BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

THỬ NGHIỆM CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ KHẢ
NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN
BACILLUS SPP. VÀ LACTOBACILLUS SPP. ĐỐI VỚI
MỘT SỐ NẤM MỐC SINH ĐỘC TỐ AFLATOXIN

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG
Sinh viên thực hiện
MSSV: 1515100007

: LÊ NGÔ VŨ PHƯỢNG
Lớp: 15HSH01

TP. Hồ Chí Minh, 2016.


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự
hướng dẫn của TS. Nguyễn Hoài Hương khoa Công Nghệ Sinh Học- Thực PhẩmMôi Trường của trường Đại Học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh.

TP. HCM, ngày 12 tháng 8 năm 2016
Sinh viên thực hiện
Lê Ngô Vũ Phượng

ii


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC
TRANG
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .......................................................... vi
DANH MỤC BẢNG .................................................................................. vii
DANH MỤC HÌNH ................................................................................... ix
MỞ ĐẦU .................................................................................................... 2
CHƢƠNG I: TÔNG QUAN ................................................................... 4
1.1. Tổng quan về nấm: .................................................................................. 4
1.1.1. Giới thiệu chung .................................................................................... 4
1.1.2. Độc tố do nấm tiết ra .............................................................................4
1.1.3. Tác hại của nấm .................................................................................... 5
1.1.3.1. Tác hại của nấm gây cho người và động vật......................................5
1.1.3.2. Tác hại của nấm gây cho thực vật ...................................................... 6
1.1.4. Một số chủng nấm gây hại trên thực phẩm ...........................................6
1.2. Tổng quan về hợp chất kháng nấm: ........................................................ 7
1.2.1. Hợp chất kháng nấm hóa học ................................................................ 10
1.2.2. Tác hại của hợp chất kháng nấm hóa học .............................................10
1.2.3. Hợp chất kháng nấm trong sinh học ..................................................... 13
1.2.3.1.

Hợp chất kháng nấm từ thực vật: .................................................... 13

2.6.1. Sơ đồ nghiên cứu.................................................................................... 29
2.6.2. Khảo sát sự tăng trường của nấm mốc: .................................................. 30
2.6.3. Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phương pháp ria 2
đường vi khuẩn của 2 chủng VK Bacillus spp. và Lactobacillus spp. với nấm mốc:
.......................................................................................................................... 30
2.6.4. Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phương pháp đặt thạch
khuếch tán của 2 chủng VK Bacillus spp.và Lactobacillus spp.với nấm mốc:
.......................................................................................................................... 35
2.6.5. Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng che phủ theo phương pháp đỗ dĩa 2
lớp của 2 chủng vi khuẩn Bacillus spp. và Lactobacillus spp. với nấm mốc: .
.......................................................................................................................... 39
2.6.6. Một số phương pháp khảo sát hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa của một số
chủng vi khuẩn .................................................................................................43
2.6.6.1. Nhuộm gram........................................................................................ 43
2.6.6.2. Nhuộm bào tử ...................................................................................... 44
2.6.6.3. Một số thử nghiệm sinh hóa: ............................................................... 44

iv


Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN .......................................... 45
3.1. Định danh sơ bộ khảo sát sinh lý - sinh hóa của một số chủng vi khuẩn
..................................................................................................................... 45
3.1.1. Nhuộm Gram:.................................................................................... 45
3.1.2. Nhuộm bào tử: ................................................................................... 46
3.1.3. Một số thử nghiệm sinh hóa:............................................................. 47
3.2. Khảo sát sự tăng trưởng của nấm mốc: ............................................... 48
3.3. Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phương pháp ria 2 đường vi khuẩn

NB

Nutrient Broth

MT

Môi trường

PDA

Potato dextrose agar

VK

Vi khuẩn

VSV

Vi sinh vật

vi


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1.Một số hợp chất kháng nấm hóa học được sử dụng để bảo quản hạt giống
.......................................................................................................................... 9

Bảng 1.2.Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men

Bảng 3.10.So sánh số liệu vòng ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn
Lactobacillus spp. mạnh nhất trong từng nhóm theo phương pháp đặt thạch khuếch
tán ..................................................................................................................... 77
Bảng 3.11. Thống kê số liệu trung bình ức chế các chủng nấm mốc của các chủng vi
khuẩn Bacillus spp. theo từng nhóm với phương pháp đỗ dĩa 2 lớp ..............
.......................................................................................................................... 84
Bảng 3.12. Sắp xếp sô liệu trung bình ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn
Bacillus spp. trong các nhóm theo phương pháp đõ dĩa 2 lớp ......................... 85
Bảng 3.13. Sắp xếp số liệu trung bình ức chế của các chủng nấm mốc của các vi
khuẩn Lactobacillus spp. theo từng nhóm với phương pháp đỗ dĩa 2 lớp .......
.......................................................................................................................... 89
Bảng 3.14. Sắp xếp sô liệu trung bình ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn
Lactobacillus spp. trong các nhóm theo phương pháp đỗ dĩa 2 lớp ............... 90
Bảng 3.15. Thống kê điểm các chủng vi khuẩn Bacillus spp. theo từng phương pháp
dựa theo xếp hạng LSD .................................................................................... 91
Bảng 3.16.. Thống kê điểm các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp. theo từng
phương pháp dựa theo xếp hạng LSD .............................................................. 92

