BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VI KHUẨN LACTIC TỪ THỰC PHẨM LÊN
MEN TRUYỀN THỐNG CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM
MỐC SINH AFLATOXIN Aspergillus spp.

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG
Sinh viên thực hiện
MSSV: 1211100167

: LƯU ĐẠI KIM PHƯỢNG
Lớp: 12DSH01

TP. Hồ Chí Minh, 2016


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu
trong đồ án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào
khác.

Xin chân thành cảm ơn các bạn học cùng lớp 12DSH đã gắn bó, chia sẻ, giúp đỡ
và đóng góp ý kiến cho em trong suốt bốn năm đại học.
Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn các Thầy Cô trong Hội Đồng Phản Biện đã
dành thời gian đọc, nhận xét đồ án tốt nghiệp này.
TP.HCM, tháng 8 năm 2016.
SVTH: Lƣu Đại Kim Phƣợng

ii


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT.......................................................................................vii
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................... viii
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH................................... x
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1
1. Tính cấp thiết của đề tài ......................................................................................... 1
2. Tình hình nghiên cứu ............................................................................................. 2
2.1. Ngoài nước ......................................................................................................... 2
2.2. Trong nước ......................................................................................................... 3
3. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................... 3
4. Mục đích nghiên cứu .............................................................................................. 3
5. Nhiệm vụ nghiên cứu .............................................................................................. 3
6. Phƣơng pháp nghiên cứu ....................................................................................... 4
6.1. Phương pháp luận .............................................................................................. 4
6.2. Phương pháp xử lý số liệu .................................................................................. 4
7. Kết quả đạt đƣợc của đề tài ................................................................................... 4
8. Kết cấu đồ án ........................................................................................................... 5
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN.......................................................................................... 6

1.2.4.2. Ứng dụng của vi khuẩn lactic ................................................................................. 40
1.2.5. Khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn lactic .......................................... 40
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 46
2.1. Địa điểm nghiên cứu .......................................................................................... 46
2.2. Thời gian thực hiện ............................................................................................ 46
2.3. Vật liệu ................................................................................................................ 46
2.3.1. Thiết bị và dụng cụ ........................................................................................ 46
2.3.2. Hóa chất ........................................................................................................ 46
2.3.3. Giống nấm ..................................................................................................... 50
2.4. Phƣơng pháp luận.............................................................................................. 50
2.5. Phƣơng pháp thí nghiệm ................................................................................... 53

iv


Đồ án tốt nghiệp

2.5.1. Thu thập mẫu ................................................................................................. 53
2.5.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn lactic ......................................................... 53
2.5.2.1. Tăng sinh ...................................................................................................................... 53
2.5.2.2. Phân lập ....................................................................................................................... 53
2.5.3. Các thí nghiệm dùng để định danh vi khuẩn lactic. ...................................... 55
2.5.3.1. Nhuộm Gram ............................................................................................................... 55
Kết quả: ........................................................................................................................................ 55
2.5.3.2. Nhuộm bào tử.............................................................................................................. 55
2.5.3.3. Thử nghiệm Catalase ................................................................................................ 56
2.5.3.4. Thử nghiệm khả năng sinh acid ............................................................................. 56
2.5.3.5. Thử nghiệm khả năng di động ................................................................................ 57
2.5.3.6. Thử nghiệm khả năng lên men đường và khả năng sinh khí .......................... 57
2.6. Xác định hàm lƣợng acid tổng .......................................................................... 58



Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
FDA

Fructose-bisphosphate aldolase

ATP

Adenosin triphosphat

LAB

lactic acid bacteria /Lactobacillales

DNA

Deoxyribonucleic acid

rRNA

ribosomal Ribonucleic acid

MRS

de Man, Rogosa and Sharpe

PDA

Bảng 1.8. Các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn lactic có tính kháng sinh.
(Holzapfel và cộng sự, 1995) ........................................................................................ 44
Bảng 2.1: Kí hiệu các nguồn phân lập.......................................................................... 53
Bảng 3.1: Bảng kí hiệu các chủng vi khuẩn phân lập .................................................. 68
Bảng 3.2: Hình thái khuẩn lạc dưới kính hiển vi x4 và hình thái vi khuẩn dưới kính
hiển vi x100 ................................................................................................................... 73
Bảng 3.3: Kết quả của các thí nghiệm dùng để định danh vi khuẩn ............................ 81
Bảng 3.4: %Acid lactic của 17 chủng vi khuẩn phân lập được ................................... 83
Bảng 3.5: Bảng xử lý số liệu khả năng sinh acid và giá trị OD của các chủng phân lập
từ Nem chua .................................................................................................................. 84
Bảng 3.6: Bảng xử lý số liệu khả năng sinh acid và giá trị OD của các chủng phân lập
từ Cơm mẻ ..................................................................................................................... 85
Bảng 3.7: Phân nhóm các chủng vi khuẩn lactic .......................................................... 85
Bảng 3.8: Tổng khả năng kháng nấm của các chủng vi khuẩn .................................... 89
Bảng 3.9: Bảng xử lý số liệu khả năng kháng nấm của các chủng phân lập từ Nem
chua ............................................................................................................................... 90
viii


Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.10: Bảng xử lý số liệu khả năng kháng nấm của các chủng phân lập từ Cơm
mẻ .................................................................................................................................. 91
Bảng 3.11: Kí hiệu các thành phần của thí nghiệm ...................................................... 92
Bảng 3.12: Khả năng kháng nấm của Nghiệm thức 1 – Canh trường nuôi cấy và
Nghiệm thức 2 – Canh trường nuôi cấy + Chitosan 0.4% ứng dụng trên đậu phộng ... 93
Bảng 3.13: Kết quả kiểm nghiệm Tổng số vi sinh vật hiếu khí và Coliform ............... 97

ix



x


Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.11: Thử nghiệm khả năng lên men đường........................................................ 80
Hình 3.12: Vi khuẩn Lactobacillus L5 có khả năng lên men đường ........................... 81
Hình 3.13: Đồ thị biểu hiện % acid lactic của 17 chủng khuẩn sau 24 giờ nuôi cấy ... 84
Hình 3.14: Khả năng đối kháng nấm CĐP2 của LN4-2 sau 3 ngày ............................ 87
Hình 3.15: Khả năng đối kháng nấm ĐN3 của LN4-2 sau 3 ngày .............................. 87
Hình 3.16: Khả năng đối kháng nấm ĐN3 của LC1-1 sau 3 ngày .............................. 88
Hình 3.17: Khả năng đối kháng nấm ĐN2 của LC1-1 sau 3 ngày .............................. 88
Hình 3.18: Đồ thị biểu thị Tổng khả năng kháng nấm của các chủng vi khuẩn .......... 89
Hình 3.19: Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của Chủng L9B-LC1-1 (Từ trái
qua: Ngày 1, ngày 3, ngày 5, ngày 7, ngày 9, ngày 13) ................................................ 95
Hình 3.20: Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của Chủng L11-LN4-2 (Từ trái
qua: Ngày 1, ngày 3, ngày 5, ngày 7, ngày 9, ngày 13) ................................................ 96
Hình 3.21: Kết quả tổng số vi sinh vật hiếu khí của TN1-canh trường nuôi cấy (Từ trái
qua: Nồng độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4) ....................................................................... 98
Hình 3.22: Kết quả tổng số vi sinh vật hiếu khí của TN2-canh trường nuôi
cấy+Chitosan 0.4% (Từ trái qua: Nồng độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4).......................... 98
Hình 3.23: Kết quả Coliform trên môi trường VRB của TN1-canh trường nuôi cấy (Từ
trái qua: Nồng độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4) ................................................................. 99
Hình 3.24: Kết quả thử nghiệm Coliform của TN1-Canh trường nuôi cấy (Từ trái qua:
Nồng độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4) ............................................................................... 99
Hình 3.25: Kết quả kiểm tra sự phát triển của nấm mốc trên môi trường MRS Agar100
Hình 3.26: Thử nghiệm Catalase với NT1 (Canh trường nuôi cấy) và NT2 (Canh
trường nuôi cấy và Chitosan 0,4%) ............................................................................. 101


vực thẳm.

