B GIÁO DC VÀ ÀO TO
TRNG I HC M TP.HCM

BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP

Tên đ tài:
NGHIÊN CU TI U HÓA QUY TRÌNH THY
PHÂN CÁ TP  SN XUT CH PHM SINH HC
S DNG LÀM THC N CHO CÁ LÓC
BNG PHNG PHÁP QUY HOCH THC NGHIM KHOA CÔNG NGH SINH HC
Chuyên ngành: Vi sinh – Sinh hc phân t

GVHD: Ths. Nguyn Vn Minh
SVTH: ng Hoàng Nhân
MSSV: 1053010516
Khóa: 2010 - 2014

Bình Dng, tháng 5, 2014

LI CM N

Li đu tiên, con bày t lòng bit n sâu sc nht cho ba m đã nuôi nng, dy d
con cho đn ngày hôm nay và đã đng viên, giúp đ con rt nhiu trong thi gian
con thc hin đ tài thc tp này. Em xin cm n anh đã giúp đ em trong sut thi
gian thc tp.
Em xin cm n thy cô Khoa Công ngh Sinh hc, trng i hc M Thành ph
H Chí Minh đã tn tâm ging dy cho em ging dy cho em trong sut nhng nm
hc va qua.

PTN Phòng thí nghim
TP.HCM Thành Ph H Chí Minh
tr. trang
TTH trung tâm hot đng
VK vi khun
VSV vi sinh vt
Ting Anh
BOD Biochemical oxygen Demand
CFU Colony forming unit
COD Chemical oxygen Demand
NA Nutrient Agar
NB Nutrient Broth
NCBI the National Central for Biotechnology Information
No. number
pp. page
RSM Response Surface Methods
Vol. Volume

ii
SVTH: NG HOÀNG NHÂN
DANH MC
DANH MC HÌNH
Hình 1.1. Cá lóc đen Channa striata 5
Hình 1.2. Bacillus di kính hin vi đin t 17
Hình 1.3. Thit k CCD vi 4 đim góc (cube point), 4 đim dc trc và 5 ln lp
li ti đim thí nghim trung tâm (0, 0) 32
Hình 1.4. Ma trn b trí thí nghim theo thit k Box – Behnken 33
Hình 1.5. Màn hình làm vic ca phn mm Minitab 16 35
Hình 3.1. i th (a) và vi th (×100) (b) ca chng B. polyfermenticus F27 60
Hình 3.2. i th (a) và vi th (×100) (b) ca chng Bacillus subtilis Q111 61

amin ngày 5 ca các nghim thc trong thí nghim kho sát nhit đ kh trùng
nguyên liu cá tp 98
Hình ph lc 4a. Thông tin mô hình hi quy ca thí nghim xác đnh yu t nh
hng 100
Hình ph lc 4b. Kt qu phân tích phng sai ca thí nghim xác đnh yu t
nh hng 100
Hình ph lc 6a. Thông tin mô hình hi quy ca thí nghim khi du 102
Hình ph lc 6b. Kt qu phân tích phng sai ca thí nghim khi du 102
Hình ph lc 7a. Thông tin mô hình hi quy ca thí nghim b mt ch tiêu cho
hàm đm axit amin 103
Hình ph lc 7b. Kt qu phân tích phng sai ca thí nghim b mt ch tiêu cho
hàm đm axit amin 103
Hình ph lc 8a. Thông tin mô hình hi quy ca thí nghim b mt ch tiêu cho
hàm mt đ VSV 104
Hình ph lc 8b. Kt qu phân tích phng sai ca thí nghim b mt ch tiêu cho
hàm mt đ VSV 104
iv
SVTH: NG HOÀNG NHÂN
DANH MC
DANH MC BNG
Bng 1.1. Thit k thí nghim Plackett – Burman vi 11 yu t 27
Bng 2.1. Bng b trí thí nghim kho sát nhit đ kh trùng 53
Bng 2.2. Giá tr các bin s trong thí nghim xác đnh yu t nh hng đn quá
trình thy phân theo thit k Plackett – Burman 54
Bng 3.1. c đim đi th và vi th ca 2 chng vi khun th nghim 60
Bng 3.2. So sánh mt đ vi sinh vt các nghim thc trong thí nghim kho sát
nhit đ kh trùng 65

