i

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN THỊ THÙY LINH

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG
LACTOBACILLUS, BACILLUS VÀ RHODOSPIRILLACEAE
DÙNG ĐỂ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC CẢI THIỆN
MÔI TRƢỜNG NƢỚC NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN – 2015
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




ii

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN THỊ THÙY LINH

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG
LACTOBACILLUS, BACILLUS VÀ RHODOSPIRILLACEAE
DÙNG ĐỂ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC CẢI THIỆN
MÔI TRƢỜNG NƢỚC NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

iv

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu,
kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công
bố trong bất kì công trình nào khác.
Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã đƣợc
ghi rõ nguồn gốc.

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Thùy Linh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




v

LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập và nghiên cứu tại lớp Cao học công nghệ sinh
học trường đại học Khoa Học, tôi đã nhận được sự giúp đỡ, giảng dạy nhiệt tình
của các thầy giáo, cô giáo trong nhà trường. Nhân dịp này tôi xin bày tỏ lời cảm
ơn chân thành tới tập thể các thầy giáo, cô giáo; đặc biệt là các thầy, cô trong
bộ môn Khoa học sự sống, Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên
Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các thầy hướng dẫn khoa học
là PGS. TS Lương Thị Hồng Vân và TS. Trần Đức Hạnh – CTHĐQT công ty cp
thuốc thú y Đức Hạnh Marphavet đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá
trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn.


: Bào tử

4. KL

: Khuẩn lạc

5. TH

: Thu hồi

6. LM

: Lên men

7. CFU

: Đơn vị khuẩn lạc

8. CP

: Chế phẩm

9. CTV

: Cộng tác viên

10.OD

: Mật độ quang

3. Nội dung nghiên cứu ......................................................................................... 2
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 3
1.1. Tình hình phát triển nghề nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam ........................... 3
1.1.1. Hiện trạng nuôi trồng và dịch bệnh trong hoạt động nuôi trồng thủy sản .. 4
1.1.2. Hiện trạng sử dụng chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy sản ............. 5
1.2. Giới thiệu chung về Probiotic ....................................................................... 6
1.2.1. Định nghĩa probiotic ................................................................................... 6
1.2.2. Vai trò của probiotic.................................................................................... 8
1.2.3. Những nhóm vi sinh vật thƣờng đƣợc sử dụng trong sản xuất probiotic ... 9
1.2.4. Vi khuẩn Bacillus ...................................................................................... 11
1.2.5. Vi khuẩn Lactobacillus ............................................................................. 14
1.2.6. Vi khuẩn quang hợp tía ............................................................................. 18
1.2.7. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh trƣởng và phát triển của vi
khuẩn. .................................................................................................................. 20
1.3. Đặc điểm và những chỉ số cơ bản đánh giá nƣớc nuôi trồng thủy sản ........ 21
1.3.1. Đặc điểm nƣớc nuôi tôm cá ...................................................................... 21
1.3.2. Những chỉ số cơ bản đánh giá nƣớc nuôi tôm cá ..................................... 22
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




viii

1.3.3. Yêu cầu về nƣớc nuôi tôm cá .................................................................... 24
1.4. Các bệnh thƣờng xảy ra cho tôm khi ao nuôi bị nhiễm bẩn ........................ 25
1.5. Ứng dụng Chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy sản ............................ 27
1.6. Một số sản phẩm probiotic dùng trong chăn nuôi thủy sản trên thị trƣờng
hiện nay ............................................................................................................... 29
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 31

phẩm .................................................................................................................... 55
3.3.1. Tạo chế phẩm dạng dịch và dạng bột ........................................................ 55
3.3.2. Thử an toàn với động vật thí nghiệm ........................................................ 57
3.3.3. Kỹ thuật bảo quản chế phẩm ..................................................................... 58
3.4. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và quy trình kiểm nghiệm chế phẩm ................ 59
3.5. Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm........................................................ 62
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................. 67
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 68