1


Đồ án tốt nghiệp

Trước tình trạng đó, con người luôn tìm kiếm những sản phẩm vừa đầy đủ các
chất dinh dưỡng vừa bảo vệ được sức khỏe. Từ xưa, ông bà ta đã sử dụng các phương
pháp lên men truyền thống để bảo quản thực phẩm. Các phương pháp này không
những giữ cho thực phẩm không bị hư hỏng mà còn làm tăng giá trị dinh dưỡng của
thực phẩm. Khi lên men thực phẩm là tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn lactic phát
triển. Các nghiên cứu trong những thập niên gần đây cho rằng nhóm vi khuẩn sinh acid
lactic (LAB) có tiềm năng bảo quản thực phẩm nhờ khả năng sản sinh các chất kháng
vi sinh vật trong quá trình sinh trưởng và phát triển (Bernet-Camard, et al., 1997). Và
việc nghiên cứu sản xuất các chất bảo quản thực phẩm theo hướng sinh học phần lớn
đều tập trung vào các hoạt chất kháng khuẩn (Bacteriocin) cũng như kháng nấm mốc
thực phẩm của LAB trong đó những nghiên cứu kháng nấm vẫn còn mới mẻ. Vì các
LAB đặc biệt các chủng đóng vai trò lên men thực phẩm truyền thống đã được chứng
minh là an toàn.
Do ở Việt Nam có rất nhiều các thực phẩm lên men truyền thống, tuy nhiên vẫn
chưa có nhiều nghiên cứu về khả năng kháng nấm mốc của các chủng vi sinh vật trong
đó.
Hiểu được những lợi ích mà các sản phẩm lên men truyền thống mang lại và để
đảm bảo sức khỏe cho người tiêu dùng bằng cách sử dụng các lợi khuẩn từ vi khuẩn
lactic để ức chế khả năng phát triển của nấm trong các loại thực phẩm. Do đó, người
thực hiện đề tài xin trình bày đề tài về: “Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên
men truyền thống có khả năng kháng nấm mốc sinh Aflatoxin Aspergillus spp.”
2. Tình hình nghiên cứu
2.1. Ngoài nước

khuẩn lactic có khả năng tăng sinh mạnh và kháng nấm tốt.
4. Mục đích nghiên cứu
Cung cấp chủng vi khuẩn lên men lactic có khả năng tăng sinh mạnh và kháng
nấm cao được phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống cho phòng thí nghiệm bộ
môn Công nghệ sinh học, khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường.
5. Nhiệm vụ nghiên cứu
 Phân lập vi khuẩn lactic có nguồn gốc từ thực phẩm lên men truyền thống.

3


Đồ án tốt nghiệp

 Khảo sát khả năng lên men lactic và tăng sinh khối của các chủng vi khuẩn
lactic.
 Khảo sát khả năng đối kháng nấm của các chủng vi khuẩn lactic.
 Khảo sát sơ bộ khả năng ứng dụng của vi khuẩn lactic trong bảo quản đậu
phộng.
6. Phƣơng pháp nghiên cứu
6.1. Phương pháp luận
 Chọn nguồn phân lập đại diện cho các thực phẩm lên men truyền thống từ Việt
Nam như nem chua, cơm mẻ…
 Phân lập chủng thuần khiết, áp dụng phương pháp phân lập và định danh sơ bộ
với vi khuẩn lên men lactic.
 Khảo sát khả năng lên men lactic qua theo dõi sinh khối và acid tổng tạo thành.
 Khảo sát khả năng kháng nấm in vitro của các chủng phân lập áp dụng phương
pháp đặt thạch khuếch tán – Agar Plug Diffusion Method (Mounyr Balouiri,
2011)
 Khảo sát khả năng kháng nấm in vivo qua thí nghiệm bảo quản đậu phộng.
6.2. Phương pháp xử lý số liệu

