New Text Document.txt
Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma với nấm gây bệnh đốm
trắng trên cây Thanh long
Nguyễn Thị Bích Tuyền
Nguyễn Thị Hai (giảng viên hướng dẫn)

Page 1


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

MỤC LỤC
MỤC LỤC .........................................................................................................................i
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ........................................................................................... v
DANH MỤC BẢNG ......................................................................................................vii
DANH MỤC HÌNH ..................................................................................................... viii
MỞ ĐẦU .......................................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài .......................................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu .................................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu .................................................................................................... 2
4. Đối tượng nghiên cứu................................................................................................... 3
5. Kết cấu của Đồ án tốt nghiệp ....................................................................................... 3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................... 5
1.1 Giới thiệu về nấm Trichoderma spp. ...................................................................... 5
1.1.1 Phân loại. .......................................................................................................... 5
1.1.2 Các chủng nấm Trichoderma spp. đã được phân lập ....................................... 5
1.1.3 Đặc điểm hình thái .......................................................................................... 8
1.1.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa ............................................................................. 10
1.1.5 Cơ chế kiểm soát sinh học của nấm Trichoderma trong phòng trừ nấm gây
bệnh cây trồng ......................................................................................................... 11
1.1.6 Mối liên hệ giữa khả năng đối kháng nấm gây bệnh thực vật và hoạt động

ii


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

2.3.2 Phương pháp quan sát hình thái sợi nấm........................................................ 48
2.3.3 Phân lập nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm trắng trên cây thanh
long .......................................................................................................................... 49
2.3.4 Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng nấm Trichoderma ..
................................................................................................................................. 50
2.3.5 Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma với nấm gây
bệnh đốm trắng trên cây thanh long ........................................................................ 52
2.3.6 Thử nghiệm khả năng phòng trừ bệnh đốm trắng trên cây thanh long ở điều
kiện trong chậu ........................................................................................................ 54
2.3.7 Đánh giá hiệu lực phòng trừ bệnh của chế phẩm Trichoderma ngoài đồng
ruộng ........................................................................................................................ 55
2.3.8 Thử nghiệm ủ phân compost từ cành thanh long của nấm Trichoderma ....... 57
2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu .............................................................................. 60
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................. 61
3.1 Kết quả phân lập nấm gây bệnh đốm trắng trên cây thanh long .......................... 61
3.2 Kết quả khảo sát một số đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh học của các chủng
nấm Trichoderma spp. ................................................................................................ 63
3.2.1 Đặc điểm hình thái của các chủng Trichoderma phân lập ............................. 63
3.2.2 Đặc điểm sinh trưởng ..................................................................................... 75
3.2.3 Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng nấm Trichoderma
spp. sau 2 ngày nuôi cấy .......................................................................................... 78
3.3 Khảo sát khả năng sinh đối kháng của các chủng nấm Trichoderma với nấm gây
bệnh đốm trắng trên thanh long .................................................................................. 83
3.4 Kết quả định danh chủng Trichoderma T3 ........................................................... 88
iii

.......................................................................................................................................... 9
A.6. Tỉ lệ đối (%) kháng của các chủng Trichoderma spp. sau 6 ngày đối kháng invitro.
........................................................................................................................................ 11

iv


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

A7. Tỉ lệ đối (%) kháng của các chủng Trichoderma spp. sau 7 ngày đối kháng invitro.
........................................................................................................................................ 13
Phụ lục B: Hình ảnh ....................................................................................................... 16
B1. Hình thái đại thể của các chủng nấm Trichoderma spp. sau 2 ngày nuôi cấy trên
môi trường PDA ............................................................................................................. 16
B2. Đường kính vòng phân giải cellulose (cm) và chitin (cm) của các chủng
Trichoderma 2NSC ........................................................................................................ 18
B3 Kết quả khảo sát khả năng sinh đối kháng của các chủng nấm Trichoderma với nấm
gây bệnh đốm trắng trên thanh long ............................................................................... 25
B4. Lô thí nghiệm và lô đối chứng trong thử nghiệm hiệu lực phòng trừ bệnh của chế
phẩm Trichoderma ngoài đồng ruộng ............................................................................ 30

v


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
CMC: Carboxymethyl cellulose.
NT: nghiệm thức.
ĐC: Đối chứng.


