BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THU TRANG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ
THỬ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ
TẾ BÀO UNG THƢ CỦA LÁ CÂY
MÃNG CẦU XIÊM (ANNONA MURICATA L.),
HỌ ANNONACEAE

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Hà Nội, năm 2014
BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI



Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Đỗ Quyên, ngƣời
thầy đã ủng hộ, giúp đỡ, tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho
tôi trong suốt quá trình làm khoá luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS., TS. Phạm Gia Điền, TS. Bùi Kim
Anh, Th.S, NCS. Hồ Đắc Hùng đã giúp đỡ, góp ý cho tôi trong quá trình
làm khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ ở Phòng Công nghệ các hoạt
chất sinh học, Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khoá luận này.
Nhân dịp này, tôi xin bày tỏ sự kính trọng và cảm ơn tới Ban giám
hiệu, Phòng Đào tạo và các thầy cô giáo trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội đã luôn
đồng hành, tạo điều kiện cho tôi đƣợc học tập, tiếp thu những kiến thức và
kinh nghiệm quý báu trong suốt 5 năm học.
Xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên tôi để tôi có thêm nghị
lực và say mê nghiên cứu khoa học.

Hà nội, ngày 14 tháng 4 năm 2014
Nguyễn Thu Trang MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
i
NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN
ii
DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ CÁC HÌNH

9
1.4. Công dụng
12
CHƢƠNG 2- NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
14
2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị
14
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu
14
2.1.2. Dung môi, hóa chất
14
2.1.3. Thiết bị
14
2.1.3.1. Dùng cho chiết xuất, định tính và phân lập
14
2.1.3.2. Dùng cho xác định thông số vật lý và hóa học của các chất
15

2.1.3.3. Dùng cho thử hoạt tính gây độc tế bào
15
2.2. Nội dung nghiên cứu
16
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
16
2.3.1. Nghiên cứu về hoá học
16
2.3.1.1. Chiết xuất
16
2.3.1.2. Phân lập

3.1.4. Nhận dạng cấu trúc
30
3.1.4.1. Nhận dạng cấu trúc chất P27
30
3.1.4.2. Nhận dạng cấu trúc Chất P71
31
3.1.4.3. Nhận dạng cấu trúc Chất P55.7
33
3.2. Bàn luận
36
3.2.1. Tác dụng gây độc tế bào của dịch chiết n-hexan từ lá cây
Mãng cầu xiêm
36
Dimethyl sulfoxide
EC
50

The term half maximal effective concentration
EI-MS
Electron ionization – Mass sprectromery
IC
50
The half maximal inhibitory concentration
J (Hz)
Hằng số tƣơng tác tính bằng Hertz
KB
Human epidermic carcinoma
LU
Human lung carcinoma
MCF7
Human breast adenocarcinoma
RPMI
Roswell Park Memorial Institute medium
SKLM
Sắc ký lớp mỏng
STT
Số thứ tự

TMS
Tetramethylsilane
UV
Ultra violet
d

Hình 1.3: Cấu trúc hoá học của acetogenin có nhóm epoxy
5
Hình 1.4: Cấu trúc hoá học của acetogenin có 1 nhóm tetrahyrofuran
6
Hình 1.5: Cấu trúc hoá học của acetogenin có 2 nhóm tetrahyrofuran
6
Hình 1.6: Khung cấu trúc cơ bản của 4 nhóm alcaloit
7
Hình 1.7: Khung cấu trúc cơ bản của sterol
8
Hình 3.1: Sơ đồ chiết xuất bột lá cây Mãng cầu xiêm
20
Hình 3.2: Sắc kí đồ của cặn dịch chiết n-hexan của lá mãng cầu xiêm
trong các hệ dung môi khác nhau quan sát ở AST
22
Hình 3.3: Sắc ký đồ cặn dịch chiết n-hexan trong hệ dung môi
Toluen:Etyl acetat:Acid acetic [40:10:1]
23
Hình 3.4: Sắc kí đồ của chất P27 trong hệ dung môi CH
2
Cl
2
: MeOH
[98:2], hiện màu bằng ceri sulfat
27
Hình 3.5: Sắc ký đồ của chất P71 trong hệ dung môi CH
2
Cl
2
: MeOH