trong phm vi kho sát 71
 th 3.7. Hàm mc tiêu vi 2 yu t pH và mt đ VK ban đu trong phm vi
kho sát 72
 th 3.8. Mc đ nh hng ca ba yu t kho sát trong thí nghim khi đu
74
 th 3.9. ng mc (bên trái) và b mt đáp ng (bên phi) ca tng cp yu
t nh hng đn quá trình thy phân 80
 th 3.10. ng mc (bên trái) và b mt đáp ng (bên phi) ca tng cp yu
t nh hng đn mt đ VSV sau quá trình thy phân 82
 th ph lc 3a. nh hng chun hóa ca 4 yu t kho sát đi vi nng đ
đm axit amin ca thí nghim xác đnh yu t nh hng 99
 th ph lc 3b. Pareto ca 4 yu t kho sát đi vi nng đ đm axit amin
ca thí nghim xác đnh yu t nh hng 99
 th ph lc 5a. nh hng chun hóa ca 3 yu t kho sát đi vi nng đ
đm axit amin ca thí nghim khi đu 101
 th ph lc 5b. Pareto ca 3 yu t kho sát đi vi nng đ đm axit amin
ca thí nghim khi đu 101

vi
SVTH: NG HOÀNG NHÂN

MC LC
T VN  1
PHN 1. TNG QUAN TÀI LIU 4
1.1. Tình hình nuôi cá lóc ti Vit Nam 5
1.1.1. Gii thiu cá lóc Channa striata 5
1.1.2. Lch s ngh nuôi cá lóc 8
1.2. Các vn đ hin nay 9
1.2.1. Thiu ht ngun thc n t nhiên 9
1.2.2. Vn đ ca ngun thc n công nghip 9

2.5. Phng pháp xác đnh mt đ vi sinh vt 40
2.5.1. Xác đnh trc tip mt đ bng phng pháp đm trên bung đm hng
cu 40
2.5.2. Xác đnh gián tip s lng t bào bng cách đm s lng khun lc
41
2.6. Các phng pháp đnh lng đm 42
2.6.1. nh lng nit tng s bng phng pháp Kjeldahl 42
2.6.2. nh lng đm formol phng pháp chun đ formol (Phng pháp
Sörensen) 44
2.6.3. nh lng đm amoniac bng phng pháp ct kéo hi nc 45
2.6.4. nh lng đm axit amin 47
2.7. Quan sát đi th và vi th ca 2 chng vi khun th nghim 47
2.7.1. Quan sát đi th 47
2.7.2. Quan sát vi th bng phng pháp nhum Gram 47
2.8. Thí nghim kh nng sinh protease ca 2 chng th nghim 48
2.8.1. Nguyên lý 48
2.8.2. Chun b 49
2.8.3. Tin hành 49
2.8.4. c kt qu 49
2.9. Thí nghim kh nng đi kháng vi vi khun gây bnh trên cá lóc ca 2
chng th nghim 50
2.9.1. Nguyên lý 50
2.9.2. Chun b 50
viii
SVTH: NG HOÀNG NHÂN
MC LC
2.9.3. Tin hành 50
2.9.4. c kt qu 50
2.10. Thí nghim kh nng tng thích gia 2 chng th nghim 51
2.10.1. Nguyên lý 51

3.2. Thí nghim kh nng sinh enzym protease ca 2 chng vi khun thí nghim
61
3.3. Thí nghim kh nng đi kháng vi vi khun gây bnh trên cá lóc ca 2
chng vi khun th nghim 62
3.4. Thí nghim tng thích gia 2 chng vi khun thí nghim 63
3.5. Thí nghim kho sát nhit đ kh trùng nguyên liu cá tp 64
3.6. Thí nghim xác đnh yu t nh hng 68
3.7. Thí nghim khi đu 72
3.8. Thí nghim b mt ch tiêu 76
3.8.1. Kt qu thí nghim b mt ch tiêu 76
3.8.2. Ti u hóa 79
PHN 4. KT LUN VÀ  NGH 86
4.1. Kt lun 87
4.2.  ngh 87
TÀI LIU THAM KHO 88
PH LC 94
x
SVTH: NG HOÀNG NHÂN

có th giúp gii quyt các vn đ trên. Dch cá tp sau khi đc phân hy bng vi
sinh vt đc cho vào thc n công nghip nhm b sung đm và các cht khoáng t
nhiên cn thit tng t nh vic nuôi bng cá tp s hn ch xut hin d tt  cá.
Vi sinh vt khi vào môi trng nc ao nuôi và h tiêu hóa ca cá s đóng vai trò
probiotic giúp tng cng h min dch cho cá, cnh tranh vi sinh vt có hi và x lý
2
SVTH: NG HOÀNG NHÂN
T VN 

