BỘ Y TẾ
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU GHÉP TẾ BÀO GAN PHÔI THAI
NGƯỜI ĐỂ ĐIỀU TRỊ MỘT SỐ BỆNH GAN CHUYỂN
HÓA DI TRUYỀN Ở TRẺ EM

CƠ QUAN CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI: BỆNH VIỆN NHI TRUNG ƯƠNG
CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: GS.TS.NGUYỄN THANH LIÊM 8729 Hà Nội - 2010
BỘ Y TẾ


Hà Nội - 2010

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 3
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5
1.1.
Tế bào gốc 5
1.1.1. Định nghĩa 5
1.1.2. Phân loại 5
1.1.3. Tiềm năng ứng dụng 6
1.2.
Tế bào gan phôi thai người 8
1.2.1. Định nghĩa 8
1.2.2. Nguồn gốc và đặc điểm 8
1.2.3. Tiềm năng ứng dụ
ng 10
1.3.
Các nghiên cứu trong và ngoài nước ghép tế bào gan 11
1.3.1. Nghiên cứu ở nước ngoài 11
1.3.2. Nghiên cứu tại Việt Nam 12
CHƯƠNG II: ĐÔI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13
2.1.
Đối tượng nghiên cứu 13
2.2.
Phương pháp nghiên cứu 13
2.2.1. Phân lập tế bào gan phôi thai người 13
2.2.2 Nuôi cấy tế bào gan phôi thai người 14
2.2.3. Hóa miễn dịch huỳnh quang 14
2.2.4. Đánh dấu tế bào gan phôi thai người

Phân tích mô bệnh học 32
CHƯƠNG IV: BÀN LUẬN 34
4.1.
Phân lập tế bào gan phôi thai người 34
4.2.
Nuôi cấy tế bào gan phôi thai người 34
4.3.
Hóa miễn dịch huỳnh quang t
ế bào 35
4.4.
Kết quả đánh dấu tế bào invitro bằng HOECHST 36
4.5.
Ghép tế bào gan trên mô hình chuột thí nghiệm 37
4.6.
Phân tích mô bệnh học 39
CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

1
BÁO CÁO THỐNG KÊ
KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
I. THÔNG TIN CHUNG
1. Tên đề tài: "Nghiên cứu ghép tế bào gan phôi thai người để điều trị một số
bệnh gan chuyển hóa di truyền ở trẻ em"
Thuộc: Bệnh Viện Nhi Trung Ương
- Chương trình: Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ

- Lần 2 ….
2. Kinh phí và sử dụng kinh phí:
a) Tổng số kinh phí thực hiện: 450 tr.đ, trong
đó:
+ Kính phí hỗ trợ từ SNKH: 450 tr.đ.
+ Kinh phí từ các nguồn khác: 0 tr.đ.
+ Tỷ lệ và kinh phí thu hồi đối với dự án (nếu có):
b) Tình hình cấp và sử dụng kinh phí từ nguồn SNKH:
Theo kế hoạch Thực tế đạt được
Số
TT
Thời gian
(Tháng,
năm)
Kinh phí
(Tr.đ)
Thời gian
(Tháng, năm)
Kinh phí
(Tr.đ)
Ghi chú
(Số đề nghị
quyết toán)
1 9/2006- 100 2006 16.42
2 2007 100 2007 95,998
3 2008 250 2008 104
4 9/2009 2009 155,46
5 2010 38
… 409,878
c) Kết quả sử dụng kinh phí theo các khoản chi: Còn dư 40,122 triệu đồng là kinh

Tổng cộng 450 450 409,878 409,878
- Lý do thay đổi (nếu có): Còn dư 40,122 triệu đồng để nghiệm thu và lấy ý kiến
chuyên gia, hội thảo ,đóng quyển
Đối với dự án:
Đơn vị tính: Triệu đồng
Theo kế hoạch Thực tế đạt được
Số
TT
Nội dung các
khoản chi
Tổng SNKH Nguồn
khác
Tổng SNKH Nguồn
khác
1 Thiết bị, máy móc
mua mới

2 Nhà xưởng xây
dựng mới, cải tạo

3 Kinh phí hỗ trợ
công nghệ

4 Chi phí lao động
5 Nguyên vật liệu,
năng lượng

6 Thuê thiết bị, nhà
xưởng


tham gia
chủ yếu
Sản phẩm
chủ yếu đạt
được
Ghi chú*
1 Bệnh Viện
Phụ Sản Hà
Nội
Bệnh Viện Phụ
Sản Hà nội
Cung cấp
mẫu cho
nghiên cứu
invitro
Đã cung cấp
62 mẫu
nghiên cứu
theo yêu cầu