Bảng 3.3: Kết quả SKLM của cặn dịch chiết n-hexan trong hệ dung môi
Toluen:Etyl acetat:Acid acetic [40:10:1]
24
Bảng 3.4.1: Số liệu phổ NMR của hợp chất P55.7 và lutein [10]
34
Bảng 3.4.2: Số liệu phổ NMR của hợp chất P55.7 và lutein [10] (tiếp)
35
1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, các sản phẩm thiên nhiên có hoạt tính sinh học có ứng dụng
rất lớn trong nhiều lĩnh vực khác nhau của cuộc sống. Nhiều hợp chất thiên
nhiên hoặc các sản phẩm đƣợc tổng hợp, bán tổng hợp từ các hợp chất thiên
nhiên đã đƣợc sử dụng một cách hiệu quả trong việc điều trị, phòng ngừa một
số bệnh, đặc biệt là các bệnh hiểm nghèo.
Theo thống kê, mỗi năm tại Việt Nam, số bệnh nhân ung thƣ mắc mới
là 150.000 ngƣời và có 75.000 ngƣời tử vong [39]. Các phƣơng pháp điều trị
ung thƣ thông thƣờng nhƣ hóa trị và xạ trị hay để lại tác dụng phụ, ảnh hƣởng
đến chất lƣợng cuộc sống của bệnh nhân. Vì vậy, tìm ra các liệu pháp mới
trong điều trị ung thƣ là một nhu cầu cấp thiết.
Hiện nay, cây Mãng cầu xiêm (Annona muricata L.) đang thu hút sự
quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới. Với kết quả thu đƣợc từ các
nghiên cứu tập trung theo hƣớng nghiên cứu tác dụng gây độc tế bào, Mãng
cầu xiêm đƣợc coi nhƣ một dƣợc liệu đầy tiềm năng trong điều trị ung thƣ [7].
Ở Việt Nam, chƣa có nghiên cứu nào về Mãng cầu xiêm trong khi loài thực
vật này đƣợc trồng phổ biến để khai thác quả và đem lại hiệu quả kinh tế rất
lớn. Các bộ phận khác của cây hầu nhƣ không đƣợc tận dụng. Vì vậy, để có
thể đóng góp thêm những hiểu biết giúp làm tăng giá trị của nguồn nguyên
liệu lớn, chúng tôi thực hiện đề tài : ‖Nghiên cứu thành phần hoá học và thử