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




x

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các loài vi khuẩn sử dụng để xử lý môi trƣờng ................................. 11
Bảng 1.2: Sự sắp xếp của các chi Lactobacillus ................................................. 15
Bảng 1.3: Một số đặc điểm của vi khuẩn tía ....................................................... 19
Bảng 1.4: Ảnh hƣởng của pH đến sự sinh trƣởng và phát triển của tôm cá ....... 23
Bảng 1.5: Một số chỉ tiêu của nƣớc nuôi trồng thủy sản [5] ............................... 25
Bảng 1.6: Các thông số môi trƣờng thích hợp cho tôm sú thâm canh [2] .......... 25
Bảng 3.1. Kiểm tra khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh tôm cá ............. 39
Bảng 3.2. Khả năng sinh enzym phân hủy hữu cơ của vi khuẩn ........................ 40
Bảng 3.3: Khả năng sinh trƣởng (theo tích lũy sinh khối OD660) của chủng vi
khuẩn tía Rhodopseudomonas palustris trong các nguồn nƣớc thải................... 41
Bảng 3.4: Thành phần môi trƣờng nhân giống Bacillus thích hợp ..................... 42
Bảng 3.5: Nhiệt độ nhân giống Bacillus thích hợp ............................................. 43
Bảng 3.6: Tỷ lệ giống thích hợp .......................................................................... 43

Bảng 3.28: Kết quả thử độc tính cấp của chế phẩm bột...................................... 57
Bảng 3.29: Kết quả thử độc tính cấp của chế phẩm lỏng.................................... 57
Bảng 3.30: Bảo quản chế phẩm dạng dịch .......................................................... 58
Bảng 3.31: Bảo quản chế phẩm dạng bột............................................................ 59
Bảng 3.32: Tóm tắt các tiêu chuẩn chế phẩm ..................................................... 59
Bảng 3.33: Định tính của chế phẩm theo TCVN 2011 ....................................... 60

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




xii

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Tế bào Bacillus subtilis ....................................................................... 12
Hình 1.2. Tế bào Bacillus licheniformis ............................................................. 13
Hình 1.3. Tế bào Bacillus amyloliquefaciens ..................................................... 13
Hình 3.1: Khả năng chịu mặn của các chủng vi khuẩn ....................................... 40
Hình 3.2: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sinh trƣởng của R.palustris RD ............ 46
Hình 3.3: Sơ đồ quy trình nhân giống ................................................................. 47
Hình 3.4: Sơ đồ quy trình lên men chìm và lên men trên môi trƣờng xốp ......... 54
Hình 3.5: Quy trình kiểm nghiệm chế phẩm ....................................................... 61
Hình 3.6: Quy trình sản xuất chế phẩm .............................................................. 63
Hình 3.7: Hệ thống lên men sục khí hãng Sartorius – Đức ................................ 65

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




trong ao, vi phạm vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm, gây khó khăn trong việc
xuất khẩu thủy sản trên thị trƣờng thế giới.


2

Vì vậy, việc xử lý môi trƣờng trong quá trình nuôi nhằm cải thiện môi
trƣờng nƣớc và phòng ngừa dịch bệnh là cấp thiết. Một trong những giải pháp
quan trọng là sử dụng chế phẩm sinh học có chứa các vi sinh vật mang những
đặc tính hữu ích ( phân hủy hữu cơ, đối kháng với vi khuẩn gây bệnh…) để xử
lý môi trƣờng, tăng khả năng phòng bệnh của vật nuôi đã đƣợc nhiều nƣớc trên
thế giới áp dụng.
Tuy nhiên, các chế phẩm sinh học, thuốc thú y thủy sản trên thị trƣờng
hiện nay chủ yếu là chế phẩm nhập khẩu từ nƣớc ngoài, có giá thành khá cao,
cách sử dụng phức tạp ( thƣờng phải hoạt hóa trƣớc khi sử dụng) nên gây tâm lý
ngại sử dụng cho ngƣời dân.
Từ những cơ sở lý luận về thực tiễn nói trên, chúng tôi tiến hành đề tài:
“Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng Lactobacillus, Bacillus và
Rhodospirillaceae dùng để sản xuất chế phẩm sinh học cải thiện môi trường
nước nuôi trồng thủy sản ”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Tuyển chọn đƣợc các chủng vi khuẩn thuần chủng có hoạt tính sinh
enzym phân giải hữu cơ, sinh chất kháng khuẩn và khử H2S dùng để sản xuất
chế phẩm sinh học.
- Tạo ra chế phẩm sinh học có chất lƣợng tốt để cải thiện, xử lý môi
trƣờng nƣớc nuôi thủy sản.
3. Nội dung nghiên cứu
- Tuyển chọn chủng vi khuẩn có đặc tính và tính chất phù hợp để sử dụng
sản xuất chế phẩm sinh học xử lý môi trƣờng nƣớc nuôi trồng thủy sản.
- Xác định đƣợc các điều kiện tối ƣu trong lên men sản xuất chế phẩm.