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Hình thái vi thể của Trichoderma harzianum ................................................. 5
Hình 1.2 Hình thái đại thể của một số chủng Trichoderma spp ..................................... 9
Hình 1.3 Hệ sợi nấm Trichoderma kí sinh trên khuẩn nấm gây bệnh Rhizoctonia solan
....................................................................................................................................... 13
Hình 1.4 Ức chế sự phát triển của nấm Pythiumultimum bởi chất kháng sinh được tiết
ra từ Trichoderma harzianum ....................................................................................... 16
Hình 1.5 Một số chế phẩm sinh học từ Trichoderma spp ............................................ 21
Hình 1.6 Các mắt xích β-D-Glucose trong cellulose ................................................... 35
Hình 1.7 Hợp chất cao phân tử Cellulose ..................................................................... 35
Hình 3.1 Hình thái đại thể của chủng nấm gây bệnh đốm trắng sau 3 ngày nuôi cấy
trên môi trường PDA ..................................................................................................... 60
Hình 3.2 Hình thái vi thể của chủng nấm bệnh: (a) Sợi nấm, (b) Bào tử..................... 61
Hình 3.3 Hình thái đại thể của chủng nấm Trichoderma T3, T22 và T26 sau 2 ngày nuôi
cấy trên môi trường PDA .............................................................................................. 77
Hình 3.4 Đường kính vòng phân giải cellulose của chủng Trichoderma.T22, TC15 và
TC6 ................................................................................................................................................................................................. 79
Hình 3.5 Đường kính vòng phân giải chitin của chủng Trichoderma T22, T3 và TC7 ......
....................................................................................................................................... 82
Hình 3.6 Đĩa nấm đối chứng Neoscytalidium dimidiatum ở 2,4,6,7NSC .................... 86

viii


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 3.7 Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma T3 với nấm

đỏ và đất phèn, quả có nhiều chất dinh dưỡng nên có hiệu quả kinh tế cao do giá bán
cao và có giá trị xuất khẩu. Trên thế giới, Thanh long đã và đang là cây ăn quả quan
trọng đem lại hiệu quả kinh tế lớn cho nhiều nước như Đài Loan, Thái Lan, Malaysia,
Trung Quốc,…
Thanh long được người Pháp đưa vào trồng ở Việt Nam khoảng 100 năm nay,
nhưng mới được đưa lên thành hàng hóa từ những năm 1980. Thanh long gồm có 3
loại: ruột trắng vỏ đỏ, ruột đỏ vỏ đỏ và ruột trắng vỏ vàng nhưng phổ biến ở Việt Nam
là hai giống ruột trắng vỏ đỏ, ruột đỏ vỏ đỏ.
Việt Nam là nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, thích hợp cho cây Thanh long
sinh trưởng phát triển tốt. Theo Cục Bảo vệ thực vật (Bộ Nông nghiệp - Phát triển nông
thôn), trên cả nước hiện trồng khoảng 33.600 ha cây thanh long thương phẩm. Trong
đó, tại tỉnh Bình Thuận có 24.000 ha, Long An có 5.400 ha và tỉnh Tiền Giang trồng
4.200 ha (năm 2014) [39].
Tuy nhiên, nhiệt độ cao lượng mưa lớn cũng là điều kiện thuận lợi cho các vi sinh
vật phát triển và gây hại. Trong quá trình sinh trưởng, Thanh long bị gây hại bởi một số
loại dịch hại như kiến, bọ xít, ruồi vàng, bệnh thối đầu cành (Alternaria sp), bệnh đốm
nâu trên cành (Gleosporium agaves), bệnh đốm xám hay còn gọi là nám cành
(Sphaceloma sp) và gần đây là bệnh đốm trắng do nấm gây ra.