ngoài lớn hơn nhƣng không bao kín; các cánh hoa mọc ở vòng trong nhỏ hơn.
Nhị nhiều, cuộn lại, dạng chuỳ, hoặc cong và có dạng túi, hoặc nhọn ở đầu kia
bao phấn. Nhuỵ nhiều, gắn trực tiếp phần đáy, riêng rẽ liên kết với đầu nhuỵ,
với một hoặc hai noãn mỗi nhuỵ; vòi nhuỵ và đầu nhuỵ hình chuỳ hoặc hình
nón hẹp. Quả nạc, hình trứng hoặc hình cầu. Mỗi quả bao gồm có nhiều quả
3 nhỏ riêng biệt hoặc quả tụ, với một quả tụ và hạt mỗi nhuỵ. Hạt hình hạt đậu
với lớp áo cứng; nhân hạt độc [13].
Chi Na (Annona) có khoảng 125 loài phân bố nhiều ở các vùng rừng
mƣa nhiệt đới thuộc châu Mỹ, châu Phi… Ở Việt Nam có một số loài thuộc
chi Annona đƣợc phát hiện là: Annona cherimolia, Annona glabra, Annona
muricata, Annona reticulata, Annona squamosa [1].
1.1.3. Đặc điểm thực vật và phân bố của loài Annona muricata L.
Mô tả: Cây cao 4-6m; nhánh cây có nhiều mấu, nhẵn. Lá hình mũi mác-
trứng ngƣợc, hơi nhọn ở gốc, nhọn hay tù ở ngọn, 2 mặt nhẵn, mặt trên nhạt
màu và láng bóng, dài 12cm, rộng 5 cm; gân lá chia 8-10 cặp, mỏng, có thể
nhìn thấy ở cả 2 mặt lá; gân con tạo thành mạng lƣới; cuống lá chắc, dài
8mm. Cuống hoa có 1 hoa đơn độc, có lông tơ ở 2 mặt. Cánh hoa lớn, hình
ovan, ngắn hơn bao hoa. Lá đài hình tam giác, ngắn, dày, gần giống hình tim
ở gốc, có lông tơ ở 2 mặt. Nhiều nhị, kéo dài đến trung đới hình vuông, cụt,
có gai thịt; các ô song song, liền kề nhau; chỉ nhị dài gần bằng các ô. Lá noãn
có lông màu hung; vòi nhị dài bằng bầu, có gai thịt, hình lăng trụ, cụt. Quả
hình cầu hoặc hình tim, có rốn ở gốc, bao phủ bởi các gai hình nón từ lá noãn
hàn lại tạo thành [38].
Ở nƣớc ta cây Mãng cầu xiêm thƣờng đƣợc trồng để lấy quả. Cây có
nguồn gốc ở vùng nhiệt đới châu Mỹ, đƣợc trồng ở Miền Nam Việt Nam và
các nƣớc nhiệt đới châu Á, ở nƣớc ta thƣờng gặp ở các tỉnh Nam bộ và một
phần Tây nguyên [2],[3].

OH
O O
OH
n m
O O
RR OH
OH
O O
L A
2
/
4
32
/
34
35
/
37
5 - Acetogenin có nhóm epoxy (đã phân lập đƣợc 8 chất) bao gồm các
loại: epoxymurin-A; diepomuricanin-A (hình 1.3).

Acetogenin loại epoxymurin-A

Acetogenin loại diepomuricanin-A
Hình 1.3: Cấu trúc hoá học của acetogenin có nhóm epoxy
- Acetogenin có 1 nhóm tetrahydrofuran (đã phân lập đƣợc 47 chất) bao
gồm: mono-tetrahydrofuran ,  ’- dihydroxy acetogenin (gồm các loại:

O O
R
O O
n
L
-
A
35
/
37
m
E
-
B
p
R = H or = O
6

Acetogenin loại mono-tetrahydrofuran , ’- dihydroxy acetogenin

Acetogenin loại mono-tetrahydrofuran / monohydroxy acetogenin

Acetogenin loại isoannonacin
Hình 1.4: Cấu trúc hoá học của acetogenin có 1 nhóm tetrahyrofuran

Acetogenin loại goniodenin
Hình 1.5: Cấu trúc hoá học của acetogenin có 2 nhóm tetrahyrofuran

R = H or OH
O
O
O
R
OH
30
/
32
/
34
33
/
35
/
37
L
-
A
R = H or OH
R
n
T
-
B
R
m
O
O
H

n
T
-
E
R = H or = OH
R
m
32
/
34
7 tetrahydroprotoberberin. Hình 1.6 trình bày khung cấu trúc cơ bản của 4
nhóm alcaloit. 1 2

3 4

Hình 1.6: Khung cấu trúc cơ bản của 4 nhóm alcaloit
Trong đó: 1-apomorphin, 2-aporphin, 3-benzyltetrahydroisoquinolin,
4-tetrahydroprotoberberin
1.2.3. Tinh dầu
Tinh dầu làm lá cây có mùi thơm dịu.
Trong một nghiên cứu về thành phần tinh dầu chiết từ lá cây Mãng cầu
xiêm thu hái ở Benin, 82 hợp chất đƣợc xác định bằng GC/MS, chủ yếu là các
dẫn xuất của sesquiterpenes: -elemen, isocaryophyllene, -caryophyllene,
-humulene, -muurolene, -selinene, -muurolene, germacrene-A, -