viii


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của Metalaxyl ....................................................... 10
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của Manocozeb .................................................... 11
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của Hexacoconazole ............................................11
Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của Pyrones ......................................................... 14
Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của Viridines ........................................................ 15
Hình 1.6. Phương pháp cấy ria 2 đường thể hiện sự đối kháng của vi khuẩn

Hìn h 2.7.Sơ đồ chi tiết khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn với
nấm mốc theo phương pháp đỗ dĩa 2 lớp thạch ............................................... 40
Hình 3.1. HÌnh thái khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn Bacillus spp ............... 45
HÌnh 3.2. Nhuộm Gram các chủng vi khuẩn ................................................... 46
Hình 3.3. Nhuộm bào tử các chủng vi khuẩn ................................................... 47
Hình 3.4. Sự phát triển của nấm mốc sau 3 ngày trên MT PDA ..................... 48
Hình 3.5. Sự phát triển của nấm mốc sau 3 ngày trên MT MRS Cải tiến .......49
Hình 3.8. Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế nấm mốc của nhóm Bacillus spp phân lập tử
phụ phế phẩm ...................................................................................................55
Hình 3.9. Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế nấm mốccủa nhóm Bacillus spp phân lập tử
phụ đất .............................................................................................................. 56
Hình 3.10 Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế nấm mốc của nhóm Bacillus spp phân lập
tử nước thải ......................................................................................................57
Hình 3.13. Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế nấm mốccủa nhóm Lactobacillus sp phân
lập tử nem .........................................................................................................63

x


Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.14. Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế nấm mốc của nhóm Lactobacillus sp phân
lập tử cơm mẻ ...................................................................................................64
Hình 3.18. Biểu đồ thể hiện vòng ức chế nấm mốc của nhóm Bacillus spp phân lập
tử phụ phế phẩm ............................................................................................... 70
Hình 3.19. Biểu đồ thể hiện vòng ức chế nấm mốc của nhóm Bacillus 66spp phân
lập tử đất ...........................................................................................................71
Hình 3.20. Biểu đồ thể hiện vòng ức chế nấmmốccủa nhóm Bacillus spp phân lập
tử nước thải ......................................................................................................72
Hình 3.24. Biểu đồ thể hiện vòng ức chế nấm mốc của nhóm Lactobacillus sp

Lactobacillus spp. đối với một số nấm mốc Aspergillus spp. sinh aflatoxin”.

1


2. Tình hình nghiên cứu:
Có rất nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật để kháng nấm mốc gây
hại trong nông sản và thực phẩm theo nhiều phương pháp khác nhau.
 Trong nước đã có nhiều công trình nghiên cứu dùng vi sinh vật để kháng lại
nấm mốc theo phương pháp đối kháng trực tiếp (Magaldi,2004) như: “ Phân
lập tuyển chọn vi khuẩn Bacillus spp. ứng dụng trong bảo quản nông sản”
(Văn Hương, 2015), đồ án tốt nghiệp “Khảo sát khả năng kháng nấm nhiễm
thực phẩm Aspergillus Niger và Mucor sp. Của vi khuẩn Lactobacillus
L5”(Phan Nguyễn Hương Thảo, 2015)….


Ngoài nước có công trình nghiên cứu hoạt động kháng nấm của vi khuẩn
lactic được phân lập từ Kim Chi để kháng lại Aspergillus fumigatus Jeong75, Hàn Quốc theo phương pháp đối kháng che phủ (Magnusson và
Schnurer,2001) .

3. Mục đích nghiên cứu:
Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng kháng nấm mốc cao và hiệu quả
nhất từ bộ sưu tập các chủng vi khuẩn Bacillus spp. và Lactobacillus spp. của
phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm- Môi Trường của trường.