1


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Bệnh đốm trắng mới phát hiện tại nước ta từ tháng 6 năm 2013, gây hại trên thân,
quả và giai đoạn chuẩn bị thu hoạch. Bệnh gây ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng phát
triển của cây, làm giảm năng suất, chất lượng quả ở các vùng sản xuất Thanh long tập
trung như Bình Thuận, Tiền Giang. Đặc biệt, các vết đốm tồn tại trên quả đã làm giảm
giá trị thương phẩm. Các nghiên cứu về bệnh đốm trắng trên cây Thanh long ở Việt
Nam hầu như rất ít. Xuất phát từ thực trạng trên, việc nghiên cứu tìm hiểu tình trạng

- Các dòng nấm đối kháng thuộc chi Trichoderma.
- Bệnh đốm trắng thanh long.
- Cây trồng: Thanh long.
5. Kết cấu của Đồ án tốt nghiệp
“Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma spp. với nấm
gây bệnh đốm trắng trên cây Thanh long” có tất cả 3 chương gồm:
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU: Giới thiệu tổng quan về nguồn gốc, phân
bố, tình hình sản xuất, tiêu thụ và thực trạng canh tác cây thanh long ở Việt Nam. Qua
đó, trình bày các đặc điểm sinh học cũng như triệu chứng, thiệt hại của nấm bệnh
Neoscytalidium dimidiatum gây ra trên cây thanh long. Từ đó, đưa ra các kết quả
nghiên cứu và ứng dụng của các biện pháp sinh học trong nông nghiệp, nổi bật là nấm
Trichoderma spp. trong quản lý bệnh hại trên cây thanh long, cụ thể như khả năng
phân hủy chất hữu cơ hay những cơ chế đối kháng với nấm bệnh cây trồng.
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP: Trình bày về vật liệu và phương
pháp nghiên cứu. Vật liệu nghiên cứu bao gồm phần trình bày về thời gian và địa điểm
tiến hành đề tài, nguồn gốc nấm đối kháng, nấm gây bệnh. Phương pháp nghiên cứu
tập trung ở nấm bệnh, cũng như đánh giá khả năng đối kháng của nấm Trichoderma
spp. đối với nấm bệnh bằng phương pháp sử lý số liệu thống kê SAS.

3


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Trình bày kết quả phân lập nấm bệnh
Neoscytalidium dimidiatum. Qua đó, đánh giá khả năng đối kháng của nấm
Trichoderma với nấm bệnh trên cây thanh long đã được phân lập.

4


Họ:

Hypocreaceae

Chi:

Trichoderma

Hình 1. 1 Hình thái vi thể của
Trichoderma harzianum [38].

1.1.2 Các chủng nấm Trichoderma spp. đã được phân lập
Kubicek và Harman (1998) đã mô tả chi tiết 33 loài Trichoderma, ông cho rằng tùy
từng loài nấm mà chúng có hình dạng và kích thước khác nhau [6]

5


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Một số loài Trichoderma spp. được ứng dụng trong phòng trừ sinh học:
Bảng 1.1 Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng Trichoderma
Tên loài

Đặc điểm

Hình ảnh

Đại thể: Khuẩn lạc phát triển nhanh,
đạt 8 - 9cm sau 14 ngày nuôi cấy ở

6


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Sinh hóa: Là loài nấm rất phổ biến
trong đất (cook và baker, 1983), nảy
mầm tốt nhất trong môi trường mùn
cưa có độ ẩm khoảng 30% (Domsch
và Gams,1980) [5].
Đại thể: Khuẩn lạc có đường kính
3 - 5cm sau 5 ngày nuôi cấy ở
nhiệt độ 200C, bào tử có hình trụ
ngắn, vách trơn láng, kích thước
Trichoderma
koningii

(3,0 - 4,8)x(1,9 - 2,8)µm.
Sinh hóa: Hiện diện nhiều ở lớp
đất mặt, nhưng ở độ sâu 120cm
vẫn có sự hiện diện của loài nấm
này. Nấm phát triển tốt ở nhiệt độ
từ 260C trở lên tùy theo nguồn gốc
của loài, pH: 3,7 - 6,0 [6].
Đại thể: Đường kính khuẩn lạc đạt
7 cm khi nuôi cấy 5 ngày ở 200C.
Bào tử màu xanh lục, trơn, dạng

Trichoderma


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Trichoderma hamatum và chúng
phát triển chậm lại ở 00C (Domsch
và Gams,1980) [5].
Đại thể: Bào tử màu xanh lục, vách
xù xì, dạng hình cầu, kích thước (45)x(2,5-3)µm.