1.2.5. Carotenoit
Là nhóm chất đóng vai trò nhƣ một chất dinh dƣỡng có trong quả Mãng
cầu xiêm, Berlowski A. và cộng sự đã xác định hàm lƣợng carotenoit toàn
phần trong cây mãng cầu xiêm trồng ở Peru là 0.310 μg/1 g [6]; ngoài ra đã
OH
9 xác định đƣợc retinol (tiền chất của vitamin A) có trong vỏ cũng nhƣ thịt quả
Mãng cầu xiêm thu hái ở đông nam Nigeria [26].
1.2.6. Các nhóm chất khác
Một số hợp chất thuộc các nhóm chất khác trong cây Mãng cầu xiêm là:
cacbohydrat (glucose trong lá; sucrose, glucose, fructose trong quả;
galactomannan trong hạt), lipid (dầu nửa khô với các acid béo trong hạt và
lá), acid amin (prolin, -amino-butyric acid trong quả), polyphenol (acid
caffeic, acid para-coumaric, procyanidin, tanins), vitamin (vitamin C trong
quả), glycosid cyano [21].
1.3. Tác dụng sinh học
- Tác dụng gây độc tế bào là tác dụng sinh học nổi bật của cây Mãng
cầu xiêm, hiện đang đƣợc tập trung nghiên cứu và khai thác. Các thử nghiệm
về hoạt tính của dịch chiết hay các chất phân lập đƣợc từ cây Mãng cầu xiêm
đã đƣợc tiến hành trên nhiều dòng tế bào ung thƣ khác nhau và đều cho hiệu
quả rõ rệt.
Tác dụng này chủ yếu do acetogenin gây ra. Một số cơ chế tác dụng
[33] là:
- Ức chế phức hợp I ( NADH : ubiquinone oxidoreductase ) trong hệ
thống ti thể vận chuyển điện tử, ức chế phosphoryl hóa oxy hóa, kết quả làm
giảm lƣợng ATP, do đó ức chế sự phát triển của tế bào ung thƣ.
- Ức chế NADH oxidase trong màng plasma của tế bào ung thƣ.
Enzyme này chỉ biểu hiện rất yếu trong các tế bào bình thƣờng khỏe mạnh.

= 0,025 μg/ml trong khi adriamycin cho ED
50
= 0,11 μg/ml
[18]. Dẫn xuất acetonit của annomuricin C và muricatocin C có ED
50
trên
dòng tế bào MCF7 là 4,48x10
-3
và 3,98x10
-3
μg/ml; mạnh hơn adriamycin với
ED
50
= 1,06x10
-1
μg/ml [36].
Từ quả khô, dịch chiết nƣớc : aceton (1:1) ức chế chọn lọc sự phát triển
của tế bào ung thƣ vú MDA-MB-468 với giá trị IC
50
= 4,8 μg/ml [9].
Từ lá, dịch chiết ethanol có khả năng gây độc trên dòng tế bào bạch cầu
nguyên tuỷ hồng cầu K562 với nồng độ gây độc mạnh nhất là 2,5mg/ml [11];
dịch chiết DMSO kháng tế bào ung thƣ tụy với giá trị IC
50
trên tế bào
FG/COLO357 và CD18/HPAF lần lƣợt là 200 và 73 μg/ml [34]; tinh dầu có
11 tác dụng gây độc tế bào trên dòng tế bào MCF7 với tỷ lệ tế bào chết ở nồng