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về nấm
1.1.1. Giới thiệu chung
Giới nấm (tên khoa học: Fungi) bao gồm những sinh vật nhân chuẩn tự dưỡng có
thành tế bào bằng chitin. Phần lớn nấm phát triển dưới dạng các dạng sợi đa bào được
gọi là sợi nấm (hyphae) tạo nên hệ sợi (mycelium). Nấm thường sinh sản qua bào tử
hoặc qua hình thức sinh sản tự dưỡng. Quá trình sinh sản có thể là vô tính hay hữu tính.
Những đại diện tiêu biểu của nấm là nấm mốc, nấm men và nấm lớn (nấm quả
thể). Phần lớn các nấm thường không quan sát được bằng mắt thường. Đa phần chúng
sống trong đất, chất mùn, xác sinh vật chết, cộng sinh hoặc kí sinh trên cơ thể động vật,
thực vật và nấm khác. Vi nấm đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái, chúng phân
hủy các chất hữu cơ và không thể thiếu được trong chu trình chuyển hóa và trao đổi vật
chất.
1.1.2. Độc tố nấm
Độc tố nấm mốc (mycotoxin) là nhóm hợp chất có cấu trúc đa đạng, có khối
lượng phân tử nhỏ, được tạo ra bằng trao đổi thứ cấp của các nấm mốc và gây độc đối
với động vật có vú, cá, gia cầm và con người.
Hiện nay có khoảng 300 loài độc tố được phát hiện và nghiên cứu. Tuy nhiên chỉ
có khoảng 20 loài độc tố có trong thực phẩm ở mức độ nghiêm trọng và liên quan đến
an toàn thực phẩm. Được tạo bởi năm chi nấm là Aspergillus, Penicillium, Fusarium,
Alternaría và Claviceps, chúng bao gồm:
 Các độc tố của Aspergillus: Aflatoxin (B1, B2, G1, G2, M1, M2),
ochratoxin A, stermatocystin, acid cyclopianxoic.
 Các độc tố của Penicillium: Pautulin, ochratoxin A, citrinin, penitrem A và
axit cyclopianzoic toxin, fumonisin, moniliformin, diacetocyscirpenon.

6


7


Đồ án tốt nghiệp

nguy hiểm có thể gây chết người như viêm màng não (nấm Cryptococcus) hay viêm
phổi do nấm Pneumocystis carinii.
1.1.3.2. Tác hại của nấm gây ra cho thực vật
Những loài nấm gây bệnh trên cây trồng có thể gây thiệt hại lớn cho ngành nông
nghiệp và lâm nghiệp.Ví dụ như nấm đạo ôn (Magnaporthe oryzae)gây bệnh cho
lúa.Những loài gây bệnh cho cây thuộc các chi Fusarium, Ustilago, Alternaría và
Cochliobolus. Chúng làm thối rễ, tổn thương các bộ phận của cây trồng, hoa, quả, làm
giảm năng suất hoặc chất lượng sản phẩm nông nghiệp do bị ẩm mốc,...
1.1.4. Một số chủng nấm gây độc trong thực phẩm
Trong hệ vi khuẩn, nấm mốc thiên nhiên (fungal flora) có 3 chủng giống nấm
mốc chiếm ưu thế đã và đang gây độc cho thực phẩm là Aspergillus, Fusarium và
Penicillium thường tiết độc tố vi nấm vào thực phẩm. Một trong những nguyên nhân
được nhắc đến là do con người đã ăn thực phẩm có nấm mốc chứa aflatoxin, một độc
tố vi nấm đã được chứng minh có thể gây ung thư gan trên thực nghiệm. Vậy aflatoxin
là gì?
Aflatoxin là một mycotoxin được tiết ra từ nấm Aspergillus và A.parasiyicus. Các
chủng nấm này phát triển mạnh ở các loại thực phẩm nông sản, thức ăn gia súc, gia
cầm như ngô, lạc, đậu… trong các điều kiện thuận lợi nóng và ẩm, nhất là điều kiện
thời tiết ở Việt Nam. Tác hại của độc tố vi nấm này đối với động vật đã được biết đến
từ lâu và đã được chứng minh có thể gây ung thư gan trên thực nghiệm. Người có thể
bị nhiễm aflatoxin do ăn phải các loại ngũ cốc bị ô nhiễm hoặc ăn thịt các động vật
được nuôi bằng ngũ cốc ô nhiễm aflatoxin. Các trường hợp bị ngộ độc do chất độc tự
nhiên có trong thực phẩm thường xảy ra trong tình trạng cấp tính rất nặng, tỷ lệ tử vong
khá cao hoặc nếu bị nhiễm lâu dài có thể ảnh hưởng không tốt đến sức khỏe con người.
Trên thực tế nếu bị nhiễm độc tố aflatoxin của vi nấm có trong thực phẩm có thể

nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic. 21 năm sau đó (1878), Lister đã phân
lập được vi khuẩn lactic và đặt tên là Bacterium lactic (ngày nay gọi là Streptococcus
lactic) và đến năm 1881 ngành công nghiệp lên men nhờ vi khuẩn lactic đã được hình
thành.

