Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong đồ án này hoàn toàn trung
thực, chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Các thông tin, tài liệu
trích dẫn trong đồ án này đều được ghi rõ nguồn gốc.
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2016
Sinh viên thực hiện

Vũ Trường Giang


LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian thực hiện đồ án tốt nghiệp tại Trường Đại học Công nghệ Tp. Hồ
Chí Minh - HUTECH, được sự hướng dẫn tận tình của các Thầy cô, các anh chị và các
bạn đã giúp tôi hoàn thành tốt đồ án này. Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc
nhất của mình đến:
Ban giám hiệu Trường Đại học Công nghệ Tp. Hồ Chí Minh – HUTECH đã tạo
cơ hội cho tôi được học tập tại trường.
Cảm ơn quý thầy cô trong khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường
đã truyền đạt lại những tri thức quý báu cho chúng tôi trong thời gian học tập tại
trường.
Đặc biệt tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS. Nguyễn Hoài Hương, người
đã tận tình trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo để tôi có thể hoàn thành đồ án tốt nghiệp này.
Cùng với đó, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, các anh chị và các bạn học đã có
những động viên to lớn, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành chương trình
học tại trường một cách tốt nhất.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Sinh viên thực hiện

Vũ Trường Giang

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ............................................................................... 29
2.1 Phương tiện nghiên cứu ............................................................................................................ 29
2.1.1 Vật liệu................................................................................................................................. 29
2.1.2. Nơi thực hiện ...................................................................................................................... 29

i


Đồ án tốt nghiệp

2.1.3 Thời gian thực hiện ............................................................................................................. 29
2.2 Vật liệu thí nghiệm ................................................................................................................ 29
2.2.1 Thiết bị và dụng cụ .............................................................................................................. 29
2.2.2 Hóa chất .............................................................................................................................. 30
2.3 Phương pháp nghiên cứu .................................................................................................. 31
2.3.1 Phá vách bào tử nấm Linh chi bằng phương pháp lạnh đông kết hợp sử dụng C20032
10% và dịch tăng sinh nấm Trichoderma harzianum T2 ............................................................ 32
2.3.2 Quy trình trích ly các hợp chất có trong bào tử nấm linh chi ............................................ 34
2.3.3 Định tính một số hoạt chất có trong mẫu bào tử nấm linh chi .......................................... 34
2.3.4 Định lượng một số hoạt chất có trong mẫu bào tử nấm linh chi ....................................... 37
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN........................................................................................ 41
3.1 Định tính các hợp chất sau khi trích ly .................................................................................... 42
3.1.1 Bào tử .................................................................................................................................. 42
3.1.2. Dịch..................................................................................................................................... 47
3.2 Định lượng hoạt chất có trong mẫu bào tử nấm linh chi ........................................................ 53
3.2.1 Bào tử .................................................................................................................................. 53
3.2.2 Dịch...................................................................................................................................... 54
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 58
4.1 Kết luận ...................................................................................................................................... 58
4.2 Kiến nghị .................................................................................................................................... 60

Hình 3.7 Phản ứng định tính Alkaloid bằng thuốc thử Mayer ..................................48
Hình 3.8 Phản ứng định tính Alkaloid bằng thuốc thử Dragendorff ........................49
Hình 3.9 Thử nghiệm tính tạo bọt .............................................................................50
Hình 3.10 Thử nghiệm Fontan –Kaudel ....................................................................51
iii


Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.11 Phản ứng Liebermann – Burchard ...........................................................52
Hình 3.12 Thử nghiệm phản ứng với thuốc thử Molish ...........................................53
Hình 3.14 Đường hồi quy tuyến tính biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang
vào nồng độ D-glucose ........................................................................................................55
Hình 4.1 Quy trình tổng kết .......................................................................................61

iv


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Đặc điểm của một số loại nấm linh chi ở Đài Loan .............................. 7
Bảng 1.2 Thành phần dược tính của nấm Linh chi .............................................. 12
Bảng 1.3 Cấu trúc không gian của một số nhóm chất saponin ............................ 24
Bảng 3.1 Bảng kết quả thí nghiệm........................................................................ 57

