BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN TRÙN QUẾ
VÀ ỨNG DỤNG VÀO CHẾ PHẨM LÊN MEN
TỪ VI KHUẨN BACILLUS SP. TRONG
THỨC ĂN CHĂN NUÔI THỦY SẢN

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : CN. ĐỖ THỊ TUYẾN
Sinh viên thực hiện
MSSV: 1151110243

: TRẦN THỊ NHỚ
Lớp: 11DSH03

TP. Hồ Chí Minh, 2015


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan những nội dung trong bài đồ án là do tôi thực hiện dưới sự
hướng dẫn trực tiếp của cô CN. Đỗ Thị Tuyến. Tôi cam đoan các kết quả nghiên cứu

Đới luôn dồi dào sức khỏe, đạt được nhiều thành công tốt đẹp trong công việc.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
TP. HCM, ngày 15 tháng 08 năm 2015
Sinh viên thực hiện

Trần Thị Nhớ


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC
Danh mục các chữ viết tắt ............................................................................................ v
Danh mục các hình ......................................................................................................vi
Danh mục các bảng ....................................................................................................vii
Danh mục các sơ đồ ................................................................................................. viii
Danh mục các đồ thị ................................................................................................. viii
Chương 1 MỞ ĐẦU ................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề .............................................................................................................. 1
1.2. Mục đích ................................................................................................................ 2
1.3. Yêu cầu .................................................................................................................. 2
1.4. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................... 2
1.5. Kết cấu của đồ án .................................................................................................. 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................ 3
2.1. Khái quát về vi khuẩn Bacillus sp......................................................................... 3
2.1.1. Phân loại ............................................................................................................. 3
2.1.2. Đặc điểm chung của chi Bacillus ....................................................................... 4
2.1.3. Khả năng tạo bào tử ........................................................................................... 4
2.1.4. Ứng dụng của vi khuẩn Bacillus sp. trong nuôi trồng thủy sản ........................ 6
2.1.5. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm từ vi khuẩn Bacillus sp. ............ 7
2.2. Enzyme protease.................................................................................................... 8

3.4.1. Sơ đồ tổng quan thí nghiệm ............................................................................. 29
3.4.2. Phương pháp phân lập Bacillus sp. .................................................................. 30
3.4.2.1. Hoạt hóa giống Bacillus sp. .......................................................................... 30
3.4.2.2. Phân lập các chủng Bacillus sp ..................................................................... 30
3.4.2.3. Cấy giữ gống Bacillus sp.. ............................................................................ 30
3.4.2.4. Tăng sinh chủng Bacillus sp. ........................................................................ 30
3.4.2.5. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc ......................... 31
3.4.3. Phương pháp định danh bằng đặc điểm sinh lý, sinh hóa ............................... 31
3.4.3.1. Phương pháp nhuộm Gram ........................................................................... 31
3.4.3.2. Test khả năng di động ................................................................................... 33
3.4.3.3. Test catalase .................................................................................................. 33
3.4.3.4. Thử nghiệm khả năng sinh Indol .................................................................. 34
3.4.3.5. Thử nghiệm Methyl Red (MR) ..................................................................... 35
3.4.3.6. Thử nghiệm khả năng sử dụng đường .......................................................... 36

ii


Đồ án tốt nghiệp

3.4.4. Phương pháp xác định hoạt tính sinh học ........................................................ 36
3.4.4.1. Khả năng kháng khuẩn .................................................................................. 36
3.4.4.2. Phương pháp định tính khả năng sinh enzyme protease .............................. 37
3.4.4.3. Phương pháp nuôi cấy trên môi trường bán rắn sinh tổng hợp protease ..... 37
3.4.4.4. Phương pháp thu nhận dịch chiết enzyme protease ..................................... 38
3.4.5.Phương pháp xác định thành phần sinh hóa cơ bản cho trùn quế .................... 38
3.4.5.1. Phương pháp xác định độ ẩm ban đầu .......................................................... 38
3.4.5.2. Phương pháp định lượng khoáng tổng số bằng quang phổ kế ..................... 39
3.4.5.3. Phương pháp xác định đạm tổng số theo phương pháp Kjeldahl (định lượng
Nitơ tổng số) ............................................................................................................... 40

