BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI
DƯỢC
HÀ NỘI
• HỌC
•
•
•

TỐNG THỊ THANH VƯỢNG

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CÁC ĐỘC
TỐ GÂY TIÊU CHẢY ACID OKADAIC,
DIN OPHYSISTOXIN-1,
DINOPHYSISTOXIN-2 TRONG MỘT
X.

~

Ẵ

9

9

9 .

SỐ NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ Ở

DINOPHYSISTOXIN-2 TRONG MỘT
SỐ NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ Ở
BIỂN VIỆT NAM BẰNG SẮC KÝ LỎNG
KHỐI PHỔ
LUẬN
ÁN TIÉN SĨ DƯỢC
HỌC
•
•
•

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 9720210

Người hướng dẫn khoa học: TS. Lê Đình Chi
PGS.TS. Lê Thị Hồng Hảo

HÀ NỘI, NĂM 2018


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình
nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết
quả nêu trong luận án là trung thực và
chưa từng được ai công bố trong bất kỳ
công trình nào khác.

Tống Thị T hanh Vượng

i

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN Đ Ề .........................................................................................................

1

CHƯƠNG 1. TỔNG Q U AN ................................................................................

3

1.1. ĐỘC TỐ SINH VẬT BIỂN...............................................................................

3

1.1.1. Nguồn gốc.....................................................................................................

3

1.1.2. Tóm tắt quá trình nghiên cứu một số nhóm độc tố tảo đơnbào gây độc
cho con người......................................................................................

4

1.2. NGUỒN GỐC, CẤU TRÚC HOÁ HỌC, ĐỘC TÍNH VÀ QUY ĐỊNH KIỂM
SOÁT ĐỘC TỐ DSP..................................................................................................

7

1.2.1. Nguồn gốc độc tố D SP.................................................................................

7


18

1.3.1.3. Các phương pháp thuỷ phân mẫu và làm sạch sau thuỷ phân..................

20

1.3.2. Các phương pháp sinh học để phân tích độc tố nhóm acid okadaic..........

21

iii


1.3.2.1. Các phương pháp định lượng sinh học in vivo.........................................

21

1.3.2.2. Các phương pháp định lượng qua gây độc tế bào.....................................

22

1.3.2.3. Các phương pháp hoá sin h .........................................................................

23

1.3.3. Các phương pháp hoá lý để phân tích độc tố nhóm acid okadaic..............

24



29

1.4.1.4. Khối phổ dạng ester của O A .......................................................................

34

1.4.2. Phân tích định tính, định lượng độc tố nhóm OA bằng LC - MS/M S........

36

1.4.2.1. Kỹ thuật ion hoá..........................................................................................

36

1.4.2.2. Lựa chọn phân tích khối.............................................................................

37

1.4.2.3. Điều kiện sắc k ý ..........................................................................................

38

CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, TRANG TH IẾ T BỊ, NỘI DUNG VÀ
PHƯ ƠNG PHÁP NGHIÊN C Ứ U .......................................................................

43

2.1. NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ..................................................................



ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU........................................................................

45

2.2.1. Mẫu nhuyễn thể lấy tại các địa phương.........................................................

45

2.2.2. Mẫu thêm chuẩn.............................................................................................

45

2.2.3. Mẫu chuẩn nhuyễn thể có chứa độc tố ..........................................................

45

2.3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..........................................

46

2.3.1. Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời OA, DTX1, DTX2 trong
nhuyễn thể..................................................................................................................

46

2.3.1.1. Khảo sát xây dựng điều kiện khối phổ......................................................

46


51

2.3.3.1. Tiến hành phân tích trên mẫu thực.............................................................

51

2.3.3.2. Các tiêu chí đánh giá kết quả phân tích độc tố trong nhuyễn thể.............

52

2.3.3.3. Các hướng biện giải, bàn luận kết quả......................................................

52

v


CHƯƠNG 3. K ẾT QUẢ NGHIÊN C Ứ U ...........................................................

53

3.1. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH OA, DTX1 VÀ DTX2..................

53

3.1.1. Khảo sát thiết lập điều kiện phân tích OA, DTX1 và DTX2 bằng M S......

53

3.1.1.1. Điều kiện của detector M S/M S.................................................................

73

3.1.2.6. Khảo sát thiết lập điều kiện thuỷ phân để phân tích OA, DTX1 và
DTX2 toàn phần trong nhuyễn thể..........................................................................

74

3.1.3. Khảo sát thiết lập điều kiện bảo quản nhuyễn thể.....................................

79

3.1.3.1. Đánh giá độ ổn định của độc tố trong nhuyễn thể ở một số điều kiện
nhiệt độ......................................................................................................................

79

3.1.3.2. Điều kiện bảo quản mẫu nhuyễn thể..........................................................

82

3.2.

THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH OA, DTX1 VÀ DTX2...........

82

3.2.1. Điều kiện của các phương pháp được thẩm định.........................................

82



3.2.2.5. Độ đúng........................................................................................................

91

3.2.2.6. Độ nhậy........................................................................................................

92

3.2.3. Thẩm định phân tích độc tố tự do và toàn phần trên cột Zorbax.................

94

3.2.3.1. Độ đặc hiệu..................................................................................................