4. Mục tiêu nghiên cứu:
Tìm ra phương pháp đánh giá khả năng đối kháng vi nấm hiệu quả nhất và dễ
thực hiện áp dụng trên bộ sưu tập các chủng vi khuẩn Bacillus spp. và
Lactobacillus spp. của phòng thí nghiệm khoa Công Nghệ Sinh Học- Thực
Phẩm- Môi Trường.

có hoạt tính kháng nấm tốt nhất trong bộ sưu tập của phòng thí nghiệm.
 Đánh giá tỉ lệ ức chế các loại vi nấm của 2 chủng vi khuẩn thông qua phương
pháp kháng nấm trực tiếp theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn. (Dual
Culture Two Line Culture Method).
 Xác định đường kính ức chế các loại nấm mốc của 2 chủng vi khuẩn qua
phương pháp đối kháng trực tiếp theo cách đặt thạch khuếch tán (Agar Plug
Diffusion Method).
 Đánh giá khả năng ức chế các loại nấm mốc của 2 chủng vi khuẩn qua
phương pháp đối kháng che phủ (Overlay Method).
 Đã chọn được phương pháp cho kết quả ổn định nhất trong phòng thí
nghiệm.

3


8. Kết cấu đồ án:
 Mở đầu
 Chương 1: Tổng quan tài liệu- Nội dung chương đề cập đến các nội dung liên
quan đến tài liệu nghiên cứu.
 Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu – Nội dung chương đề cập
đến các dụng cụ, thiết bị và phương pháp nghiên cứu trong đồ án.
 Chương 3: Kết quả và thảo luận – Nội dung chương đưa ra những kết quả
mà đề tài thực hiện được và đưa ra những thảo luận, biện chứng kết quả thu
được
 Kết luận và kiến nghị- Nội dung tóm lại những kết quả mà đề tài đã đạt được
và kiến nghị cho những hướng cần cải tiến thêm trong đề tài.

4




ra bằng trao đổi thứ cấp của các nấm mốc và gây độc đối với động vật có
vú, gia cầm và con người.
 Hiện nay, có khoảng 300 loài độc tố được phát hiện và nghiên cứu. Tuy
nhiên, chỉ có khoảng 20 loài độc tố gây hại lên thực phẩm ở mức độ
nghiêm trọng và liên quan đến an toàn thực phẩm. Được tạo ra từ 5 chi
nấm: Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Alternaria, Clavicep, chúng
bao gồm:
 Các độc tố của Aspergillus: Aflatoxin (B1, B2, M1, M2 và G1, G2),
Ochratoxin A, Stermatocystin, Axit Cyclopianxoic.
 Các độc tố của Penicillium: Pautulin, Ochratoxin A, Citrinin,
Penitrem A, Fumonisin, Moniliformin….
 Các độc tố của Fusarium: Deoxynivalenon, Nivalenon, Zearalenon,
T-2 toxin.
 Các độc tố của Alternaria: Axit Tenuazoic, Alternarion, Methyl
Ether Alternarion.
 Các độc tố của Clavicep: các alkaloid của nấm cựa gà.
 Trong đó, nấm gây độc chủ yếu và nguy hại nhất là Aflatoxin. Chúng là
độc tố vi nấm do nấm mốc Aspergillus flavus, A.parasiticus sản sinh ra,
thường gây độc tố ô nhiễm lên các loại đậu (như đậu phộng). Phản ứng
gây độc chủ yếu của chúng là trong gan. Nếu mức độ gây nhiễm thấp sẽ
tích lũy dần trong gan và làm giảm khả năng sinh sản của động vật về lâu
dài sẽ gây ra bệnh ung thư.
 Ngoài ra, còn có 1 số độc tố của các vi nấm thường gặp như Ochratoxin
Penicillium và Aspergillus tiết ra. Độc tố Zearalenon và Tricothecenes
chủ yếu do nấm Fusarium tiết ra, độc tố Patulin lại do nấm Penicillium
và Fumonisin tiết ra.

6


1.1.4. Một số chủng nấm gây hại trên thực phẩm:
 Trong hệ vi khuẩn, nấm mốc thiên nhiên (Fungal flora) có 3 chủng giống
nấm mốc chiếm ưu thế đã và đang gây độc cho thực phẩm là Aspergillus,
7


Fusarium và Penicillium thường tiết độc tố vi nấm vào thực phẩm vào
thời gian trước, trong và sau khi thu hoạch ngũ cốc, hạt có dầu, đậu
đỗ,…
 Có 4 tác động gây độc của độc tố vi nấm là: độc cấp tính, mãn tính, gây
đột biến và quái thai. Phổ biến nhất là độc cấp tính, làm hư gan và rối
loạn chức năng hoạt động của thận, có thể gây chết đối với trường hợp
nặng. Các độc tố vi nấm tác động lên hệ thần kinh, ở nồng độ thấp gây tê
liệt động vật và ở nồng độ cao có thể gây tổn thương não và chết. Nhiều
công trình thử nghiệm đã xác định độc tố vi nấm có thể gây ung thư, đặc
biệt là ở gan. Qua thử nghiệm trên động vật nuôi trong nhà đã xác định
có một số độc tố vi nấm gây rối loạn tới sự sao chép ADN và gây hậu
quả là đột biến hoặc quái thai.