v


Đồ án tốt nghiệp


Đồ án tốt nghiệp

một số phòng thí nghiệm ở Hoa Kỳ và vùng Đông Nam Á cũng bắt đầu tham gia vào
tiến trình này.
Năm 1988, Nhật Bản đã điều trị thành công bệnh nhược cơ bằng Linh chi theo
nguyên tắc điều hoà miễn dịch. Bệnh viện Sơn Đông, Trung Quốc dùng “xúp” Linh chi
để giải độc và bổ gan có kết quả tốt, trong 70.000 ca trên 90% khỏi bệnh (Lui Xing Jia,
1994). Tác giả cho rằng nấm Linh chi có tác dụng tốt đối với đường tiết niệu, điều hoà
rối loạn tuần hoàn não, tránh các cơn kịch phát nghẽn mạch và làm dịu thần kinh,...
Năm 2010, Chaiyavat Chaiyasut*, Chakkrapong Kruatama and Sasithorn Sirilun
đã công bố công trình nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi bằng quá trình lên men
vi khuẩn Lactobacillus plantarum và bào tử nấm Linh chi
2. Mục đích của đề tài
Trích ly các hợp chất bên trong bào tử nấm linh chi.
Xác định được sự hiện diện của các hợp chất có trong bào tử nấm linh chi khi đã
bị phá vách.
3. Mục tiêu của đề tài
Định tính và định lượng các hoạt chất có trong dịch trích ly bào từ nấm linh chi
được phá vỡ bằng enzyme
4. Phương pháp nghiên cứu
Tổng quan tài liệu và tiến hành thực nghiệm
5. Kết quả thu được của đề tài
Định tính được alkaloid, saponin, triterpenoid, polysaccharide có trong bào tử
nấm linh chi sau phá vỡ.
Định lượng polysaccharide, tổng chất béo có trong bào tử nấm linh chi sau phá
vỡ.
6. Hạn chế của đề tài
Nghiên cứu được tiến hành sơ bộ, chưa định lượng chính xác được toàn bộ các
thành phần hoạt chất có trong dịch trích ly bào tử nấm linh chi.


3


Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.1: Nấm linh chi đỏ (Ganoderma lucidum) (A)
nấm mọc trong tự nhiên (B) và nấm trồng (C).
Từ thời cổ xưa có rất nhiều nhà nghiên cứu (cả ở Trung Quốc và phương Tây) đã
tìm hiểu về loại nấm này và họ cũng đã đưa ra rất nhiều hệ thống để phân loại nấm linh
chi. Những nhà nghiên cứu Trung Quốc cổ đại đã chia nấm linh chi thành rất nhiều loại
khác nhau dựa vào quả thể cũng như hình dáng bên ngoài của nấm.
Ở phương Tây, theo bảng phân loại của Alexopolus năm 1979, Lingzhi thuộc
giống nấm linh chi và là thành viên của họ Myceteae, lớp Basidiomycetes chi
Aphyllophorales và thuộc họ Polyporaceae. Đầu năm 1881, Karsten, nhà thực vật học
người Phần Lan, đã đưa ra đặc điểm phân loại của nấm linh chi dựa vào lớp biểu bì bên

4


Đồ án tốt nghiệp

ngoài của nấm. Kể từ đó nấm linh chi đỏ đã trở thành một đại diện tiêu biểu cho chủng
loại nấm này. Về sau, đặc điểm phân loại của nấm linh chi đã được thay đổi bởi một số
nhà khoa học khác như Donk, Murrill, Furtano và Steyaert, … sau khi họ đã tìm ra
những đặc tính khác của nấm linh chi như các bào tử của nấm linh chi có hình quả
trứng, lớp ngoài của thành tế bào tương đối mỏng và trong suốt, ngược lại lớp trong
của thành tế bào lại dày, màu vàng nâu và có nhiều nốt nhỏ. Cũng từ đó, nấm linh chi
không còn được phân loại dựa vào màu sắc hay hình dạng bên ngoài nữa.
Ngày nay, theo phân loại nấm linh chi của Trung Quốc, nhà nghiên cứu Zhao

và một số loại cây lá kim khác.