và phá hủy môi trƣờng tự nhiên [10].
Một số cơ sở nuôi tôm thâm canh cũng bắt đầu đánh giá đƣợc vai trò quan
trọng của việc quản lý môi trƣờng nuôi nên đã chú ý đầu tƣ cơ sở hạ tầng đúng
yêu cầu kỹ thuật. Xây dựng đầm, ao nuôi, hệ thống cấp thoát nƣớc đúng với yêu
cầu. Tuy vậy, phần lớn cơ sở nuôi trồng thủy sản lại chƣa nhận thức đúng về
việc bảo vệ môi trƣờng nuôi để phát triển bền vững. Nuôi tôm thâm canh, đặc
biệt là nuôi tôm sú chịu nhiều rủi ro về khách quan nhƣ mƣa, bão, lũ lụt, hạn hán
và rủi ro về chủ quan nhƣ kỹ thuật lạc hậu, con giống, thức ăn, hóa chất, chế
phẩm xử lý môi trƣờng, thuốc trị bệnh kém chất lƣợng. Ngay cả khi thu hoạch


4

đƣợc sản phẩm thì ngƣời nuôi tôm cũng còn gánh chịu thiệt hại nếu sản phẩm
còn dƣ lƣợng kháng sinh. Bởi vậy, rất nhiều cơ sở nuôi tôm bị thua lỗ nặng.
1.1.1. Hiện trạng nuôi trồng và dịch bệnh trong hoạt động nuôi trồng thủy sản
Sự phát triển nhanh chóng của hoạt động nuôi trồng thủy sản kéo theo tình
trạng ô nhiễm nặng nề, làm lây lan và bùng phát dịch bệnh. Trong điều kiện nuôi
tôm hiện nay, môi trƣờng ao nuôi rất giàu dinh dƣỡng. Nguyên nhân là do ngƣời
nuôi đã đƣa vào ao nuôi một lƣợng thức ăn tổng hợp rất lớn mà chỉ có một phần
nhỏ (khoảng 17%) lƣợng thức ăn đƣợc đồng hóa thành sinh khối tôm, còn lại bị
hòa tan trong nƣớc hoặc bài tiết ra ngoài môi trƣờng. Lƣợng thức ăn thừa, uế thải
hữu cơ và phế thải do lột xác để duy trì hoạt động sống của tôm cùng với xác
động vật thủy sinh phù du là những yếu tố làm cho ao nuôi nhiễm bẩn.
Có thể nói đa số những đầm tôm hiện tại bị thất bại là do môi trƣờng bị
nhiễm bẩn [1]. Sự nhiễm bẩn của ao đầm ngoài ô nhiễm hữu cơ còn nhiễm bẩn do
việc sử dụng hóa chất, kháng sinh trong quá trình nuôi. Khi tôm có hiện tƣợng
kém ăn vì thay đổi thời tiết hay lột xác thì ngƣời nuôi thƣờng cho hóa chất, kháng
sinh vào ao nuôi. Việc sử dụng hóa chất khử trùng ao bên cạnh tác dụng mong
muốn còn gây ra những tác hại đối với môi trƣờng nhƣ việc tồn lƣu hóa chất trong