9


Đồ án tốt nghiệp

Vi khuẩn lactic có vai trò quan trọng trong công nghiệp sữa, muối chua rau quả,
làm yaourt,... cũng như trong nông nghiệp và dược phẩm. Và một đặc tính quan trọng
khác của vi khuẩn lactic là chúng có khả năng tạo ra bacteriocin (chất kháng khuẩn)
như lactacin, brevicin, lacticin, helveticin, sakacin, plantacin,... có tác dụng ức chế một
số vi sinh vật gây bệnh, ngăn chặn sự phát triển của các nguồn bệnh trong thực phẩm
(Batt, 1999; Dubernet et al., 2002).
Vi khuẩn lên men lactic gọi là vi khuẩn lactic, chúng được Pasteur tìm ra từ sữa
bị chua và hiện nay chúng được công nhận là an toàn sinh học (generally recognized as
safe - GRAS), được sử dụng thường xuyên trong thực phẩm và có đóng góp trong hệ vi
sinh vật có ích của con người.
1.2.1.2. Khái niệm
Vi khuẩn lactic là một nhóm các vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, có khả
năng lên men đường để tạo acid lactic, có một sự thống nhất về hình thái, đặc điểm
sinh lí, sinh hóa và sự trao đổi chất. Nhóm vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ
Lactobacteriaccae và được xếp vào năm giống: Streptococcus, Pediococcus,
Lactobacillus và Leuconostoc, Aerococcus. Nhóm vi khuẩn này có rất nhiều hình dạng
khác nhau, chẳng hạn như chúng là trực khuẩn ngắn hay que (rod) dài ở dạng đơn, đôi
hoặc xếp thành chuỗi và cầu khuẩn (cocci) không hô hấp, không sinh bào tử. Chúng
thường được tìm thấy trong các chất bị phân hủy và sản phẩm chứa lactic được tạo ra
như là sản phẩm chủ yếu của sự trao đổi chất và là kết thúc của quá trình lên men


Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.1: Cây phát sinh loài của vi khuẩn lactic. (Owen R. Fennema et al. 2004)

Trong đó: - Khoảng cách tiến hóa gần bằng nhau.
- Trong đó nhóm được đống khung là nhóm vi khuẩn được xem là an
toàn với con người.
1.2.1.3. Đặc tính chung
Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, catatalase âm
tính và là vi khuẩn kỵ khí chịu oxy (aerotolerant organisms), trao đổi chất chủ yếu bằng
con đường lên men và không hô hấp do không có cytochromes, chỉ trừ giống
Bifidobacterium là kỵ khí bắt buộc. Vi khuẩn lactic có thể lên men các loại đường
monosaccharide và disaccharide nhưng không phải tất cả các vi khuẩn lactic đều lên
men được bất kỳ loại disaccharide nào, một số không lên men được saccharose, một số

12


Đồ án tốt nghiệp

không sử dụng được lactose, các vi khuẩn lactic không lên men được tinh bột (trừ
chủng Lactobacillus delbruceckii) và các polysaccaride khác.
Theo khóa phân loại của Bergey 1986 giới thiệu về các giống của vi khuẩn lactic,
thì có 5 giống phù hợp với mô tả chung về vi khuẩn lactic: Streptococcus, Pediococcus,
Lactobacillus, Leuconostoc, Aerococcus. Trước đây giống Bifidobacterium cũng được
xếp vào nhóm vi khuẩn lactic trong khóa phân loại của Bergey 1957, trong đó chúng
được xem là Lb. bifidum mặc dù Bifidobacterium không phù hợp với các mô tả chung
của vi khuẩn lactic mà chúng liên quan nhiều hơn đến nhóm Actinomycetaceae một
nhóm vi khuẩn gram dương và có con đường lên men đường khác với vi khuẩn lactic.