(cook

và

baker,

1983) [6].
Sinh hóa: Có thể sử dụng cả hai
Trichoderma

nguồn nitrogen đơn giản và phức

viride

tạp. Khi Trichoderma tăng trưởng
trên nguồn cacbonhydrate như là
nguồn cacbon cho dinh dưỡng thì
ammonium được sử dụng tốt hơn là
nitrate (Danielson và Davey, 1973)
[19].

1.1.3 Đặc điểm hình thái [9].

nhiều hơn hậu mô bào tử, sợi nấm ít kháng nấm hơn bào tử phân sinh. Thiết lập quần

9


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

thể và hiện tượng nảy mầm trong đất: VSV trong đất hoạt động phụ thuộc vào nhiều
loại chất nền trong đất, có nhiều phương pháp xác định khác nhau. Khi sợi nấm non
(chưa có bào tử) vào đất chịu ảnh hưởng nhiều bởi thành phần môi trường đất. Bào tử
sinh sôi nảy nở và thiết lập quần thể cân bằng trong đất (mật độ duy trì cân bằng trong
đất từ 9 – 36 tuần sau khi cấy nấm vào đất).
Nhờ có khả năng tạo thành bào tử chống chịu (Chlamydospores) mà Trichoderma
harzianum có thể tồn tại 110 – 130 ngày dù không được cung cấp chất dinh dưỡng.
Chlamydospores là những cấu trúc dạng ngủ làm tăng khả năng sống sót của
Trichoderma trong môi trường không được cung cấp chất dinh dưỡng nên
Chlamydospores có thể được dùng để tạo chế phẩm phòng trừ sinh học.
1.1.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
Là một loại nấm hoại sinh trong đất nên Trichoderma có thể sử dụng hỗn hợp
nguồn carbon và nitrogen. Nguồn carbon mà Trichoderma có thể sử dụng được là
monosaccharide, disaccharide, polysaccharide…NH3 là nguồn đạm mà nấm
Trichoderma dễ sử dụng nhất, nên trong môi trường nuôi cấy Trichoderma người ta
thường bổ sung NH3, những nguồn nitrogen khác phần nào cũng hỗ trợ cho môi trường
có nhiều dinh dưỡng. Muối và các hỗn hợp vitamin cũng ảnh hưởng lớn đến khả năng
sinh trưởng của Trichoderma [28].
Trichoderma phát triển nhanh ở 25 – 300C, có một vài loài Trichoderma tăng
trưởng được ở 350C. Một số ít phát triển tốt ở 400C. Trichoderma phát triển tốt ở đất có
độ pH từ 3,5 – 7,0 nhưng không thể phát triển trong điều kiện pH < 3,5 và phát triển tốt
ở pH trung tính [16].
Các loài Trichoderma khác nhau thì yêu cầu về nhiệt độ và độ ẩm cũng khác