1.1.2. Hiện trạng sử dụng chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy sản
Để giảm thiểu những bất lợi của hóa chất trong nuôi trồng thủy sản, cần
phải hạn chế việc sử dụng. Điều đó có nghĩa là phải thƣờng xuyên đối mặt với
hàng loạt vấn đề ô nhiễm môi trƣờng và dịch bệnh. Vì vậy trong những năm gần
đây, nghiên cứu để tìm ra các yếu tố sinh học nhƣ probiotics, enzymes góp phần
cải tạo môi trƣờng, tăng sức đề kháng cho các đối tƣợng nuôi trồng đƣợc tiến
hành mạnh mẽ. Tuy vậy, việc sử dụng chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy
sản hiện nay cũng là vấn đề cần bàn. Phần lớn các sản phẩm hiện nay lƣu hành
trên thị trƣờng là sản phẩm nhập ngoại bao gồm chế phẩm trộn vào thức ăn và
chế phẩm xử lý nƣớc. Nhiều công ty cung cấp, phân phối và nhận chuyển giao
kĩ thuật để sản xuất nhƣng vì mục đích thƣơng mại chƣa vì quyền lợi của ngƣời
sử dụng. Chƣa kể đến việc đƣa một lƣợng đáng kể các chủng vi sinh vật vào
Việt Nam cũng tiềm tàng nhiều nguy cơ an toàn sinh học.
Việc gia tăng mức độ thâm canh và diện tích nuôi trồng dẫn đến môi
trƣờng càng có chiều hƣớng xấu đi và nhu cầu chế phẩm sinh học càng cao.


6

Nhất là trong tình hình thị trƣờng thông báo cấm nhiều loại kháng sinh sử dụng
trong nuôi trồng thủy sản.
Đối với hình thức nuôi tôm bán thâm canh hay nuôi thâm canh, việc sử
dụng chế phẩm sinh học đƣợc nhìn nhận nhƣ biện pháp tích cực nhất. Bởi vì chế
phẩm sinh học có tác dụng giảm độc trong ao, chủ yếu là NH3 và H2S; giảm mùi
hôi; cải thiện màu nƣớc; ổn định pH và cân bằng hệ sinh thái trong ao. Chế
phẩm sinh học cũng có tác dụng phòng bệnh, giảm thiểu hiện tƣợng gây bệnh
cho tôm. Ngoài ra, việc áp dụng chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy sản
còn giúp đối tƣợng nuôi hấp thụ thức ăn tốt hơn, giảm hệ số tiêu thụ thức ăn,
tăng năng suất thu hoạch từ 20-30% [22,24]. Bên cạnh đó, việc sử dụng chế
phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy sản sẽ hạn chế sử dụng hóa chất và kháng

đến quá trình tiêu hóa của các vật nuôi bởi vì các dòng chế phẩm sinh học sản xuất ra
các enzyme ngoại bào nhƣ protease, amylase, lipaza và cung cấp các dƣỡng chất
phát triển cần thiết nhƣ vitamin, axit béo, acid amin,… Trong nuôi trồng thủy sản,
các vi sinh vật nhƣ Bacteroides và Clostridium sp đã cung cấp dinh dƣỡng cho tôm
cá, đặc biệt là cung cấp các axit béo và vitamin.
 Cải thiện chất lượng nước:
Chế phẩm sinh học còn giúp ngăn ngừa và giảm thiểu ô nhiễm trong ao
nuôi. Các vi sinh vật có lợi giúp phân hủy các chất hữu cơ, góp phần làm giảm
thiểu việc hình thành các lớp bùn và chất cặn bã, nhờ vậy chất lƣợng nƣớc trong
ao nuôi đƣợc cải thiện, làm tăng số lƣợng của động vật phù du, giảm mùi hôi, từ
đó tăng sản lƣợng nuôi trồng thủy sản. Hơn nữa, sử dụng chế phẩm sinh học sẽ
góp phần làm giảm việc sử dụng các hóa chất, kháng sinh trong phòng và trị
bệnh trong nuôi trồng thủy sản, đảm bảo sản xuất sản phẩm an toàn cho sức
khỏe con ngƣời và góp phần phát triển ngành nuôi trồng thủy sản bền vững.
1.2.3. Những nhóm vi sinh vật thƣờng đƣợc sử dụng trong sản xuất probiotic
Chế phẩm sinh học đƣợc sử dụng trong nuôi trồng thủy sản đƣợc sản xuất
từ một, vài hay nhiều nhóm vi sinh vật, chủ yếu bao gồm các nhóm vi sinh vật
nhƣ sau:
- Nhóm vi khuẩn dị dƣỡng hoại sinh: chủ yếu làm sạch môi trƣờng nhờ
khả năng sinh enzym phân hủy hữu cơ: protease phân hủy protein, amylase phân
hủy tinh bột, cellulase phân hủy cellulose. Ngoài chức năng phân hủy các hợp
chất hữu cơ làm sạch môi trƣờng thì chúng còn có tác dụng kiểm soát sự phát
triển quá mức vi sinh vật gây bệnh do cơ chế cạnh tranh nguồn dinh dƣỡng giữ
cho môi trƣờng luôn ở trạng thái cân bằng sinh học. Nhóm vi khuẩn dị dƣỡng
hoại sinh bao gồm một số loài thuộc chi Bacillus đƣợc trình bày ở bảng 1.1


