BỘ Y TẾ
---------------------------

KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU GHÉP TẾ BÀO GAN PHÔI THAI
NGƯỜI ĐỂ ĐIỀU TRỊ MỘT SỐ BỆNH GAN CHUYỂN
HÓA DI TRUYỀN Ở TRẺ EM

CƠ QUAN CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI: BỆNH VIỆN NHI TRUNG ƯƠNG
CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: GS.TS.NGUYỄN THANH LIÊM

8729

Hà Nội - 2010


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU..................................................................................................

3

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU...............................................

5

1.1.

Tế bào gốc...................................................................................

5


1.2.2.

Nguồn gốc và đặc điểm...............................................................

8

1.2.3.

Tiềm năng ứng dụng....................................................................

10

1.3.

Các nghiên cứu trong và ngoài nước ghép tế bào gan............

11

1.3.1.

Nghiên cứu ở nước ngoài............................................................

11

1.3.2.

Nghiên cứu tại Việt Nam.............................................................

12


Hóa miễn dịch huỳnh quang.................................................

14

2.2.4.

Đánh dấu tế bào gan phôi thai người invitro........................

15

2.2.5.

Ghép tế bào trên mô hình chuột thí nghiệm..........................

15

2.2.6.

Mô và tế bào học..................................................................

16

2.2.7.

Thu thập và phân tích số liệu................................................

16

2.3.

Quy trình nuôi cấy tế bào gan thai người.............................

19

3.1.4.

Quy trình phản ứng hóa miễn dịch huỳnh quang.................

20

3.1.5.

Quy trình đánh dấu tế bào gan invitro bằng HOECHST.......

21

3.1.6.

Quy trình ghép tế bào trên mô hình chuột thí nghiệm...........

22

3.1.7

Quy trình phân tích mô và tế bào học...................................

24

3.1.8.


Ghép tế bào gan vào mô hình chuột thí nghiệm...................

29

3.7.

Phân tích mô bệnh học.........................................................

32

CHƯƠNG IV: BÀN LUẬN................................................................

34

4.1.

Phân lập tế bào gan phôi thai người.....................................

34

4.2.

Nuôi cấy tế bào gan phôi thai người.....................................

34

4.3.

Hóa miễn dịch huỳnh quang tế bào......................................