2 INSERM 00-
20, Bệnh
Viện Kremlin
Bicetre, Paris
INSERM 00-
20, Bệnh Viện
Kremlin
Bicetre, Paris
Cung cấp
mẫu cho

Thanh Liêm
Chủ nhiệm đề
tài
Nghiệm thu đề
tài

2 Ngô Diễm
Ngọc
Ngô Diễm
Ngọc
Thư ký đề tài Thực hiện
nghiên cứu

3 Nguyễn Huy
Bạo
Nguyễn Huy
Bạo
Hợp tác cung
cấp mẫu cho
nghiên cứu
invitro
Cung cấp 62
mẫu cho nghiên
cứu invitro

4. Tô Minh
Hương
Tô Minh
Hương
Hợp tác cung

9 Ann Weber Ann Weber Cung cấp
mẫu cho
nghiên cứu
invivo
Cung cấp 15
mẫu và động
vật thí nghiệm

- Lý do thay đổi ( nếu có):
6. Tình hình hợp tác quốc tế:
Số
TT
Theo kế hoạch
(Nội dung, thời gian, kinh
phí, địa điểm, tên tổ chức
hợp tác, số đoàn, số lượng
người tham gia )
Thực tế đạt được
(Nội dung, thời gian, kinh
phí, địa điểm, tên tổ chức
hợp tác, số đoàn, số lượng
người tham gia )
Ghi
chú*
1
2

- Lý do thay đổi (nếu có):
7. Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị:
Số

(Các mốc đánh giá chủ
yếu)
Theo kế
hoạch
Thực tế đạt
được
Người, cơ quan
thực hiện
1 Xây dựng quy trình nghiên
cứu
9/2006-
12/2007
12/2006-
5/2007
GS.TS. Nguyễn
Thanh Liêm
BS. Ngô Diễm
Ngọc
2 Thu thập mẫu nghiên cứu
Phân lập mẫu và nuôi cấy
tế bào gan
09/2006-
5/2008
12/2006-
9/2010
BS. Ngô Diễm
Ngọc
BS. An Thùy
Lan
3 Phản ứng miễn dịch tế bào 9/2006-

1. Do gặp phải một số khó khăn trong quá trình thực hiện phân lập tế bào từ mẫu
nghiên cứu, nên thời gian thực hiệnmục tiêu này kéo dài hơn so với thời gian dự
kiến.
2. Do khó khăn trong quá trình thực hiện ghép tế bào vào chuột thí nghiệm nên ,
nên thời gian thực hiện mục tiêu này kéo dài hơn so với thời gian dự kiến, cũng gây
ảnh hưởng đến thời gian thu thập mẫu và phân lập mẫu phụ
c vụ cho nghiên cứu
invivo.
III. SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI, DỰ ÁN SXTN
1. Sản phẩm KH&CN đã tạo ra:
a) Sản phẩm Dạng I:
Số Tên sản phẩm và Đơn vị đo Số lượng Theo kế Thực tế đạt

7
TT chỉ tiêu chất lượng
chủ yếu
hoạch được
1
2

- Lý do thay đổi (nếu có):

b) Sản phẩm Dạng II:
Yêu cầu khoa học cần đạt

Số
TT
Tên sản phẩm

Theo kế

quang tế bào
Thực hiện
thành công
Hoàn thành

5 Đánh dấu tế bào bằng
HOECHST
Thực hiện
thành công
Hoàn thành

6 Ghép tế bào trên chuột
thí nghiệm
Thực hiện
thành công
Hoàn thành
với giúp đỡ
của
INSERM00-20
Do một số khó
khăn nảy sinh
trong nghiên
cứu
- Lý do thay đổi (nếu có): Do khó khăn trong quá trình thực hiện ghép tế bào vào
chuột thí nghiệm tại điều kiện Việt Nam, nên mục tiêu này được thực hiện với sự
giúp đỡ của INSERM 00-20, Paris, trong việc cung cấp động vật thí nghiệm và
điều kiện chăm sóc sau ghép.
c) Sản phẩm Dạng III:
Yêu cầu khoa học cần đạt


Số lượng
Số
TT
Cấp đào tạo, Chuyên
ngành đào tạo
Theo kế
hoạch
Thực tế đạt
được
Ghi chú
(Thời gian
kết thúc)
1 Thạc sỹ

2 Tiến sỹ

3 BS Nội trú

4 BS CKI; CKII

- Lý do thay đổi (nếu có):
đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp, quyền đối với giống cây
trồng:
Kết quả
Số
TT
Tên sản phẩm đăng ký
Theo kế hoạch Thực tế đạt
được
Ghi chú