5


Đồ án tốt nghiệp

•

Linh chi đen: còn được gọi là nấm linh chi xuân. Loại nấm này thường mọc ở

trong những thung lũng, nắp nấm bên ngoài có màu đen bên trong có màu đỏ, thường
mọc trên các thân cây, có vị mặn và đắng. Amauroderma rugosum và Polyporus
melanopus là 2 đại diện chính của loài nấm này. Cả cuống và nắp của 2 loại nấm này
đều có màu đen.
•

Linh chi xanh: còn được gọi là nấm linh chi rồng. Theo Bao Puzi miêu tả thì

nấm linh chi xanh có hình dáng giống như những sợi lông của chim bói cá. Coriolus
versicolar là đại diện tiêu biểu cho loài nấm này. Đặc điểm của loài này là mũ nấm
cứng và bề mặt được bao phủ bởi những sợi lông ngắn.
Trong mỗi loài nấm linh chi lại được chia ra rất nhiều loại khác nhau. Ví dụ như
nấm linh chi đỏ thì có Ganoderma lucidum và Ganoderma tsugae được biết đến nhiều
nhất. Đối với linh chi tím thì cóGanoderma neojaponicum và Ganoderma sinense. Tuy
nhiên, trong lĩnh vực trồng trọt, y dược và nha khoa, người ta chỉ tập trung nghiên cứu
2 loại đó là linh chi đỏ và linh chi tím. Bảng 1.1 dưới đây mô tả đặc điểm của một số
loài nấm linh chi phổ biến ở Đài Loan.

6


Xám
trắng

Bán

Nơi sinh Tên
trưởng

Cuống

dạng

G.

Bào tử

Không

đến xám nguyệt có
nâu

Kích
thước
(um)

thông

thường



Gần
giống

Taiwan
Lingzhi

G.

Màu tím, hình

formosanum Có

màu tím tròn,

Chang

đen

and

hình
quả

Chen

Đầu
Có thể
quan
sát

(Fr) Pat.

Không
có hoặc
rất ngắn

giống
Nâu đỏ, hình
nâu

tròn,
hình

8.7Yếu

10.4 ×
5.2-7

Cây

lá Linh chi đỏ

rộng

không cuống

quả

7


hình

sát

rộng

quả

được 7

× 5.2-

lá

linh

chi

Hsiang SZU,
linh chi đỏ ở
chân đồi

thận
Gần
New

giống

Japanese


đỏ, linh chi

Tre nứa

tre tím, linh

suốt

chi tím

thận
Tropical
Lingzhi

G.

tropicum

Nâu
Có

(Jungh)

vàng,
nâu tím

Bres.

Linh chi đỏ,


quả

Conifer
Lingzhi
G.
Murr.

tsugae

Có

Có thể

Nâu đỏ, thận,

quan 9-11 ×

nâu tím hình

sát

cánh

6-8

được

Cây

lá Nấm linh chi

quan × 4.5- nấm

trứng sát

5

được

Hseu.

xanh

nhô
lên,
trong
suốt

Nấm Linh Chi là một loại nấm hóa mộc, cứng khi khô nhưng khi tiếp xúc với
nước trở nên hơi mềm. Quả thể nấm linh chi gồm:
•

Mũ nấm: mặt trên thường có một lớp bóng màu nâu đỏ, mặt dưới nấm là thụ

tầng, hình ống nếu cắt ngang có dạng tổ ong. Ngoài thiên nhiên, nấm luôn có dạng bất
đối xứng, tức là cuống nấm thường ở một bên như vị trí tay quạt. Đối với nấm trồng,
mũ nấm tròn và gần như đối xứng, cuống nấm ở lệch giữa trung tâm do được trồng
theo từng đơn vị, không có sự chèn ép và ảnh hưởng môi trường bên ngoài.
•