+ Kháng khuẩn: Chiết xuất từ lá, thân và vỏ cây còn có tác dụng kháng
khuẩn in vitro trên các loài E. coli, P. aeruginosa, S. flexneri, S. spp, S.
marcescens, S. aureus, S. albus, S. Newport, B. Subtilis [33].
+ Kháng virus: Một phân đoạn chất tan trong nƣớc thu đƣợc từ thân cây
có tác dụng chống lại sự tăng sinh của tế bào nhiễm HIV trong ống nghiệm tại
IC
50
 2 g/ml. Chiết xuất ethanol của thân và vỏ cây ở nồng độ 1 mg/ml có
hoạt tính kháng vi rút Herpes simplex type 1 [33].
1.4. Công dụng
Từ lâu Mãng cầu xiêm đã đƣợc sử dụng trong y học truyền thống với
nhiều trƣờng hợp bệnh lý khác nhau nhƣ viêm phế quản, ho, suyễn, bệnh gan,
bệnh túi mật, khó tiêu, lỵ, co thắt, tiêu chảy, đái tháo đƣờng, cao huyết áp,
nhiễm kí sinh trùng, cúm, sốt cao, sốt rét… Mãng cầu xiêm còn đƣợc sử dụng
nhƣ thuốc an thần, giảm đau. Lá còn đƣợc sử dụng với một số công dụng nhƣ
làm thuốc lợi tiểu mạnh khi bị phù chân (Amazonia), trị bệnh khớp (thấp
khớp, viêm khớp), đau dây thần kinh (Brazil), bệnh da liễu (ban da, nhiễm
trùng da) (Đảo Cook), nhịp tim nhanh (Madagascar), làm thuốc trợ tim
(Guyana), giúp se da và cầm máu (Malaysia) [33].
Ở Việt Nam, lá cây Mãng cầu xiêm đã đƣợc dùng để chữa bệnh ngoài
da, giun, thấp khớp [1], sốt rét [2]. Tuy nhiên chƣa có công trình nào trong
nƣớc nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Mãng
cầu xiêm. Vì thế cần thiết nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học và tác
dụng sinh học của Mãng cầu xiêm để phục vụ việc khai thác, sử dụng hiệu
quả loài cây này ở Việt Nam.
Từ tổng quan đã trình bày, định hƣớng nghiên cứu đƣợc đƣa ra:
- Về nghiên cứu hoá học, các nhóm chất có mặt trong Mãng cầu xiêm
rất đa dạng, có các lớp chất từ kém phân cực đến phân cực. Vì vậy, lựa chọn
13

PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Lá cây Mãng cầu xiêm đƣợc chúng tôi thu hái vào tháng 5/2013 tại xã
Hoà Mỹ, huyện Phụng Hiệp, tỉnh Hậu Giang, Việt nam. Tên cây đƣợc nhà
thực vật học Nguyễn Kim Đào (Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật) thẩm
định có tên khoa học là Annona muricata L., họ Annonaceae. Tiêu bản đƣợc
lƣu giữ tại phòng Công nghệ các chất có hoạt tính sinh học, Viện Hóa học,
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Mẫu lá cây Mãng cầu xiêm sau khi thu hái về đƣợc rửa sạch hong khô
ở nơi thoáng mát, rồi sấy ở 45
ο
C đến khi đạt hàm ẩm 10%, tiếp đó mẫu đƣợc
xay thành bột mịn rồi chiết xuất ở nhiệt độ phòng.
2.1.2. Dung môi, hóa chất:
- Dùng cho chiết xuất và phân lập: n-hexan, diclometan, etylaxetat,
methanol, toluen, acid acetic. Thuốc hiện dùng trong sắc ký lớp mỏng là dung
dịch Ceri sulfat, dung dịch Vanillin sulfuric/H
2
SO
4
.
- Dùng cho thử độc tính tế bào ung thƣ: huyết thanh phôi bò, môi
trƣờng RPMI, môi trƣờng DMEM, MTT, DMSO.
2.1.3. Thiết bị
2.1.3.1 Dùng cho chiết xuất, định tính và phân lập
- Phễu chiết xuất mẫu thực vật
- Phễu chiết phân lớp dung tích 1 lít
- Bộ máy quay cất cô chân không thu hồi dung môi (BUCHI waterbath
B480-Đức)

C
- Buồng đếm tế bào (Fisher, Hoa Kỳ)
- Máy quang phổ (Genios Tecan)
- Bình nitơ lỏng bảo quản tế bào
- Các dụng cụ thí nghiệm thông thƣờng khác