10

- Nhóm vi khuẩn đóng vai trò tích cực trong việc kiểm soát vi sinh vật gây

11

tử, giảm độc cho môi trƣờng. Một số loài vi khuẩn đƣợc sử dụng để sản xuất chế
phẩm sinh học và chức năng của chúng đƣợc trình bày trong bảng 1.1.
Bảng 1.1. Các loài vi khuẩn sử dụng để xử lý môi trƣờng
Các loài vi khuẩn

Chức năng

Nitrosomonas sp

Vi khuẩn tự dƣỡng, phân hủy amon thành nitrit

Nitrobacter sp

Vi khuẩn tự dƣỡng, phân hủy nitrit thành nitrat

Bacillus lichenifomis

Vi khuẩn kị khí không bắt buộc, phân hủy hữu

Bacillus subtilis

cơ, cạnh tranh sinh học, giảm sự phát triển của

Bacillus megaterium

Vibrio và vi khuẩn, nguyên sinh động vật

Bacillus lacterospporus

Bộ (ordo):

Bacillales

Họ (familia):

Bacillaceae

Chi (genus):

Bacillus

 Một số loài Bacillus sử dụng làm probiotic
* Bacillus subtilis:
Bacillus subtilis đƣợc phát hiện và đặt tên vào năm 1872, nó phân bố phổ
biến trong đất, đặc biệt trong cỏ khô nên còn có tên gọi khác là trực khuẩn cỏ
khô. Là những vi khuẩn hình que, ngắn, nhỏ, kích thƣớc (3- 5) × 0.6µm, nhiều
khi tế bào nối với nhau thành chuỗi dài ngắn khác nhau hoặc tế bào đứng riêng
rẽ. Khuẩn lạc khô, không màu hoặc màu xám nhạt, hơi nhăn hoặc tạo ra lớp
màng mịn lan trên bề mặt thạch, có mép nhăn bám chặt vào môi trƣơng thạch.
Nhiệt độ thích hợp cho B. subtilis sinh trƣởng là 30- 500C, thƣờng nuôi cấy ở
370C. Bào tử hình bầu dục, kích thƣớc 0.6-0.9µm, phân bố lệch tâm, gần tâm nhƣng
không chính tâm. Bào tử có thể sống vài năm đến vài chục năm. Đã có những chứng
cứ về việc duy trì sức sống của bào tử B.subtilis trong 200-300 năm.
Vi khuẩn B.subtilis có màng nhày (giác mạc) giúp vi khuẩn có khả năng
chịu đựng đƣợc điều kiện thời tiết khắc nhiệt, vì màng nhày có thể dự trữ thức
ăn và bảo vệ vi khuẩn tránh tổn thƣơng khi khô hạn. Màng nhày có thể quan sát
đƣợc khi nhuộm tiêu bản, qua kính hiển vi thấy màng nhày không mà, trong suốt
còn tế bào vi khuẩn bắt màu nâu đỏ trên nền tiêu bản xanh hoặc đen.