Bào tử: hình thuẩn có gai lõm. Một đầu tròn lớn, một đầu nhỏ có lỗ, nơi đây bào

khó nảy mầm. Bào tử Linh chi có chứa các thành phần giống nấm Linh chi:
Polysacharide, triterpenoid, acid béo, acid amin, vitamin, các nguyên tố vi lượng, với
hàm lượng đậm đặc hơn Linh chi từ 7 – 20 lần (Nguyễn Thị Sáu, 2014).
Khi Linh chi phóng thích bào tử, nhìn xuyên qua ánh nắng sẽ thấy từng đợt bào tử
bay qua như khói bám vào bề mặt nấm tạo thành một lớp bụi mỏng màu nâu đỏ rất
mịn. Tuy vậy số lượng bào tử linh chi rất ít. Khi thu hoạch 1 tấn nấm Linh chi sẽ chỉ
thu được 1 kg bào tử.
Điều hết sức lý thú, mặc dù hình thái bên ngoài rất biến đổi, đa dạng, song về cấu
tạo tinh vi của bào tử thì có độ ổn định rất cao, dù là chủng nuôi trồng ở Nhật, Trung
Quốc, chủng nấm Lim Hà Bắc hay chủng Đà Lạt.

a)

b)

Hình 1.2: a) Bào tử nấm linh chi dưới kính hiển vi được phóng to 3000 lần
b) Bào tử nấm linh chi bị phá vỡ vách.

10


Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.3. Các kiểu hình bào tử đặc thù của họ nấm linh chi
1: Kiểu miệng rộng, gặp ở Ganoderma và Humphrey a (có mấu lồi đáy bào tử).
2: Kiểu miệng tiêu giảm, gặp ở Haddowia và Amauroderma (lưu ý kiểu bào tử xẻ
múi ở Haddowia rất tương đồng với kiểu xẻ rãnh ở Ganoderma
Lớp vỏ trong mỏng hơn, sát ngay bên dưới tầng nền của lớp vỏ bào tử, thường
cản quang mạnh do vậy thấy đậm màu dưới kính hiển vi quang học. Cấu trúc của lớp
vỏ trong cho đến nay còn chưa được biết rõ. Cần lưu ý rằng: khái niệm “gai chống


Hợp chất nitơ

1,6 – 2,1%

Chất béo (kể cả dạng xà phòng hóa) 1,9 – 2%
Hợp chất phenol

0,08 – 0,1%

Hợp chất Sterol toàn phần

0,11 – 0,16%

Saponin toàn phần

0,3 – 1,23%

Theo Wachtel-Galor et al. (2011) trong nấm linh chi tươi, nước là thành phần chủ
yếu chiếm 90% khối lượng. Trong 10% còn lại thì protein chiếm 10- 40%, chất béo
chiếm từ 2- 8%, carbonhydrate chiếm 3- 28%, chất xơ chiếm 3- 32%, hàm lượng tro
chiếm 8- 10% cùng một số loại vitamin và khoáng chất khác như kali, can-xi, phốt pho,
ma-giê, selen, sắt, kẽm, trong đó đồng chiếm tỉ lệ nhiều nhất (Borchers et al. (1999)).
Trong một nghiên cứu về những thành phần của nấm, Mau et al. (2001) đã xác định
được tỷ lệ của các thành phần chủ yếu trong nấm linh chi gồm: tro (1,8%),
carbonhydrate (26- 28%), chất béo thô (3- 5%), chất xơ (59%) và protein (7- 8%). Hàm
12


Đồ án tốt nghiệp

Đồ án tốt nghiệp

xuất bằng ethanol (Lu et al. (2012)). Bên cạnh đó, điều kiện sinh trưởng cũng ảnh
hưởng đến hàm lượng của các hoạt chất sinh học có trong nấm linh chi (Lu et al.
(2012)).