4.2.2. Định tính khả năng sinh enzyme protease ....................................................... 59
4.3. Xác định thành phần sinh hóa cơ bản của trùn quế ............................................ 60
4.4. Kết quả xác định điều kiện tối ưu cho hoạt động của enzyme thu được từ chế
phẩm............................................................................................................................ 61
4.4.1. Kết quả xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của protease ......................... 61
4.4.2. Kết quả xác định pH tối ưu cho hoạt động của protease ................................. 62
4.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên quá trình thủy phân........ 63
4.6. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme bổ sung vào quá trình thủy
phân............................................................................................................................. 65
4.7. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên quá trình thủy phân ................... 67
4.8. Thủy phân trùn quế với các điều kiện tối ưu đã chọn ........................................ 70
4.9. Quy hoạch thực nghiệm ...................................................................................... 71
4.10. Đánh giá hiệu quả sản phẩm ............................................................................. 77
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................... 78
5.1. Kết luận................................................................................................................ 78
5.2. Kiến nghị ............................................................................................................. 79
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 80

iv


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
OD

Optical density

UI



DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình 2.1. Bacillus sp.................................................................................................... 3
Hình 2.2. Quá trình tạo bào tử ..................................................................................... 5
Hình 2.3. Cấu trúc 3D của protease............................................................................. 8
Hình 2.4. Trùn quế ..................................................................................................... 18
Hình 2.5. Trùn quế trong chăn nuôi .......................................................................... 22
Hình 3.1. Mẫu chế phẩm probiotic dùng để phân lập ............................................... 26
Hình 3.2. Chủng Escherichiacoli, Salmonella sp., Staphylococcus aureus – Viện
Sinh Học Nhiệt Đới TP. HCM ................................................................................... 27
Hình 4.1. Hình thái khuẩn lạc phân lập từ các mẫu .................................................. 50
Hình 4.2. Hình ảnh nhuộm Gram của các chủng 1, 5 và 6 ....................................... 52
Hình 4.3. Kết quả thử khả năng di động của chủng 1, 5 và 6 ................................... 53
Hình 4.4. Kết quả thử khả năng tạo catalase của 3 chủng 1, 5 và 6 ......................... 53
Hình 4.5. Kết quả thử nghiệm khả năng sinh indol của 3 chủng 1, 5 và 6 ............... 54
Hình 4.6. kết quả thử nghiệm methyl red của 3 chủng 1, 5 và 6 .............................. 54
Hình 4.7. Kết quả thử khả năng lên men các loại đường của chủng 1 ..................... 55
Hình 4.8. Kết quả thử khả năng lên men các loại đường của chủng 5 ..................... 56
Hình 4.9. Kết quả thử khả năng lên men các loại đường của chủng 6 ..................... 57

vi


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Một số vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp protease ............................ 13
Bảng 2.2. Hàm lượng dinh dưỡng của bột trùn và bột cá ......................................... 22
Bảng 3.1. Thí nghiệm dựng đường chuẩn Tyrosin ................................................... 42
Bảng 3.2. Xác định hàm lượng Tyrosine trong dung dịch nghiên cứu ..................... 42

Sơ đồ 2.1. Sơ đồ phân loại protease........................................................................... 10
Sơ đồ 3.1. Quá trình tiến hành thí nghiệm ................................................................. 29

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ
Đồ thị 4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme chế phẩm ....................... 61
Đồ thị 4.2. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme chế phẩm ............................... 63
Đồ thị 4.3. Kết quả xác định hàm lượng acid amin sau qúa trình thủy phân với nồng
độ cơ chất khác nhau .................................................................................................. 64
Đồ thị 4.4. Kết quả xác định hàm lượng acid amin sau qúa trình thủy phân với nồng
độ enzyme khác nhau ................................................................................................. 66
Đồ thị 4.5. Kết quả xác định hàm lượng acid amin sau qua trình thủy phân với các
mức thời gian khác nhau ............................................................................................ 68