Tiếng Việt

Viết tắt

Stem cells

Tế bào gốc

Embryonic stem cells

Tế bào gốc phôi

ES

Adult stem cells

Tế bào gốc trưởng thành

AS

Pluripotent

Tế bào gốc vạn tiềm
năng

Multipotent

Tế bào gốc đa tiềm năng

Hepatoblast

ECs

Meschymal stem cells

Tế bào gốc trung mô

MCs

Institut national de la sante and de Viện nghiên cứu quốc
la recherche medicale

FBS

INSERM

gia về sức khỏe và y tế
Sinh học phân tử

1

SHPT


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH TRONG ĐỀ TÀI
STT

Tên hình vẽ

Trang


Hình 3.2

Tế bào gan thai người ngày thứ 4 và thứ 5 sau nuôi

27

cấy
Hình 3.3

Hóa miễn dịch huỳnh quang tế bào với các marker

28

Hình 3.4

Đánh dấu tế bào gan thai người bằng HOECHST

29

Hình 3.5

Bộc lộ vùng gan và tĩnh mạch cửa và cắt gan thùy

31

phải
Hình 3.6

Ghép tế bào gan vào tĩnh mạch cửa




MỞ ĐẦU
Tế bào gốc là một nhóm các tế bào có khả năng vô hạn trong việc tự thay
mới, và biệt hoá thành nhiều loại tế bào của các mô, cơ quan khác nhau trong
cơ thể. Vì thế, tế bào gốc được xem như một nguồn tế bào tiềm năng có thể
dùng để khôi phục và tái tạo lại những tổn thương của các mô và cơ quan. Để
đạt được mục đích này, tế bào gốc cần được biệt hoá invitro và/hoặc invivo
thành các các tế bào của các mô và cơ quan cần tái tạo. Gan là một trong
những cơ quan lớn nhất và mang nhiều chức năng nhất của cơ thể, đặc biệt là
chức năng chuyển hoá và giải độc, nên gan cũng là cơ quan rất dễ bị tổn
thương bởi nhiều nguyên nhân bẩm sinh và mắc phải dẫn đến rối loạn chuyển
hoá của gan. Đây là trạng thái bệnh lý nếu không được điều trị sẽ nhanh
chóng dẫn đến tử vong. Hiện nay ghép gan đang là phương pháp điều trị hiệu
quả duy nhất cho các tổn thương gan trầm trọng. Tuy nhiên biện pháp này gặp
rất nhiều khó khăn như kỹ thuật can thiệp phức tạp, tỷ lệ thải ghép cao và đặc
biệt là hạn chế về số lượng người cho gan. Trong bối cảnh đó, liệu pháp tế
bào sử tế bào gốc biệt hoá thành tế bào gan rồi cấy ghép để chúng tái tạo lại
gan tổn thương được xem như một hướng điều trị mới đầy triển vọng. Có
nhiều nguồn tế bào gốc đã được sử dụng để biệt hoá thành tế bào gan, tuy
nhiên, lựa chọn nguồn tế bào gốc nào để biệt hoá đã và đang là một thách
thức với các nhà nghiên cứu. Bên cạnh đó khi sử dụng các tế bào được biệt
hóa từ tế bào gốc để cấy ghép khác gen cùng loài thì tính sinh miễn dịch của
tế bào được ghép là yếu tố quan trọng quyết định phản ứng thải ghép hay
thành công của cuộc ghép.
Trong bối cảnh đó, tế bào gan phôi thai người xuất hiện như một ý tưởng mới
trong lĩnh vực ghép tế bào gốc, và trở thành một nguồn cho hứa hẹn với nhiều
ưu thế về hình thái, độ biệt hóa và tính sinh miễn dịch.

3

làm hai nhóm chính : tế bào gốc phôi (Embryonic stem cells) và tế bào gốc
trưởng thành (Adult stem cells). Tế bào gốc phôi là những tế bào đầu tiên của
giai đoạn phôi hình thành từ 5-7 ngày tuổi sau khi thụ tinh. Đây là những tế
bào gốc vạn tiềm năng (Totipotent), có khả năng biệt hoá thành tất cả hoặc
hầu hết các loại tế bào khác nhau của cơ thể [3]. Tế bào gốc trưởng thành là

5


những tê bào trong nhiều loại mô và cơ quan của cơ thể từ sau khi được sinh
ra đến lúc trưởng thành. Đây là những tế bào gốc vạn tiềm năng hoặc đa tiềm
năng (Multipotent), có khả năng biệt hoá thành một số loại tế bào khác nhau
của cơ thể, như tế bào gốc tạo máu trong tuỷ xương [4]. Ngoài ra, còn có
những tế bào gốc phân lập từ các mô và tổ chức của giai đoạn thai. Những tế
bào này có thể là tế bào gốc vạn tiềm năng hoặc tế bào gốc đa tiềm năng, như
tế bào gốc của gan thai nhi (Hepatoblast), tế bào gốc máu dây rốn (Cord
Blood Stem cells) [5].

Hình 1.2. Phân loại tế bào gốc
(Nguồn từ />
1.1.3. Tiềm năng ứng dụng:
Tế bào gốc hiện nay được xem như một nguồn tế bào tiềm năng có thể được
sử dụng trong việc khôi phục và tái tạo lại những tổn thương của các mô và
cơ quan trong một số bệnh lý mạn tính và nan y. Với mục đích này, tế bào gốc
được sử dụng để biệt hoá invitro và invivo thành các các tế bào của các mô và
cơ quan đặc hiệu.
Các nghiên cứu về tế bào gốc hiện nay tập trung chủ yếu vào việc tìm hiểu và