1.2.1 Các polysaccharide và các peptidoglycan
Hàm lượng carbonhydrate và hàm lượng chất xơ có trong nấm linh chi được xác
định lần lượt từ 26- 28% và 59% (Mau et al. (2001)). Nấm linh chi có chứa rất nhiều
polysaccharide có khối lượng phân tử lớn, các hợp chất này mang hoạt tính sinh học và
được tìm thấy ở tất cả các bộ phận của nấm linh chi. Nhiều nhóm polysaccharide có thể
được chiết xuất từ thân nấm, bào tử và khuẩn ty. Các polysaccharide của nấm linh chi
có tác dụng sinh học như chống viêm, hạ đường huyết, chống loét, chống lại sự hình
thành khối u và tăng cường khả năng miễn dịch (Miyazaki et al. (1981); Hikino et al.
(1985); Tomoda et al. (1986); Bao et al. (2001); Wachtel-Galor et al. (2004)). Người ta
thường chiết xuất các polysaccharide trong nấm linh chi bằng nước nóng sau đó tiến
hành kết tủa chúng bằng dung dịch ethanol hoặc methanol. Đôi khi cũng có thể chiết
xuất bằng nước và dung dịch kiềm. Theo kết quả phân tích, thành phần chủ yếu trong
polysaccharide của nấm linh chi (Ganoderma lucidum- polysaccharides: GL- PSs) là
đường glucose (Bao et al. (2001); Wang et al. (2002)). Ngoài ra, GL- PSs cũng có cấu
trúc polymer mạch thẳng, bao gồm: xylose, mannose, galactose và fucose với nhiều vị
trí liên kết β hoặc α khác nhau như 1- 3, 1- 4 và 1- 6 với các dạng đồng phân - D hay L
(Lee et al. (1999); Bao et al. (2002)). Khả năng chống lại sự hình thành khối u của GLPSs phụ thuộc vào cấu hình mạch nhánh cũng như tính tan của polysaccharide này
(Bao et al. (2001); Zhang et al. (2001)). Ngoài ra, nấm linh chi cũng có chứa một mạng
lưới chitin, đây là thành phần mà cơ thể người không tiêu hóa được và đóng vai trò tạo
nên độ cứng cho nấm linh chi (Upton et al. (2000)).
Có rất nhiều peptidoglycan có hoạt tính sinh học trong nấm linh chi đã được phân
lập, bao gồm proteoglycan (GLPG) có tác dụng kháng virus (Li et al. (2005)), tăng

14

phân nhóm này cũng đã cho thấy có rất nhiều tiềm năng nhưng hiện nay có rất ít những
ứng dụng của triterpene được sử dụng trong thực tế.
Trong nấm linh chi, cấu trúc hóa học của triterpene có dạng lanostane, đây là chất
tham gia vào quá trình tổng hợp nên lanosterol, quá trình sinh tổng hợp giúp hình thành
nên các squalene mạch vòng (Haralampidis et al. (2002)). Trong quá trình chiết xuất
triterpene, người ta thường sử dụng các dung môi hữu cơ như methanol, ethanol,
acetone, chloroform, ether hoặc là hỗn hợp của chúng. Dịch chiết sau đó sẽ được phân
tách bằng nhiều phương pháp khác nhau, có thể dùng HPLC thông thường hoặc HPLC
pha nghịch đảo (Chen et al. (1999); Su et al. (2001)). Những triterpene đầu tiên được
Kubota phân tách từ nấm linh chi là ganoderic acid A và B (Kubota et al. (1982)). Kể
từ khi đó, hơn 100 loại triterpene cùng với cấu hình của chúng đã được tìm ra. Trong

16


Đồ án tốt nghiệp

số đó, có hơn 50 loại là đặc trưng chỉ được tìm thấy trong nấm linh chi. Đa số các
triterpene là các ganoderic và lucidenic acid, nhưng cũng có một số loại khác như là
ganoderal, ganoderiol và ganodermic acid (Nishitoba et al. (1984); Sato et al.
(1986); Budavari et al. (1989); Gonzalez et al. (1999); Ma et al. (2002);Akihisa et al.
(2007); Zhou et al. (2007); Jiang et al. (2008); Chen et al. (2010)).

Hình 1.5: Công thức của một số triterpene trong nấm linh chi (Kubota et al. (1982);
Helv Chim Acta 65: 611-9; Nishitoba et al. (1984); Agric Biol Chem 48: 2905-7; Sato
et al. (1986); Agric Biol Chem 50: 2887- 90; Budavari et al. (1989)).
Nấm linh chi rất giàu hàm lượng các triterpene, những chất này cũng góp phần
tạo nên vị đắng của nấm linh chi. Chúng mang nhiều hoạt tính sinh học có lợi cho sức
khỏe, như khả năng chống oxy hóa và giảm hàm lượng chất béo trong cơ thể. Tuy
nhiên, hàm lượng triterpene trong nấm linh chi lại không ổn định. Chúng phụ thuộc rất