viii


Đồ án tốt nghiệp

Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, các chế phẩm
enzyme sản xuất ngày càng nhiều và được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực của đời
sống con người như: Công nghệp da, công nghiệp thực phẩm, nông nghiệp, chăn
nuôi, y tế,...và là một trong những yếu tố quan trọng trong quá trình thúc đẩy sự phát
triển của ngành chế biến thức ăn thủy sản. Trong những năm gần đây thủy sản đã trở
thành nền kinh tế mũi nhọn ở nước ta, sản lượng thủy sản ngoài đáp ứng nhu cầu tiêu
thụ trong nước mà còn xuất khẩu ra thị trường các nước Châu Âu, Mỹ, Nhật Bản,
Hàn Quốc...Để tăng năng suất và lợi nhuận người nuôi đã tăng mật độ giống, sử dụng
thuốc hóa học để phòng và trị bệnh đã làm xáo trộn hệ sinh học tự nhiên, ô nhiễm
môi trường và thêm vào đó là ảnh hưởng đến chất lượng thủy sản. Với mục đích bảo

1.2. Mục đích nghiên cứu
Chọn lọc được chủng Bacillus sp. có khả năng sinh enzyme protease cao.
Xác định được các điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân trùn quế bằng
enzyme protease để ứng dụng vào chế phẩm lên men từ vi khuẩn Bacillus sp.
1.3. Nội dung nghiên cứu
Phân lập chủng Bacillus sp. từ các chế phẩm thức ăn chăn nuôi thủy sản.
Xác định nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt động của enzyme protease.
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein trùn quế bằng
enzyme protease: nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme và thời gian thủy phân.
So sánh khả năng thủy phân của enzyme protease thương phẩm và enzyme
protease từ chế phẩm lên men vi khuẩn Bacillus sp.
Tối ưu hóa thực nghiệm quá trình thủy phân trùn quế.
1.4. Phương pháp nghiên cứu
Sử dụng các phương pháp như: phương pháp nghiên cứu thực nghiệm, phương
pháp phân tích và xử lý số liệu bằng phần mềm excel 2013 và phần mềm statgraphics.
1.5. Kết cấu của đồ án
Đồ án tốt nghiệp gồm 4 chương:
Chương 1: Mở đầu.
Chương 2: Tổng quan tài liệu.
Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu.
Chương 4: Kết quả và thảo luận.
Chương 5: Kết luận và kiến nghị.

2


Đồ án tốt nghiệp

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Khái quát về vi khuẩn Bacillus sp.

Là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy nghi, có khả năng sinh catalase, bất động
hay di động nhờ tiêm mao, có phổ chịu đựng pH, nhiệt độ, muối rộng, tồn tại được ở
điều kiện bất lợi trong thời gian dài như một số loài ưa lạnh có thể sinh trưởng và
hình thành nội bào tử ở 0oC, pH sinh trưởng rất khác nhau từ 2 – 11 nên đa số chúng
rất phổ biến trong tự nhiên và có thể phân lập từ nhiều nguồn khác nhau như: đất,
nước, thức ăn,…
Hầu hết là vi khuẩn hoại sinh, có mặt khắp nơi trong tự nhiên, phần lớn chúng
cư trú trong đất. Vi khuẩn Bacillus có khả năng sử dụng các hợp chất hữu cơ đơn giản
như đường, amino acid, các acid hữu cơ và có thể chuyển hóa các nguồn carbon như
methanol, cellulose hay lên men các hỗn hợp carbonhydrat tạo glycerol và butanediol.
Các chủng Bacillus được nghiên cứu nhiều do có khả năng tổng hợp được nhiều
loại enzyme ngoại bào như: protease, amylase, cellulose, phytase,... tùy thuộc vào
nguồn cơ chất khác nhau sẽ sinh enzyme khác nhau như nguồn cơ chất là cellulose
thì sẽ sinh tổng hợp enzyme cellulase,...Nhiều trong số các enzyme ngoại bào này là
enzyme thủy phân của các phân tử hữu cơ lớn, chính vì thế vi khuẩn này có nhiều
ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau như công nghệ sản xuất chất tẩy rửa, công
nghiệp thực phẩm, bánh kẹo, đồ uống, công nghệ dược phẩm, công nghệ thuộc da,
công nghệ dệt và trong xử lý chất thải.
2.1.3. Khả năng tạo bào tử
Một trong những đặc điểm quan trọng của Bacillus là khả năng tạo bào tử trong
những điều kiện nhất định. Bào tử không hình thành trong suốt quá trình hoạt động
tăng trưởng và phân chia tế bào, thường khi gặp điều kiện bất lợi về môi trường, thiếu