6


7


tế bào gốc phôi hiện nay đang gặp phải nhiều trở ngại về vấn đề đạo đức.
Các nghiên cứu về tế bào gốc hiện nay chủ yếu sử dụng nguồn tế bào gốc từ
thai hoặc nguồn tế bào gốc trưởng thành (Adult stem cell). Đầu tiên, là các
nghiên cứu tập trung vào việc sử dụng nguồn tế bào gốc từ tuỷ xương (BM)
để sửa chữa các tổn thương gan invivo. Petersen và CS. [7] đã chỉ ra rằng việc
cấy ghép tuỷ của chuột đực vào gan của chuột cái bị chiếu xạ liều gây chết, và
gan bị gây tổn thương bằng 2-acetylaminofluorene và CCl4, thì có thể cứu con
chuột cái này khỏi việc bị diệt tuỷ bởi tia xạ và đồng thời có một số lượng nhỏ
của các tế bào gốc gan có nguồn gốc từ tuỷ xương được tạo thành. Sau đó, có
rất nhiều nghiên cứu đã được thực hiện đã khẳng định vai trò của những tế
bào này trong việc sửa chữa vùng gan bị tổn thường từ các tế bào gốc có
nguồn gốc từ tuỷ xương [8],[9],[10].
Các nghiên cứu về tế bào gốc trong nước hiện nay chủ yếu tập trung vào
hướng tìm kiếm các nguồn tế bào gốc khác nhau trong mục đích sử dụng
chúng để biệt hoá thành các loại tế bào như: máu, da, xương, sụn. Có một số
nghiên cứu sử dụng tế bào gốc tạo máu trong điều trị cho các bệnh nhân mắc
bệnh máu.
1.2. Tế bào gan phôi thai người:
1.2.1. Định nghĩa:
Gan phôi thai người ở giai đoạn 8-13 tuần tuổi được cấu tạo bởi các tế bào
nhu mô gan phôi thai (hepatoblast). Đây là những tế bào gốc đa tiềm năng
(bipotential stem cells), có khả năng biệt hóa thành hai dòng tế bào riêng biệt:
tế bào gan và tế bào đường mật.
1.2.2. Nguồn gốc và đặc điểm:
Trong quá trình phát triển phôi thai của động vật có vú, gan được hình thành
từ mầm của lá thai trong (tuần thứ 3 của thai kỳ ở người), cùng với sự ra đời
một phần của tụy, phổi và tuyến giáp. Những tế bào tại vùng này tự nhân lên,


Hình 1.3. Quá trình biệt hóa của tế bào gan phôi thai người
Ttheo IMSERM 00-20, Paris 2006)
1.2.3. Tiềm năng ứng dụng :
Một số năm gần đây, các thử nghiệm ghép tế bào gan trưởng thành vào điều
trị cho các bệnh nhân mắc suy gan cấp hoặc mạn tính, hay một số bệnh gan
chuyển hóa di truyền đã được thực hiện ở một số nước như Pháp và Mỹ [13].
Trong một số trường hợp, khi các tế bào gan chưa bị thay đổi về cấu trúc, và
gan chưa có thay đổi về mặt giải phẫu, chỉ có chức năng của tế bào gan bị tổn
thương, thì liệu pháp ghép tế bào trở thành một liệu pháp có nhiều ưu thế
- Ghép tế bào gan giúp giữ được vị trí cấu trúc của mạch máu và đường
mật trong gan của người nhận, chỉ thay thế những tế bào bị tổn thương
bằng những tế bào khỏe mạnh của người cho.
- Bệnh nhân không phải chịu một cuộc phẫu thuật nặng nề, nhiều nguy
cơ
- Những tế bào gan của một người cho duy nhất, có thể cho một vài
người nhận nếu có cùng một điều kiện hòa hợp về miễn dịch, có thể
giải quyết được cơ bản vấn đề thiếu tạng ghép.
- Chi phí cho một cuộc ghép tế bào gan thấp hơn 10% so với một cuộc

10


phẫu thuật ghép gan.

1µm
(b)

(a)


Hơn nữa, nếu ghép tế bào gan trở thành một liệu pháp hiệu quả và rộng rãi
cho các bệnh nhân có tổn thương gan mạn tính thì việc dự trữ tế bào gan cho
nhu cầu này cần phải được thúc đẩy. Do đó, hoặc phải sử dụng ngay phần gan
sau khi lấy ở người cho, phân lập xử lý và sử dụng ngay cho người nhận, hoặc
phải phân lập thành tế bào để bảo quản, dự trữ, vận chuyển. Điều này đặt ra
những thách thức cho các labo nghiên cứu bảo quản tế bào, để đảm bảo khả
năng nhân lên và phát triển của chúng trong giới hạn cho phép sử dụng lại cho
lâm sàng.
1.3.2. Nghiên cứu trong nước:
Hiện tại chưa có tài liệu nghiên cứu hay báo cáo của tác giả nào về phân lập,
nuôi cấy tế bào gan phôi thai người cho mục đích điều trị bệnh tại Việt Nam.

12


CHƯƠNG II
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu:
- 62 mẫu thai trong khoảng 9-13 tuần tuổi của những sản phụ tự nguyện
đình chỉ thai nghén tại Bệnh Viện Phụ Sản Hà nội.
- 15 mẫu thai khoảng 9-13 tuần tuổi của những sản phụ tự nguyện đình
chỉ thai nghén tại Bệnh Viện Kremlin Bicetre, Paris.
- Tế bào gan phôi thai người phân lập từ thai nhi 8-13 tuần tuổi thu thập
- Môi trường với yếu tố tăng trưởng cho tế bào tế bào HHF: DMEMHAM'S F12 Williams E (Sigma)
- Các hóa chất và sinh phẩm dùng để định danh các tế bào sau khi phân
lập bằng phân tích các protein bằng các kỹ thuật miễn dịch huỳnh
quang và flow cytometry
- Động vật : 10 chuột nhắt trắng trưởng thành và 7 chuột sơ sinh 3-5
ngày tuổi dùng để khảo sát khả năng cấy ghép tế bào.
2.2. Phương pháp nghiên cứu:

Williams E (Sigma), kháng sinh Penicilline 100Ul/ml, Streptomycine
100µg/ml (Gibco), 2mM Glutamine (Invitrogen), 0.1% Fetal Bovine Serum
(Gibco), 10-8M 3-3"-triiodo-L-Thyronine (T3) (Sigma), 10-6M Hydrocortisol
(Merk), 10-8M Insuline (Sigma), 0.24% acid linoleic (Sigma), 1mg/ml apotransferin (Sigma) và 100µg/ml Vitamin C (Roche).
2.2.3. Hóa miễn dịch huỳnh quang:
Tế bào gan phôi thai người sau khi rửa 3 lần với PBS 1X (Gibco), được cố
định trong PBS-Triton 0.1% trong 5 phút tại nhiệt độ phòng, chuẩn bị cho gắn
kháng

thể

kháng

cytokeratine,

hoặc

cố

định

trong

PBS-PFA

(Paraformaldehyde 4%) chuẩn bị cho gắn một số kháng thể khác. Sau đó, tế
bào được rửa 3 lần trong PBS 1X và xử lý trong PBS-Gelatin 1% trong vòng
1 giờ để làm tăng tính thấm màng tế bào. Sau đó, tế bào được ủ với một số
loại kháng thể khác nhau: kháng thể đơn dòng của chuột kháng albumin


chuột nhắt trắng trưởng thành với hàm lượng 1ml/20mg trọng lượng. Thời

15


gian tác dụng ước tính trong vòng 30 phút.
Kỹ thuật ghép tế bào:
- Chuột trưởng thành: Sau khi gây mê, chuột được cắt 40% gan ở thùy phải.
Sau đó tế bào đã được đánh dấu được tiêm vào trực tiếp vào tĩnh mạch cửa
nhờ một catheter 29G trong vòng 10 phút. Nồng độ tế bào ước tính 8x105 tế
bào trong 300µl nước muối sinh lý vô trùng,
- Chuột sơ sinh: Tế bào gan sau khi đánh dấu được tiêm trực tiếp vào lách
của chuột sơ sinh 3-5 ngày tuổi bằng một sering Halminton 10µl qua đường
dưới da, không qua gây mê. Nồng độ tế bào ước tính 4x105 tế bào trong 300µl
nước muối sinh lý vô trùng,
2.2.6. Mô và tế bào học:
Chuột sau khi được ghép được nuôi sống trong vòng 2 tuần. Sau đó toàn bộ
gan của chuột đựoc ghép được thu hoạch. Gan sau khi thu hoạch được làm
đông lạnh trong isopentan, và được giữ ở -800C.
Gan đựợc cắt lạnh 7µm, dán trên lam kính, và được phân tích dưới kính hiển
vi huỳnh quang.
2.2.7. Thu thập và phân tích số liệu:
Đếm số lượng tế bào được đanh dấu trên mỗi lam kính
Phân tích số liệu: Xác định phần trăm số tế bào cấy đựoc vào gan chuột = (số
tế bào đếm được trên tiêu bản/100/450)x100.
2.3. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu:
Nghiên cứu được tiến hành dựa trên sự hợp tác giữa Bệnh Viện Nhi TƯ và
phòng thí nghiệm 00-20, với sự đồng ý của hội đồng y đức ký kết giữa Bệnh
Viện Kremlin Bicetre và phòng thí nghiệm 00-20.
Nghiên cứu cũng nhận được sự hợp tác với Bệnh Viện Phụ Sản Hà nội trong

- Máy khuấy từ có gia nhiệt
- Con khuấy từ
- Cóng Scott 100 ml vô trùng
- Màng lọc 70µm vô trùng dùng một lần
- Pipet aid, pipet thủy tinh 5ml,10ml,25ml.

17


- Máy ly tâm góc văng
Chuẩn bị hóa chất:
- PBS 1X x 1000 ml đã khử trùng
- HEPES
- Collagenase type III (PAA)
- Môi trường nuôi cấy: DMEM-HAM'S F12 Williams E (Sigma), kháng
sinh Penicilline 100Ul/ml, Streptomycine 100µg/ml (Gibco), 2mM
Glutamine (Invitrogen), 0.1% Fetal Bovine Serum (Gibco), 10-8M 3-3"triiodo-L-Thyronine (T3) (Sigma), 10-6M Hydrocortisol (Merk), 10-8M
Insuline (Sigma), 0.24% acid linoleic (Sigma), 1mg/ml apo-transferin
(Sigma) và 100µg/ml Vitamin C (Roche).
Quy trình xử lý và phân lập tế bào:
- Tổ chức thai được đặt trên khay thủy tinh, rửa qua bằng PBS 1X.
- Gan của thai nhi được phân lập từ tổ chức thai bằng mắt thường, sử
dụng panh kéo và dao cắt.
- Các mảnh gan được thu thập vào tube Corning 15ml vô trùng, đựng sẵn
dung dịch HEPES.
- Ly tâm ống 15ml 3 lần với HEPES,
- Chuẩn bị máy khuấy từ 370C, cóng Scott đựng 50ml HEPES có
Collagenase type 3, nồng độ 1-2mg/ml tùy theo tuổi thai.
- Cho các mảnh gan vào dung dịch trên, khuấy trên máy khuấy từ 370C
trong 1 giờ.

thỏ kháng α1-antitrypsin người (1/100, Dako), kháng thể đơn dòng của
chuột kháng CK-19 (1/100, Dako), kháng CK-18 (1/200, Dako), kháng
CK-17 (1/100, Dako), kháng CK8/18 (1/200, Dako). kháng thể đơn
dòng ở chuột kháng E-Cadherin người (1/200, Dako).
Quy trình phản ứng hóa miễn dịch huỳnh quang:
- Tế bào gan được rửa 3 lần với PBS 1X (Gibco)
- Tế bào được cố định trong PBS-Triton 0.1% trong 5 phút tại nhiệt độ
phòng, chuẩn bị cho gắn kháng thể kháng cytokeratine,
- Hoặc cố định trong PBS-PFA (Paraformaldehyde 4%) chuẩn bị cho gắn

20


một số kháng thể khác. S
- Sau khi cố định, tế bào được rửa 3 lần trong PBS 1X
- Xử lý trong PBS-Gelatin 1% trong vòng 1 giờ để làm tăng tính thấm
màng tế bào.
- Tế bào được ủ với một số loại kháng thể khác nhau: kháng thể đơn
dòng của chuột kháng albumin người, gắn trực tiếp với FUTC
(fluorochrome) (1/100, Dako), hoặc với kháng thể đơn dòng của thỏ
kháng α1-antitrypsin người (1/100, Dako), kháng thể đơn dòng của
chuột kháng CK-19 (1/100, Dako), kháng CK-18 (1/200, Dako), kháng
CK-17 (1/100, Dako), kháng CK8/18 (1/200, Dako, kháng thể đơn
dòng ở chuột kháng E-Cadherin người (1/200, Dako).
- Sau khi ủ với kháng thể, tế bào được rửa 3 lần với PBS 1X để loại bỏ đi
những kháng thể thừa không được gắn trên màng tế bào.
- Ủ với kháng thể thứ hai kháng lại kháng thể đầu tiên, gắn với FITC
(1/1500).
- Tiêu bản sau khi hoàn thành được phủ một lớp DAPI cho phép nhuộm
nhân tế bào thành màu xanh, và phân tích dưới kính hiển vi huỳnh

- Dao mổ, kéo, panh
- Bàn cố định chuột phủ toan vô trùng
- Băng dính cố định
- Tampon vô trùng
- Gạc vô trùng
Chuẩn bị hóa chất:
- Ketamin (Imagene)
- Xylastin (Rampoun)
- Nước muối sinh lý.
- Betadine
Chuẩn bị chuột thí nghiệm:
- Chuột trưởng thành
- Chuột sơ sinh 3-5 ngày tuổi

22