nc ao nuôi (Phm Th Tuyt Ngân, 2011). Hn na dch cá thy phân còn có kh
nng kích thích s thèm n và bt mi ca cá. (Trn Th Bé, 2011)
Ngun ph phm, cá thi ra t các ch, xí nghip ch bin thy sn rt di dào,
giá thành r, giàu dinh dng đã đc nghiên cu và ng dng nhiu đ sn xut
dch đm, bt đm làm thc n thy sn, gia súc, phân bón và nc mm (Trn Th
Hng Nghi và cng s, 2009). Phng pháp x lý ngun ph phm này bng các
bin pháp sinh hc cng đang rt đc quan tâm, đc bit là s dng enzym thy
phân đ thu hi protein to ra nhng sn phm có nhiu công dng và giá tr dinh
dng cao. (Gao và cng s, 2005)
Nh vy vic dùng vi sinh vt đ thy phân ngun ph phm ch bin thy sn có
nhiu tim nng ng dng và li đim nh trên. Do đó, chúng tôi quyt đnh thc
hin đ tài “Nghiên cu ti u hóa quy trình thy phân cá tp đ sn xut ch
phm sinh hc s dng làm thc n cho cá lóc bng phng pháp quy hoch
thc nghim”
 Ni dung đ tài
- nh tính kh nng sinh enzyme protease ca 2 chng Bacillus subtilis Q111 và
Bacillus polyfermenticus F27 cung cp t PTN Công ngh vi sinh trng i hc
M TP.HCM.
- Kho sát kh nng kháng vi sinh vt gy bnh trên cá lóc ca 2 chng vi khun
thí nghim.
- Kho sát kh nng tng tích ca 2 chng vi khun thí nghim.

Vì vy, cá lóc đen đc chn làm đi tng nghiên cu chính ca đ tài. (Lê Xuân
Sinh và  Minh Chung, 2009)
1.1.1.2. Phân loi cá lóc đen
Theo d liu ca NCBI, cá lóc đen có tên ting Anh là Snakehead murrel, mt s
tên khác là Ophiocephalus striatus, Ophiocephalus vagus, Snakehead fish và có
phân loi:
Ngành: Chordata
Lp: Actinopterygii
B: Perciformes
H: Channidae
Chi: Channa
Loài: Channa striata

Hình 1.1. Cá lóc đen Channa striata (Bloch, 1793)
5
SVTH: NG HOÀNG NHÂN
TNG QUAN TÀI LIU
1.1.1.3. Phân b
Trên th gii: chúng tìm thy  các khu vc nhit đi châu Á tri dài t Pakistan
đn min nam Trung Quc, đc bit là Trung Quc, Triu Tiên, Sri Lanka, Vit
Nam.
Ti Vit Nam: cá lóc đen phân b trên c ba min. (S Nông nghip và Phát trin
nông thôn tnh Tha Thiên Hu, 2011)
1.1.1.4. c đim hình thái
C th hình lng tr, đu dp, đuôi tròn. u bt so vi thân, tng đi nhn và
dài ging nh đu rn, gãy khúc, ming có đ rng, vy rt ln. Vây lng có 40 – 46
vây, vây hu môn có 28 – 30 tia vây, vy đng bên 41 – 55 cái. Vy to vân màu
nâu xám xen ln vi nhng ch màu xám nht. Lng và hai bên hông sm màu đen
ánh nâu vi nhng đm đen và màu gch, bng màu trng. Lc mang dng hình
núm. Thc qun ngn, vách dày, bên trong thc qun có nhiu np nhn. D dày to

thy cá chim 63,01%, tép 35,94%, ch nhái 1,03% và 0,02% là b go, côn trùng
và mùn bã hu c. (Dng Nht Long, 2003)
1.1.1.7. c đim sinh trng
Theo Dng Nht Long (2003), cá tng trng tng đi nhanh, khi nhit đ
trên 20
O
C tng trng nhanh, di 15
O
C tng trng chm. Con ln nht nng đn
5 kg. Trng lng trung bình theo tui (con đc và cái chênh lch ln):
• Cá 1 tui thân dài 19 – 39 cm nng 95 – 760 g.
• Cá 2 tui thân dài 38,5 – 40 cm, nng 625 – 1.395 g.
• Cá 3 tui thân dài 45 – 59 cm, nng 1.467 – 2.031 g.
Theo S NN & PTNT tnh Tha Thiên Hu,  giai đon nh, cá tng ch yu v
chiu dài. Cá càng ln thì s tng trng càng nhanh.
• Trong t nhiên, sc ln ca cá không đu, ph thuc vào thc n sn có trong
thy vc, do vy t l sng trong t nhiên ca cá thp.
• Trong ao nuôi, có thc n đy đ và chm sóc tt thì t l sng ca cá cao và
đt trng lng trung bình 0,5 – 0,8 kg/con sau 6 – 8 tháng.
1.1.1.8. c đim sinh sn
Cá lóc 1 – 2 tui bt đu đ trng, mùa v sinh sn t tháng 4 – 8, tp trung vào
tháng 4 – 5. Cá thng đ vào sáng sm sau nhng trn ma rào mt hai ngày ni
yên tnh có nhiu thc vt thy sinh.  nhit đ 20 – 35
O
C, sau 3 ngày trng n
thành cá bt, khong 3 ngày sau cá tiêu ht noãn hoàng và bt đu n đc thc n
t nhiên bên ngoài, luân trùng Brachionus plicatilis đc xem là thc n đu tiên tt
nht ca cá bt. Ngoài ra, có th cho cá bt n nm men, lòng đ trng hay thc n
tng hp dng bt. Giai đon k tip cá n trng nc (Moina – Daphnia), trùng ch
7