4


Đồ án tốt nghiệp

dinh dưỡng,…thì nội bào tử mới được hình thành. Bào tử có hình oval và có khuynh
hướng phình ra ở một đầu, do đặc điểm cấu tạo và đặc tính sinh lý nên bào tử được

trưởng của nấm bị ức chế (Nguyễn Lân Dũng, Hoàng Đức Thuận, 1976).
Triển vọng ứng dụng vi khuẩn Bacillus sp. trong nhiều lĩnh vực đời sống, đặc
biệt là trong nuôi trồng thủy sản là rất to lớn. Một số loài thuộc nhóm vi khuẩn
Bacillus như: B. subtilis, B. aterrimus. B. niger, B. pumilis, B. panis, B. vulgarus, B.
nigrificans, B. natto, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. megaterium, B.
mesentericus…đã được ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản với vai trò:


Cải thiện sức khỏe, cung cấp nguồn dinh dưỡng trực tiếp và hỗ trợ tiêu hóa.



Tăng cường các phản ứng miễn dịch và cải thiện môi trường nước như phân

hủy các chất thải hữu cơ, giảm chất độc NH3 và H2S, giảm chất dư thừa tích tụ ở đáy
ao, giảm phát sinh khí độc và mùi hôi.


Ức chế các tác nhân gây bệnh bằng cách tiết ra các chất kháng sinh, cạnh tranh

dinh dưỡng và môi trường sống.


Khả năng sinh các enzyme phân hủy các hợp chất hữu cơ và kiểm soát sự phát

triển quá mức của vi sinh vật gây bệnh (như vi khuẩn Vibrio) giữ cho môi trường luôn
ở trạng thái cân bằng là đặc tính nổi trội của nhóm vi khuẩn này.
Trong quá trình hình thành bào tử, Bacillus thường sản sinh ra các hoạt chất có
hoạt tính sinh học và ứng dụng được trong nhiều lĩnh vực. Verschuere (2000) đã
nghiên cứu và công bố vi khuẩn Bacillus sp. đóng vai trò quan trọng trong việc cải

cơ trong bể nuôi tôm sú đã được nghiên cứu. Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức bổ sung
3 loài vi khuẩn Bacillus bao gồm Bacillus B8, B37 và B38 với mật độ 105 CFU/ml
và 1 đối chứng (không bổ sung vi khuẩn). Kết quả cho ta thấy tỉ lệ sống ở nghiệm
thức B37 cao nhất (93,33 ± 1,65%), còn đối chứng thấp nhất (69,52 ± 1,65%) (p

loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp protease như: Bacillus subtilis, Bacillus cereus,
Streptomyces griseus, Streptomyces rimosus,…và một số loài nấm mốc: Aspergillus
oryzae, Aspergillus niger…(Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Cơ chất của tất cả các loại protease là các phân tử protein gồm nhiều các amino
acid nối với nhau bằng liên kết peptide tạo nên một hay nhiều chuỗi polypeptide có
cấu trúc rất phức tạp và chúng phân giải các liên kết peptide tạo các acid amin đơn
giản, dễ hấp thu. Các nguồn giàu protein như: thịt động vật, cá, trứng, đậu tương…

9


Đồ án tốt nghiệp

2.2.2. Phân loại protease (Trần Thị Nhã Uyên, 2010)
Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4).
Peptidase (Protease)
(E.C.3.4)

Exopeptidase
(E.C. 3.4.11-17)

