H2O

14,7


20

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR nhân bản vùng ITS là: 94 oC trong 4
phút, lặp lại 40 chu kỳ và trong mỗi chu kỳ, biến tính ở 94 oC trong 30 giây,
tiếp hợp mồi ở 58 oC trong 60 giây, tổng hợp ở 72 oC trong 60 giây và bước kết
thúc ở 72 oC trong 5 phút, lưu giữ ở 4oC .
Gen matK được khuếch đại với chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR là 94 oC
trong 1 phút, phản ứng được lặp lại 35 chu kỳ và trong mỗi chu kỳ, biến tính ở
94oC trong 30 giây, tiếp hợp mồi ở 53oC trong 40 giây, tổng hợp ở 72oC cho 40
giây và bước kết thúc ở 72°C trong 5 phút.