9
2. Đánh giá về hiệu quả do đề tài, dự án mang lại:
1. Nghiên cứu và ứng dụng tế bào gốc trong điều trị bệnh đã và đang là một trong
những định hướng nghiên cứu của khoa học hiện đại. Dựa trên kết quả nghiên cứu
bước đầu về tế bào gan phôi thai người, có thể mở ra các nghiên cứu sử dụng các
nguồn tế bào gốc khác với mục đích biệt hóa thành t
ế bào gan, ứng dụng cho điều
trị như: tế bào gốc tạo máu, tế bào gốc dây rốn
2. Ghép tế bào nói chung và ghép tế bào gan là một cách thức điều trị mới, đã và
đang được nghiên cứu khá rộng rãi ở nước ngoài do một số ưu điểm của phương
pháp này như giảm can thiệp phẫu thuật, giải quyết vấn đề người cho, giảm chi phí
thực hiện Do vậ
y, các nghiên cứu chuyên sâu về lĩnh vực này cần thiết được tiếp
tục triển khai để có thể đưa các nghiên cứu ở quy mô phòng thí nghiệm đến gần
hơn với thử nghiệm lâm sàng, phục vụ cho mục đích điều trị bệnh.
3. Tình hình thực hiện chế độ báo cáo, kiểm tra của đề tài, dự án:
Số
TT
Nội dung
Thời gian
thực hiện
Ghi chú
(Tóm tắt kế
t quả, kết luận
chính, người chủ trì…)
I Báo cáo định kỳ
II Kiểm tra định kỳ
III Nghiệm thu cơ sở


INSERM
Sinh học phân tử SHPT

2
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH TRONG ĐỀ TÀI

STT Tên hình vẽ Trang
Hình 1.1 Tế bào gốc
5
Hình 1.2 Phân loại tế bào gốc
6
Hình 1.3 Quá trình biệt hóa của tế bào gan phôi thai người
10
Hình 1.4 Hình ảnh xoang tĩnh mạch qua kính viển vi điện tử
11
Hình 3.1 Tế bào gan thai người ngày thứ 3 sau khi nuôi cấy
26
Hình 3.2
Tế bào gan thai người ngày thứ 4 và thứ 5 sau nuôi
cấy
27
Hình 3.3 Hóa miễn dịch huỳnh quang tế bào với các marker
28
Hình 3.4 Đánh dấu tế bào gan thai người bằng HOECHST

đạt được mục đích này, tế bào gốc cầ
n được biệt hoá invitro và/hoặc invivo
thành các các tế bào của các mô và cơ quan cần tái tạo. Gan là một trong
những cơ quan lớn nhất và mang nhiều chức năng nhất của cơ thể, đặc biệt là
chức năng chuyển hoá và giải độc, nên gan cũng là cơ quan rất dễ bị tổn
thương bởi nhiều nguyên nhân bẩm sinh và mắc phải dẫn đến rối loạn chuyển
hoá của gan. Đây là trạng thái bệ
nh lý nếu không được điều trị sẽ nhanh
chóng dẫn đến tử vong. Hiện nay ghép gan đang là phương pháp điều trị hiệu
quả duy nhất cho các tổn thương gan trầm trọng. Tuy nhiên biện pháp này gặp
rất nhiều khó khăn như kỹ thuật can thiệp phức tạp, tỷ lệ thải ghép cao và đặc
biệt là hạn chế về số lượng người cho gan. Trong bối cảnh đó, liệu pháp t
ế
bào sử tế bào gốc biệt hoá thành tế bào gan rồi cấy ghép để chúng tái tạo lại
gan tổn thương được xem như một hướng điều trị mới đầy triển vọng. Có
nhiều nguồn tế bào gốc đã được sử dụng để biệt hoá thành tế bào gan, tuy
nhiên, lựa chọn nguồn tế bào gốc nào để biệt hoá đã và đang là một thách
thức với các nhà nghiên cứu. Bên c
ạnh đó khi sử dụng các tế bào được biệt
hóa từ tế bào gốc để cấy ghép khác gen cùng loài thì tính sinh miễn dịch của
tế bào được ghép là yếu tố quan trọng quyết định phản ứng thải ghép hay
thành công của cuộc ghép.
Trong bối cảnh đó, tế bào gan phôi thai người xuất hiện như một ý tưởng mới
trong lĩnh vực ghép tế bào gốc, và trở thành một nguồn cho hứa hẹn vớ
i nhiều
ưu thế về hình thái, độ biệt hóa và tính sinh miễn dịch.