11


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

1.1.5.1 Cạnh tranh.
Dinh dưỡng có ý nghĩa hết sức quan trọng đối với sự sinh trưởng của VSV. Thiếu
dinh dưỡng là được coi là nguyên nhân gây chết rất phổ biến. Trichoderma cạnh tranh
khai thác với nấm gây bệnh cây trồng, làm suy kiệt chúng bằng cách hút hết dưỡng
chất một cách thụ động và dai dẳng bằng những bào tử chống chịu (chlamydospores).
Ngoài ra, Trichoderma còn cạnh tranh mô già hoặc chết với nấm Botrysis spp. và
Sclerotina spp. gây bệnh cho cây (xâm nhập vào những mô già hoặc mô chết, sử dụng
chúng làm nền tảng để từ đó xâm nhập vào những mô khỏe). Nấm Trichoderma sử
dụng những mô già và mô chết của cây chủ làm nguồn dinh dưỡng, bằng cách đó nấm
Trichoderma cạnh tranh và triệt tiêu đường xâm nhiễm của nấm Botrysis spp. và
Sclerotina spp. [18].
Không những thế, Trichoderma còn cạnh tranh dịch tiết của cây với nấm Pythium
spp. do dịch tiết của cây kích thích sự nảy mầm, mọc thành khuẩn ty của những túi bào
tử Pythium spp. (gây bệnh cho cây) và lây nhiễm vào cây. Trichoderma làm giảm sự
nảy mầm của nấm Pythium spp. bằng cách sử dụng dịch tiết của cây vì thế mà các bào
tử Pythium spp. không thể nảy mầm. Trichoderma còn đối kháng với các nấm gây
bệnh bằng cách chiếm giữ vùng xâm nhiễm của mầm bệnh vào những vị trí bị thương,
do đó ngăn cản sự xâm nhiễm của mầm bệnh [18].
Trichoderma có thể cạnh tranh nguồn carbon, nitơ và yếu tố cần thiết cho sự tăng
trưởng khác với nấm bệnh. T. harzianum có thể kiểm soát nấm Botrysis cinerea (gây
bệnh trên nho) bằng cách chiếm các mô ở hoa và tiêu diệt các tác nhân gây bệnh tại
những vùng bị nhiễm (Gullino, 1992). Sivan và Chet (1989), đã chứng minh rằng sự
cạnh tranh chất dinh dưỡng là cơ chế chính được T. harzianum sử dụng để kiểm soát
nấm bệnh F. oxysporum [26].


của nấm vật chủ. Tỷ lệ ký sinh sẽ tăng lên khi tăng sự tiếp xúc trực tiếp của nấm
Trichoderma với nấm vật chủ.
1.1.5.3 Tiết kháng sinh [9].
Các nhà nghiên cứu đã tìm thấy những vị trí mà nấm Trichoderma tiếp xúc và ký
sinh đã làm cho nấm bệnh chết. Tuy nhiên, ở những điểm không có sự tiếp xúc của
nấm Trichoderma với nấm gây bệnh vẫn chết thì các nhà nghiên cứu cho là tác động
của chất kháng sinh từ nấm Trichoderma sinh ra gây độc cho nấm gây bệnh.
Howell (1987), thấy rằng những chủng T. virens đột biến mất khả năng ký sinh
nhưng vẫn giữ nguyên khả năng tổng hợp kháng sinh có hiệu quả kháng nấm bệnh
Rhizoctonia solani tương đương với chủng tự nhiên. Kết quả này đã chỉ ra rằng ký sinh
không là cơ chế chính yếu trong phòng trừ sinh học một bệnh cụ thể. Sự sinh kháng
sinh cũng là một trong những đặc tính quen thuộc của chi Trichoderma. Nó là một
trong những cơ chế chính đối với điều khiển sinh học. Những kháng sinh này có thể ức
chế mạnh sự sinh trưởng của những vi sinh vật khác.
Khả năng sinh kháng sinh của các loài, các chủng không giống nhau. Chúng gồm:
– Gliotoxin: chất kháng sinh này được R. Weindling và O. Emerson mô tả năm
1936 do nấm T. lignorum sinh ra. Gần đây được xác định lại là do nấm T. virens sinh
ra. Chất gliotoxin có phổ tác động rộng lên nhiều vi sinh vật: vi khuẩn, nấm
(Ascochyta, Botrytis, Phytophthora, Pythium, Rhizoctonia…).
– Steroids (viridin): Đây là chất kháng sinh thứ cấp do nấm Trichoderma tạo
thành trong hoạt động của chúng. Chất kháng sinh này được phát hiện năm 1945.
Viridin độc hơn rất nhiều so với gliotoxin và là một độc tố thực vật, có hiệu lực như
một loại thuốc diệt cỏ, giúp hạn chế sự nảy mầm của bào tử nấm, được sản xuất từ T.
virens.

14


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP