ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

ĐÀO MAI PHƢƠNG

PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT
TÍNH ỨC CHẾ TẾ BÀO UNG THƢ MỘT SỐ HỢP CHẤT
HÓA HỌC TỪ LOÀI THỰC VẬT TRI MẪU
(Anemarrhena asphodeloides )

Ngành: Hóa hữu cơ
Mã số: 8.44.01.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. PHẠM VĂN KHANG

THÁI NGUYÊN - 2018


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu,
kết quả nêu trong luận văn này là trung thực chưa từng được ai công bố trong
bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác.
Học viên

Đào Mai Phƣơng

i



H
U
Y
Ê
N
M
Ô
N

i


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng và lời cảm ơn sâu sắc của mình
tới TS. Phạm Văn Khang - người thầy đã tin tưởng giao đề tài, tận tình hướng
dẫn, động viên và tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học
tập, nghiên cứu và thực hiện luận văn. Đồng thời tôi xin gửi lời cảm ơn tới các
thầy cô giáo và các học viên cao học K24 trong phòng thí nghiệm Hóa hữu cơ
đã tạo môi trường nghiên cứu khoa học thuận lợi giúp đỡ tôi hoàn thành các
kế hoạch nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn các em sinh viên nghiên cứu đề tài khoa học
hợp chất thiên nhiên đã cùng cộng tác với tôi trong trong việc tiến hành các
thí nghiệm thuộc đề tài luận văn.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, Ban lãnh đạo
khoa Hóa và phòng Đào tạo sau đại học - trường Đại học Sư phạm Thái
Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn này.
Thái nguyên, tháng 5 năm 2018
Học viên

ĐÀO MAI PHƢƠNG

2.1.1. Hóa chất .............................................................................................. 25
2.1.2. Hóa chất và tế bào dùng để thử hoạt tính sinh học ............................ 25
2.1.3. Thiết bị................................................................................................ 25
2.2. Phương pháp xử lý mẫu thực vật, chiết tách và xác định cấu trúc các chất
phân lập được....................................................................................................... 26
2.2.1. Xử lý mẫu thực vật ............................................................................. 26
2.2.2. Chiết tách các chất.............................................................................. 26
2.2.3. Xác định cấu trúc các chất.................................................................. 26
2.3. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư .........................
26
2.3.1. Vật liệu và hóa chất ............................................................................ 26
2.3.2. Phương pháp xác định tính độc tế bào ung thư (cytotoxic assay)...... 27
2.4. Chiết xuất hợp chất từ thân rễ Tri mẫu ......................................................... 28

4


2.4.1. Chiết xuất cao etanol từ thân rễ của loài Tri mẫu ............................. 28
2.4.2. Phân lập, tinh chế các hợp chất .......................................................... 28
2.4.3. Các giá trị phổ 1H, 13C-NMR của AA1, AA2 và AA3....................... 31
2.4.4. Xác định hoạt tính độc tế bào trên dòng tế bào HeLa ( tế bào ung
thư cổ tử cung) và tế bào A549 (tế bào ung thư gan)................................... 32
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 34
3.1. Kết quả phân lập các hợp chất ...................................................................... 34
3.2. Kết quả xác định cấu trúc của hợp chất ........................................................ 34
3.2.1. Phân tích cấu trúc hợp chất AA1........................................................ 34
3.2.2. Phân tích cấu trúc hợp chất AA2........................................................ 41
3.2.3. Phân tích cấu trúc hợp chất AA3........................................................ 47
3.3. Kết quả nghiên cứu hoạt tính độc tế bào trên dòng tế bào ung thư HeLa
(cổ tử cung) và A549 (tế bào ung thư gan).......................................................... 52

: Nuclear Overhauser Spectroscopy
: Phổ tương quan hai chiều H-H

DEPT

: Distortionless Enhancement by Polarisation Tranfer
: Phổ DEPT

ESI-Ms

: Electron Impact Mass Spectroscopy
: Phổ khối lượng

HMBC

: Heternuclear multiple - Bond Corelation
: Phổ tương quan hai chiều H-C

iv


H
R

:
H
et
er
nu
cl

y

:
Ph
ổ
tư
ơn
g
tá
c
CH
:
Re
ve
rs
ed
–
Ph
as
e

iv


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Kết quả hạ đường huyết của dịch chiết nước Tri mẫu [3] ................ 11
Bảng 1.2. Kết quả hạ đường huyết của cao Tri mẫu chiết bằng cồn 80o [3] .... 11
1


Hình 3.8. Phổ H-NMR của chất AA2 .............................................................. 42
13

Hình 3.9. Phổ C-NMR của chất AA2 ............................................................. 43
Hình 3.10. Phổ DEPT-135 của chất AA2.......................................................... 43
Hình 3.11. Phổ HSQC của chất AA2 ................................................................ 45
Hình 3.12. Sự tương quan giữa HC của chất AA2 (HMBC)........................ 45
Hình 3.13. Phổ MS của chất AA2 ..................................................................... 46
Hình 3.14. Công thức cấu tạo của AA2............................................................. 47
1

Hình 3.15. Phổ H-NMR của chất AA3 ............................................................ 48
13

Hình 3.16. Phổ C-NMR của chất AA3 ........................................................... 48
Hình 3.17. Phổ HSQC của chất AA3 ................................................................ 49
Hình 3.18. Sự tương quan giữa HC của chất AA3 (HMBC)......................... 50
Hình 3.19. Phổ khối lượng của AA3 ................................................................. 51
Hình 3.20. Công thức cấu tạo của AA3............................................................. 51
Hình 3.21. Hình ảnh ức chế tế bào A549 .......................................................... 54
Hình 3.22. Hình ảnh ức chế tế bào Hela............................................................ 54

6


MỞ ĐẦU
Ngành hóa học các hợp chất thiên nhiên đang ngày càng khẳng định được
vai trò quan trọng trong nghiên cứu và sử dụng thuốc. Các nghiên cứu từ hợp
chất thiên nhiên tạo tiền đề và là nguồn cung cấp nguyên liệu cho các ngành
công nghiệp, nông nghiệp, mĩ phẩm, dược phẩm...Các hợp chất tìm thấy trong

Đề tài này khi hoàn thành sẽ cung cấp các thông tin khoa học giá trị làm
cơ sở khoa học quan trọng để sử dụng loài thực vật này làm thuốc chữa bệnh và
sàng lọc các hợp chất có hoạt tính tốt để tiến hành nghiên cứu tiếp theo. Đồng
thời góp phần vào đào tạo nguồn nhân lực cho vùng núi phía Bắc và cả nước.

2


Chƣơng 1
TỔNG QUAN
1.1. Khái quát về loài Tri mẫu (Anemarrhena asphodeloides Bunge)
1.1.1. Đặc điểm thực vật học
1.1.1.1. Tên khoa học
- Tên khoa học: Anemarrhena asphodeloides Bunge. Họ: Thùa (Agavaceae).
- Tên Việt Nam: Tri mẫu.
- Tên khác: Zhi mu (Trung Quốc), Chimo (Nhật Bản), Ji mo (Hàn Quốc).
1.1.1.2. Đặc điểm thực vật
Cây Tri mẫu (Anemarrhena asphodeloides ) là cây thân rễ. Tri mẫu vốn
tên là chi mâu do chi mâu là trứng con kiến, vì lúc mầm cây này mọc lên trông
[2]

giống trứng con kiến. Sau này đọc lệch thành Tri mẫu (Lợi, 1997) .
Thân: Thân rễ mọc ngang ở dưới mặt đất hơi phẳng và tròn, bề mặt trên
mọc nhiều rễ nhỏ màu vàng dài và rậm rạp

[11]

.thẳng, hình trụ, cao khoảng 33-

[1]

[11]

.
[2]

Vào tháng 3 - 4 người ta đào lấy thân rễ rửa sạch phơi hay sấy khô .
A: Thân rễ
B: Cành hoa
C: Hoa
D: Tràng hoa
E: Nhị hoa
F: Quả
G: Hạt

Hình 1.1. Hình vẽ mô tả loài Tri mẫu

Hình 1.2. Hình ảnh loài Tri mẫu

4


1.1.1.3. Phân bố
- Trên thế giới: Tri mẫu được trồng hoặc mọc hoang trên sườn núi ở Mãn
Châu, Mông Cổ và miền Bắc của Trung Quốc.
- Ở Việt Nam: Tri mẫu mọc hoang ở miền núi phía Bắc và được trồng nhỏ
lẻ ở các tỉnh: Tuyên Quang, Bắc Kạn, Yên Bái...
1.1.2. Công dụng của loài Tri mẫu

[1]


. Đồng thời thể hiện

khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư HeLa, HepG2, BC, MKN45, và
KATO-III với liều lượng IC50 khoảng µM

[14-15, 31]

.

Trong đó, gây được sự quan tâm lớn nhất là hoạt tính của Timosaponin AIII (TA3), đây là một saponin được phân lập từ rễ của cây tri mẫu, có khả năng
khả năng ức chế enzym acetyl cholinesterase để cải thiện trí nhớ

[13-16]

. Cơ chế

của quá trình bảo vệ tế bào não của chất này có thể được giải thích bằng sự
chống viêm của nó

[21]

. Nó cũng thể hiện khả năng ức chế sự truyền dẫn tín hiệu

NF-kappaB trong tế bào BV-2 và trong tế bào não SK-N-SH trên mô hình
chuột thực nghiệm, đây là những phần có ảnh hưởng lớn đến sự mất trí nhớ

[21]

.


T
ế
n
i
m h
t
o
ế
6


củ
a
ch
u
kỳ
tế
Ứ
c
ch
Mế
asự
ngắ
gin
f kế
S
a
r
s
a


mos
a
p
o
n
i

V
ớ
i
đ
ố
i
t
ư
ợ
n
K
h
ả

n
ă
n
L
Sà
mm
il
L

c g
h là
c đạ
h i
i Ứ
c
c
h
ế
tá
c
n
C Mh
3
a
h â
nn
ố gc
n iả
g em
r
nứ
v n
(i
)ê N
y
m a
(-s
)-o
Nl

L
à
m
g
T iả
i m
m
o n
s ồ
n
a
g
p C
á
c
h
S
ợ
a p
p c
o h
ni ất
L
à
m

H
5

ạ

so với dung môi là 1/6, chiết cách thủy 1 giờ 30 phút 1 lần, chiết 3 lần. Các
dịch chiết gộp lại để tự bốc hơi hay thu hồi dung môi dưới áp suất giảm đến cao
lỏng 1/1. Dịch chiết được tiến hành thử tác dụng hạ đường huyết trên chuột
thực nghiệm bị đái tháo đường

[3]

.

Bảng 1.1: Kết quả hạ đƣờng huyết của dịch chiết nƣớc Tri mẫu [3]

L
ô
t
h
L
ô
đ
L
ô
t

S T
Lố ỉ
i c l
ề h ệ
u u %
L
ư 13
ợ 40


h
hL L

ố ỉ

M
ứ
c

c

%

S T
l

P

h ệ

g
u % i

1 3 36.
0.
4 0 00
3 2
L ợ1
0.

x
i
u
ếT
r
o
n
K T
i g
h
m s
6
á o ố
c
n s N
á

S
T
T

g

k
h
u
ẩ
n
v
à

-h
)
-ợ
p
c
Bh
r
oấ
ut
sp
T
i
m
o
T s
i a
m
p
o
s o
a n
p i
L
à
Tm
Chố i gi
7 n mả
L
g
Tà

[2-11, 30]

.

1.3.1. Nhóm hợp chất saponin
Các khung aglycon cơ bản trong các hợp chất saponin được tóm tắt dưới
đây, các hợp chất này có thể liên kết với một hoặc nhiều phân tử đường, tồn tại
rất ít ở dạng aglycon. Về mặt phân loại, dựa theo cấu trúc hoá học có thể chia
ra: saponin triterpenoid và saponin steroid.
a, Nhóm 1: Saponin acid (triterpenoid saponin) Phần genin của loại này có 30
carbon cấu tạo bởi 6 nhóm hemiterpen.

14