4
Xuất phát từ thực tiễn này, đề tài " Nghiên cứu ghép tế bào gan phôi thai
người để điều trị một số bệnh gan chuyển hóa di truyền ở trẻ em", được tiến

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tế bào gốc:
1.1.1. Định nghĩa:
Tế bào gốc (stem cells) là một nhóm các tế bào có khả năng vô hạn trong việc
tự làm mới, và biệt hoá thành nhiều loại tế bào của các mô, tổ chức khác nhau
trong cơ thể [1]. Tế bào gốc có mặt trong tất cả các giai đoạn phát triển của cơ
thể, từ giai đoạn phôi, thai, có trong máu dây rốn, có trong nhiều loại mô và
cơ quan khác nhau của cơ th
ể đã trưởng thành, nơi các tế bào này được duy trì
dưới dạng chưa biệt hoá trong suốt cuộc đời của cơ thể đó [2].

Hình 1.1. Tế bào gốc
(Nguồn từ 2001 Teresese Windown Lydia Kibluk)
1.1.2. Phân loại:
Có nhiều cách phân loại tế bào gốc. Dựa vào nguồn gốc, tế bào gốc được chia
làm hai nhóm chính : tế bào gốc phôi (Embryonic stem cells) và tế bào gốc
trưởng thành (Adult stem cells). Tế bào gốc phôi là những tế bào đầu tiên của
giai đoạn phôi hình thành từ 5-7 ngày tuổi sau khi thụ tinh. Đây là những tế
bào gốc vạn tiềm năng (Totipotent), có khả năng biệt hoá thành tất cả hoặc
h
ầu hết các loại tế bào khác nhau của cơ thể [3]. Tế bào gốc trưởng thành là

6
những tê bào trong nhiều loại mô và cơ quan của cơ thể từ sau khi được sinh
ra đến lúc trưởng thành. Đây là những tế bào gốc vạn tiềm năng hoặc đa tiềm
năng (Multipotent), có khả năng biệt hoá thành một số loại tế bào khác nhau
của cơ thể, như tế bào gốc tạo máu trong tuỷ xương [4]. Ngoài ra, còn có
những tế bào gốc phân lập từ các mô và tổ chức của giai đoạn thai. Nh
ững tế
bào này có thể là tế bào gốc vạn tiềm năng hoặc tế bào gốc đa tiềm năng, như

thực trạng ghép gan của Mỹ năm 2003, trong năm 1997 có khoảng 500 trường
hợp được tiến hành ghép gan, đến năm 2002 con số này chỉ dừng lại ở khoảng
550 trường hợp. Trong khi đó, số trường hợp trong danh sách chờ ghép gan
tăng nhanh từ
khoảng 400 năm 1997 lên 700 năm 2002, và số trường hợp
đăng ký ghép gan mới tăng từ khoảng 1200 đến 1700 trường hợp. Do vậy với
số lượng người cho gan ngày càng hạn chế, kỹ thuật can thiệp phức tạp, tỷ lệ
thải ghép cao, nên các phương pháp điều trị khác vẫn cần được tiếp tục
nghiên cứu. Trong bối cảnh đó, liệu pháp tế bào sử tế bào gốc biệt hoá thành
t
ế bào gan (hepatocytes like cells) được xem như một hướng điều trị mới đầy
triển vọng.
Có nhiều nguồn tế bào gốc được sử dụng để biệt hoá thành tế bào gan
(hepatocyte-like cell), tuy nhiên, lựa chọn nguồn tế bào gốc nào để biệt hoá đã
và đang là một thách thức với các nhà nghiên cứu. Tế bào gốc phôi (ES) lần
đầu tiên được phân lập là từ phôi thai chuột [6]. Tế bào gốc phôi mặc dù
mang nhiều đặc
điểm ưu việt nhất của tế bào gốc, nhưng nghiên cứu sử dụng

8
tế bào gốc phôi hiện nay đang gặp phải nhiều trở ngại về vấn đề đạo đức.
Các nghiên cứu về tế bào gốc hiện nay chủ yếu sử dụng nguồn tế bào gốc từ
thai hoặc nguồn tế bào gốc trưởng thành (Adult stem cell). Đầu tiên, là các
nghiên cứu tập trung vào việc sử dụng nguồn tế bào gốc từ tuỷ xương (BM)
để sửa chữa các tổn thươ
ng gan invivo. Petersen và CS. [7] đã chỉ ra rằng việc
cấy ghép tuỷ của chuột đực vào gan của chuột cái bị chiếu xạ liều gây chết, và
gan bị gây tổn thương bằng 2-acetylaminofluorene và CCl
4
, thì có thể cứu con

marker bề mặt của loại tế bào này là các marker của tế bào gan như:
Albumine, Alpha -1-antitrypsine, và các marker của tế bào
đường mật như:
Cytokeratine 7 và 19. Ngoài ra các tế bào này còn thể hiện một loại marker
đặc hiệu của các tế bào biểu mô là E-Cadherine.
Xét về khả năng ứng dụng trong ghép tế bào để điều trị một số bệnh gan, tế
bào gan phôi thai người có nhiều ưu điểm hơn so với tế bào gan trưởng thành
[12]:
- Tế bào gan phôi thai có kích thước nhỏ hơn (15µm) so với tế bào
trưởng thành (30µm), đi
ều này tạo điều kiện thuận lợi cho việc các tế
bào sau khi ghép di chuyển qua các xoang tĩnh mạch vào nhu mô gan
dễ dàng hơn.
- Tế bào gan phôi thai có khả năng tăng sinh rất lớn ngay cả khi đã được
đưa vào nhu mô gan. Điều này có thể mang lại một lợi thế lớn trong
ứng dụng điều trị, vì chỉ cần đưa một lượng tế bào nhỏ hơn mà có thể
thu được hiệ
u quả lớn hơn so với tế bào gan trưởng thành.
- Tế bào gan phôi thai có tinh miễn dịch thấp hơn tế bào gan trưởng
thành do đặc tính của tế bào non, chưa biệt hóa hoàn chỉnh. 10

Hình 1.3. Quá trình biệt hóa của tế bào gan phôi thai người
Ttheo IMSERM 00-20, Paris 2006)
1.2.3. Tiềm năng ứng dụng :
Một số năm gần đây, các thử nghiệm ghép tế bào gan trưởng thành vào điều
trị cho các bệnh nhân mắc suy gan cấp hoặc mạn tính, hay một số bệnh gan
chuyển hóa di truyền đã được thực hiện ở một số nước như Pháp và Mỹ [13].

bào gan trưởng thành cùng loài hoặc tự thân sau khi các tế bào gan bệnh được
lấy ra khỏi cơ thể, sửa chữa gen bên ngoài cơ
thể và đưa trở lại cơ thể sống,
đã cải thiện phần nào những rối loại chuyển hóa ở các cơ thể mang bệnh này.
Tuy nhiên, hiệu quả rõ rệt của những cải thiện này vẫn còn chưa thực sự đầy
đủ và thuyết phục.
Các thử nghiệm lâm sàng về ghép tế bào gan được thực hiện từ năm 1995.
Công bố năm 2004 của nhóm bác sỹ người Pháp là thành công củ
a ghép tế
bào gan trên một bệnh nhi 10 tuổi mắc hội chứng Crigler-Najjar (suy giảm
bilirubin-uridine diphosphoglucuronate glucuronosyltransferase) [15]. Tế bào
gan được truyền vào cơ thể bệnh nhân qua đường tĩnh mạch cửa. Bệnh nhi
tỉnh táo suốt quá trình truyền tế bào và xuất viện sau đó 20 giờ. Sau ghép,
nồng độ bilirubin trong máu từ 400-460µmol/l đã giảm xuống còn 180-
240µmol/l, và giữ ở mức độ này trong vòng hơn 1 năm. Nồng độ UGT1A1
1µm

12
hoạt hóa tăng từ 0.4% lên 5.5% so với nồng độ bình thường. Kết quả đáng
chú ý này đã chỉ ra rằng những thuận lợi về mặt lý thuyết của ghép tế bào gan
có thể ứng dụng thành công trên người.
Tuy nhiên trên thực tế, vẫn còn nhiềiu trở ngại trong lĩnh vực này. Mặc dù kết
quả ghép tế bào trên bệnh nhân Crigler-Najjar, nhưng trên một số bệnh nhân
khác có xuất hiện các dấu hiệu phức tạ
p về tim mạch và hô hấp, cũng như các
vấn đề khó khăn trong việc kiểm soát tình trạng suy giảm miễn dịch.
Hơn nữa, nếu ghép tế bào gan trở thành một liệu pháp hiệu quả và rộng rãi
cho các bệnh nhân có tổn thương gan mạn tính thì việc dự trữ tế bào gan cho
nhu cầu này cần phải được thúc đẩy. Do đó, hoặc phải sử dụng ngay phần gan
sau khi lấy ở người cho, phân lập xử