8
SVTH: NG HOÀNG NHÂN
TNG QUAN TÀI LIU
1.2. Các vn đ hin nay
1.2.1. Thiu ht ngun thc n t nhiên
Ngh nuôi cá lóc phát trin rm r dn đn ngun thc n t nhiên cho cá b thiu
ht. Ti BSCL, lúc khi phát thng da vào li th mùa l, tn dng ngun thc
n cung cp ch yu t các loài cá tp. Dn dn ngh nuôi phát trin nhiu nên gây
ra không ít lo ngi nuôi cá lóc dn ti đe da các ging loài thy sn khác. Ngi
nuôi mun thu 1 kg cá lóc cn tiêu tn ti 4 – 4,5 kg cá tp. Vi tng sn lng cá
lóc nuôi trong vùng 30.000 tn/nm thì phi s dng ti 50.000 tn cá tp nc ngt
và 75.000 tn cá tp bin, tng ng vi 30% sn lng khai thác ni đa và chim
12% sn lng khai thác hi sn hng nm ca BSCL. ó tht s là vn đ ln
đáng lo ngi đi vi ngun li thy sn và an ninh thc phm cho cng đng. (Hu
c, 2011)
1.2.2. Vn đ ca ngun thc n công nghip
 khc phc tình trng thiu ngun thc n t nhiên, ngi dân đã chuyn sang
ngun thc n công nghip di dào và n đnh. Nhng cá lóc nuôi bng thc n
công nghip có sc đ kháng kém hn và xut hin nhiu d tt. Khi nuôi bng thc
n công nghip, li xy ra hin tng cá lóc b gù lng do ngun thc n thiu
khoáng cht, ngun nc b ô nhim. Thc trng trên đã làm nhiu h nuôi cá lóc
phi b ngh vì thua l. (Nguyn Kim Kiu, 2012)
Hin ti trên th trng cha có loi thc n công nghip chuyên dùng cho nuôi
cá lóc, nhng vì cá lóc là loài n thc n thiên v đng vt, nên nông dân thng
mua loi thc n có hàm lng đm khong 40% cho cá lóc n, hy vng đáp ng
đy đ nhu cu dinh dng cho cá. Theo kinh nghim ca nông dân An Giang, nuôi
cá lóc  giai đon ging thì s dng thc n viên công nghip có đ đm khong
43%, sau hai tháng thì hàm lng đm gim dn. Cá đc 3 – 4 tháng tui thì cho cá
n thc n có đ đm chng 40% là cng đ cho sinh trng và phát trin. Loi cám
có đ đm cao có giá thành cao hn nhiu so vi các loi cám khác dn đn gim

đng, tn d các cht đc trong sn phm thu sn gây hi cho ngi tiêu dùng, làm
gim giá tr thng phm và còn to các chng vi khun kháng thuc làm gim hiu
qu trong điu tr bnh. (Trnh Ngc Tun, 2005)
Thành phn lp bùn trong các đm, ao NTTS ch yu là các cht hu c nh
protein, lipid, axit béo vi công thc chung CH
3
(CH
2
)
n
COOH , photpholipid, sterol -
vitamin D3, các hormone, carbohydrate, cht khoáng và vitamin, v tôm lt xác,
Lp bùn này luôn  trong tình trng ngp nc, ym khí, các vi sinh vt ym khí
phát trin mnh phân hu các hp cht trên to thành các sn phm là hydrosulphua
10
SVTH: NG HOÀNG NHÂN
TNG QUAN TÀI LIU
(H
2
S), amoniac (NH
3
), metan (CH
4
), rt có hi cho thu sinh vt, ví d nng đ
1,3 ppm ca H
2
S có th gây sc, tê lit và thm chí gây cht tôm. Khí amoniac
(NH
3
) cng đc sinh ra t quá trình phân hu ym khí thc n tn d gây đc trc


11
SVTH: NG HOÀNG NHÂN
TNG QUAN TÀI LIU
 Cht lng thc n kém
Cht lng thc n kém (thc n công nghip và thc n ti sng) không đm
bo dinh dng cho cá s to môi trng thun li cho các tác nhân gây bnh phát
trin và d lng thc n lu tn nn đáy s làm ô nhim nc ao.
 Thiu cn thn khi chm sóc cá
Các dng c cho n không đc v sinh thng xuyên là ni n cha mm bnh.
Các dng c vn chuyn, bt cá nh li vt, thùng… có th làm xây xát cá trong
quá trình thao tác và vì th mm bnh có điu kin xâm nhp vào cá nuôi.
 Ngun ging th kém cht lng
Cá có th đã b mc bnh t ngun ging th nuôi, cha đc c quan chuyên
môn kim tra cht lng, con vt mang sn mm bnh mà cha đc x lý dit
trùng, khi cá th xung nuôi sau mt thi gian gp thi tit thay đi s thun li cho
mm bnh phát trin.
1.3. Các phng pháp gii quyt
Khi ngun thc n cá tp t nhiên ngày càng khan him cùng vi nhn thc v
nhng h qu có th xy qua khi khai thác quá mc ngun thc n này, thc n công
nghip tr thành ngun dinh dng chính cho cá lóc. Tuy nhiên, vì nhng khuyt
đim ca thc n công nghip đã nêu trên nên cn phi có mt loi ch phm b
sung vào đ vic nuôi cá lóc đt hiu qu và kinh t. Ch phm này s đóng vai trò
làm ngun dinh dng, ngun khoáng cht b sung, cht dn d kích thích bt mi
đng thi phi góp phn ci thin môi trng ao nuôi và tng sc đ kháng cho cá.
1.3.1. Cht dn d
1.3.1.1. Axit amin t do
Nhiu nghiên cu s dng hn hp các axit amin riêng l hoc kt hp đ kích
thích s bt mi ca cá. Taurine, glycine, methionine, glutamine, leucine đc s
dng đ kích thích quá trình bt mi ca tôm, cá. Nhiu nghiên cu khoa hc cho

T “Probiotic” xut phát t ting Hy lp, có ngha là “cho s sng”. Lilley và
Stillwell (1965) đã dùng thut ng này đ mô t nhng cht đc bài tit ra t mt
sinh vt nào đó mà có tác dng kích thích tng trng cho mt sinh vt khác. Nm
1974, Paker đã đnh ngha probiotic là các sinh vt và các hp cht góp phn vào s
cân bng vi sinh h trong h thng tiêu hóa. Sau đó Fuller (1989) đã chnh sa và
13
SVTH: NG HOÀNG NHÂN
TNG QUAN TÀI LIU
đnh ngha li vi probiotic là s b sung mt loi thc n vi sinh vt sng mà có
tác dng có li cho vt ch qua vic ci tin s cân bng vi sinh h trong đng rut
ca vt ch. Mc đích ca vic áp dng probiotic là nhm đ thit lp li mi quan
h gia các vi sinh vt có li và c hi cu thành h vi sinh vt trong đng rut.
Mt loi probiotic có hiu qu là phi có kh nng tn ti và hot đng trong mt
môi trng đa dng di nhiu hình thc khác nhau. Theo Fuller (1989) thì nó cn
phi có nhng kh nng nh sau:
 Là mt sn phm sng  quy mô k ngh.
 Không mang mm bnh và đc t.
 To ra tác dng có li trên vt ch.
 Có kh nng tn ti và phát trin trong môi trng rut ca vt ch.
 Duy trì n đnh và tn ti lâu dài đ đc s dng sau này trong điu kin lu
tr và điu kin ngoài hin trng.
1.3.2.2. Vai trò ca probiotic trong nuôi trng thy sn
 Vai trò ci thin cht lng nc trong nuôi trng thy sn
Probiotic giúp ci thin cht lng nc trong ao nuôi thy sn, nh kh nng
tham gia chuyn hóa các cht hu c trong ao ca các vi khun trong probiotic.
Trong mt s nghiên cu, cht lng nc đã đc ci thin khi b sung probiotic,
đc bit là Bacillus sp Vì Bacillus sp. hiu qu hn trong vic chuyn đi các cht
hu c ti CO
2
hn so vi vi khun Gram âm, s chuyn đi mt t l ln carbon