1.2. Tổng quan về các hợp chất kháng nấm:
Hợp chất kháng nấm là các chất ức chế sự tăng trưởng của nấm có tầm
quan trọng trong việc kiểm soát các tác nhân gây bệnh của nấm đối với
con người và động vật và trong việc phòng chống nấm mốc trong thực
phẩm và các vật liệu khác.
1.2.1. Hợp chất kháng nấm hóa học:
 Các hợp chất kháng nấm hóa học đa số đều có mặt trong các loại thuốc
trừ nấm mốc gây hại cho nông sản như Carbendazim, Metalaxyl, Anvil,
….

8

bisthiocyanate (EBI). EBIS và EBI tác động tới các enzyme có chứa nhóm
sulphydryl gây ức chế hoạt động của sáu quá trình sinh hóa khác nhau
trong tế bào chất và ty thể, phá vỡ sự nảy nầm của bào tử nấm mốc.( trích
dẫn từ Chi cục trồng trọt và bảo vệ thực vật tỉnh Lâm Đồng, 2014).

Hình 1.2: Cấu trúc hóa học của Manocozeb

10


 Hexaconazole có công thức hóa học là C19H17Cl2N3O3 là hoạt chất có chứa
trong thuốc kháng nấm hóa học Anvil 5SC. Là hoạt chất trừ nấm phổ
rộng, tiêu diệt nấm mốc thông qua cơ chế ngăn cản sinh tổng hợp
Ergosterol (chất cấu tạo nên màng nấm mốc), nấm sẽ bị cô lập và ngừng
phát triển do chúng không hình thành được tế bào mới. Chất này được mô
cây hấp thu rất nhanh, chuyển vị và lưu dẫn mạnh nên kiểm soát nấm mốc
nhanh chóng và hiệu quả và kéo dài cơ chế vừa phòng vừa trị bệnh.

Hình 1.3: Cấu trúc hóa học của Hexaconazole.
1.2.2. Tác hại của hợp chất kháng nấm hóa học:
 Bên cạnh các lợi ích trong việc kháng nấm thì các hợp chất hóa học gây
ảnh hưởng mạnh đến môi trường và sức khỏe của con người và động vật.
Theo điều tra của cục Y tế dự phòng và môi trường Việt Nam, hằng năm
có trên 5000 trường hợp nhiễm độc hợp chất hóa học phải cấp cứu tại
bệnh viện và có trên 300 trường hợp tử vong (do ngộ độc cấp tính) vì
lượng chất hóa học còn tồn đọng quá cao trong thực phẩm. Nếu liều
lượng ít, được đưa gián tiếp vào cơ thể thông qua thực phẩm, về lâu dài
từ 3-5 năm sẽ phát bệnh (tim mạch, ung thư…)
 Đối với con người: cơ thể con người nhiễm độc các hợp chất hóa học
biểu hiện ở nhiều mức độ như là giảm sức khỏe, gây rối loạn hoạt động ở

chế được các tác nhân gây bệnh, trong đó có 1 số chất như là chất có thể
chuyển hóa thành hợp chất thứ cấp hoặc chất có tính kháng sinh. Các
chất đó giúp cho vi khuẩn có thể ức chế hay tiêu diệt các loại vi sinh vật
cạnh tranh với chúng trong cùng điều kiện sống thích hợp. Thật vậy, ta
có thể tìm thấy một số hợp chất thứ cấp từ các vi khuẩn có lợi khác nhau
đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát sinh học trong quá trình
phát hiện bệnh trong cây trồng, chúng đã và đang được mọi người trên
toàn thế giới sử dụng để làm thuốc bảo vệ cây trồng hay phân bón sinh

12


học. Ngoài ra, các hợp chất thứ cấp khôn những giúp cho thực vật chống
lại các tác nhân gây bệnh từ nấm mốc mà còn giúp chúng tăng trưởng và
phát triển tốt hơn. Điển hình là hợp chất thứ cấp được tiết ra từ nấm
Trichoderma, chúng chống lại được phytopathogens và một số chất khác
ảnh hương đến sự trao đổi chất của thực vật.
 Chất gây hại chủ yếu trong các bệnh của cây trồng chủ yếu là
phytopathogenic, các hợp chất thứ cấp trong sinh học có thể kháng lại
chúng mà không gây ô nhiễm môi trường, không gây hại đến con người
và động vật, ít tốn kém, quan trọng hơn hết là không làm cho các chất
hây hại có khả năng kháng thuốc nhanh như các chất hóa học.
 Các hợp chất thứ cấp (SM) là sự chuyển hóa hóa học các hợp chất khác
nhau có trọng lượng phân tử tương đối thấp (