Endopeptidase
(E.C. 3.4.21-99)
Serine proteinase

Aminopeptidase

Cystein proteinase
Aspartic proteinase


rộng.
 Aspartic proteinase: hầu hết các Aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin.
Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin,
renin. Các Aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt
động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính.
 Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi
khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các Metallo proteinase
thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của
EDTA.
 Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:
 Protease acid: pH = 2 – 4 được ứng dụng trong sản xuất bia và công nghiệp
bánh kẹo.
 Protease trung tính: pH = 7 – 8 chúng thường được sản xuất từ các loài vi
khuẩn như Bacillus subtilis, Bacillus thermoproteolyticus.
 Protease kiềm: pH = 9 – 11, trong trung tâm hoạt động của các enzyme
protease này có serin.
Nhưng tác dụng tối ưu của protease còn phụ thuộc vào bản chất của cơ chất. Vì
cùng một protease của cùng một chủng vi khuẩn khi thủy phân casein, hemoglobin
hay gelatin sẽ thể hiện hoạt độ cực đại ở những giá trị pH khác nhau.

11


Đồ án tốt nghiệp

 Dựa vào nguồn thu nhận enzyme:
 Protease động vật: có trong tụy tạng (đây là nguồn enzyme sớm nhất, lâu dài
nhất và có chứa nhiều enzyme nhất) và dạ dày bê.
 Protease thực vật: có 3 loại protease thực vật như Bromelain (thu từ quả, chồi
và vỏ dứa), Papain (có trong nhựa của lá, thân, quả đu đủ) và Ficin (thu được

hóa các hợp chất hữu cơ thành dạng vô cơ (NH 3) (trích Nguyễn Thị Ngọc Huyền,
2012).

12


Đồ án tốt nghiệp

Protease nội bào thì cho đến nay còn đang được nghiên cứu và cũng chưa biết
rõ vai trò của chúng trong tế bào. Theo Hiroishi (1976), các protease nội bào có thể
có vai trò quan trọng hơn protease ngoại bào, chúng có thể hoàn thành một số chức
năng như phân giải các peptide được đưa từ môi trường ngoài vào để hình thành các
acid amin và để tổng hợp protein trong tế bào hoặc đôi khi dùng làm nguồn C, N, S.
Tham gia trong quá trình cải tiến một số phân tử protein, enzyme, điều này có thể có
nghĩa đối với việc hình thành và nảy mầm của bào tử vi sinh vật. Protease nội bào
cũng có thể tham gia trong việc hoàn thiện chuỗi polypeptide đã được tổng hợp
(Waller, 1963 ; Pine, 1969). Ngoài ra, protease nội bào cũng có thể có tác dụng phân
huỷ các protein vô dụng tổng hợp sai do đột biến, hoặc cũng có thể tham gia vào quá
trình sinh trưởng của vi sinh vật (trích dẫn bởi Lê Minh Cẩm Ngọc, 2005).
Bảng 2.1. Một số vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp protease
Vi khuẩn

Xạ khuẩn

Nấm mốc

Bacillus subtilis

Streptomyces grisus


Cl. histoluticum

Rhizopus niveus

Cl. porogens
(Nguyễn Đức Lượng, 2002)
2.2.4. Môi trường và phương pháp nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp Protease
Cần phải chọn môi trường vì thành phần môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng
trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Trong thành phần
môi trường phải có đủ các chất đảm bảo được sự sinh trưởng bình thường của vi sinh
vật và tổng hợp enzyme.
Đặc biệt lưu ý là để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào hiện
tượng cảm ứng. Vì nếu như trong thành phần môi trường có các chất cảm ứng thì chất

13


Đồ án tốt nghiệp

đó hay sản phẩm phân giải của nó sẽ kìm hãm hoặc làm yếu tác dụng phong toả của
chất kìm hãm nhằm bảo đảm khả năng sinh tổng hợp enzyme đã cho không bị cản
trở. Chất cảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi trường nuôi thường là cơ chất
tương ứng của enzyme cần tổng hợp.
Thành phần chính của môi trường: C, N, H, O. Ngoài ra các chất vô cơ: Mn,
Ca, P, S, Fe, K và các chất vi lượng khác.
Về phương pháp nuôi cấy hiện nay người ta thường dùng hai phương pháp sau:
 Nuôi cấy bề mặt
Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo điều kiện cho vi sinh vật phát
triển trên bề mặt môi trường. Sử dụng môi trường nuôi dạng rắn hoặc bán rắn hay
trên bề mặt dạng lỏng.