94

3.2.3.2. Độ thích hợp hệ thống................................................................................

96

3.2.3.3. Độ tuyến tính của khoảng nồng độ làm việc.............................................

97

3.2.3.4. Độ chính xác khi phân tích độc tố tự do....................................................

98

3.2.3.5. Độ chính xác khi xác định độc tố toàn phần..............................................


3.3.2.2. Kết quả phát hiện độc tố sau khi thuỷ phân...............................................

111

3.3.3. Sự phân bố các mẫu phát hiện có độc tố ........................................................

113

3.3.3.1. Phân bố các mẫu có độc tố theo loại nhuyễn thể......................................

113

3.3.3.2. Phân bố các mẫu có độc tố theo địa điểm lấy m ẫu....................................

116

vii


3.3.3.3. Phân bố các mẫu có độc tố theo thời điểm lấy m ẫu...................................

119

CHƯƠNG 4. BÀN LU ẬN ......................................................................................

122

4.1. BÀN LUẬN PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐƯỢC XÂY DỰNG....................



131

4.3. NGUY CƠ ẢNH HƯỞNG TỚI SỨC KHOẺ VÀ HƯỚNG KIỂM SOÁT ĐỘC
TỐ NHÓM OA TRONG NHUYỄN THỂ TRONG TƯƠNG LAI..............................

140

KÉT LUẬN VÀ KIÉN N G H Ị...............................................................................

142

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

viii


DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIÉT TẮT
Ký hiệu

Nội dung

ACN

Acetonitril

ADAM


BrDMEQ

3-bromomethyl-6,7-dimethoxy-1-methyl-2(1H)-quinoxalinon

BSA

Huyêt thanh bò (Bovine Serum Albumin)

CA

9-cloromethylanthracen

CI

Ion hoá hoá học (Chemical Ionization)

CE

Năng lượng băn phá ion sơ cấp (Collision Energy)

CEFAS

Trung tâm khoa học môi trường, ngư nghiệp và nuôi trồng hải sản
Anh (Centre for Environtment, Fisheries and Aquaculture Science)

CTX

Ciguatoxin

CXP


EI

Ion hoá điện tử (Electron Ionization)

ELISA

Định lượng băng găn miên dịch liên kêt enzym (Enzym - Linked
ImmunoSorbent Assay)

ESI

Ion phun điện tử (Electrospray Ionization)

EU

Liên minh châu Au (European Union)

FAB

Băn phá nhanh nguyên tử (Fast-Atom Bombardment)

GC

Săc ký khí (Gas Chromatography)

HPLC

Săc ký lỏng hiệu năng cao (High Performace Liquid Chromatograph


Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ

Giới hạn định lượng (Limit of Quantification)

MBA

Định lượng sinh học trên chuột (Mouse Bioassay)

MEKC

Săc ký điện động mixen (Micellar Electrokinetic Chromatography)

MeOH

Methanol

MRM

Theo dõi đa phản ứng (Multiple Reaction Monitoring)

MU

Đơn vị chuột (Mouse Unit)

NAFIQAD

Cục quản lý chất lượng nông lâm sản và thuỷ sản (National AgroForestry-Fisheries Quality Assurance Department)



SD

Độ lệch chuân (Standard Deviation)

SDS

Sodium DodecylSulfate

SIM

Chê độ chọn lọc ion (Select Ion Monitoring)

S/N

Tín hiệu trên nhiêu nên (Signal/Noise)

SOP

Quy trình thao tác chuân (Standard Operation Procedure)

iii


SPE

Chiêt pha răn (Solid phase extraction)

TCVN



iv


DANH MỤC
CÁC BẢNG,y BIỂU
•
T rang
Bảng 1.1

Quy định kiểm soát độc tố sinh học trong nhuyễn thể theo
Thông tư 33/2015/TT - BNNVPTNT.........................................

Bảng 1.2

15

Một số nghiên cứu sử dụng phương pháp LC - MS để xác định
độc tố nhóm O A ............................................................................

39

Bảng 2.1

Hàm lượng các độc tố trong mẫu chuân......................................

46

Bảng 3.1



Khảo sát điêu kiện nạp mẫu và khả năng thu hồi độc tố .............

71

Bảng 3.7

Khảo sát thể tích rửa giải...............................................................

72

Bảng 3.8

Kết quả đánh giá khả năng làm sạch dịch chiết bằng ly tâm

Bảng 3.9

lạnh.................................................................................................

73

Đánh giá khả năng bảo tồn độc tố sau khi xử lý dịch thuỷ phân..

76

v


Bảng 3.10 Đánh giá thay đổi hàm lượng độc tố tự do trong các điêu kiện
bảo quản khác nhau.......................................................................


Bảng 3.17 Đánh giá độ thích hợp hệ thống trên cột Zorbax Eclipse
Plus.................................................................................................
Bảng 3.18 Kết quả đánh giá độ tuyến tính của khoảng nồng độ làm việc....

97
97

Bảng 3.19 Thâm định độ đúng, độ chính xác với độc tố tự do trên cột
Zorbax..........................................................................................

99

Bảng 3.20 Thâm định ảnh hưởng của loại nên nhuyễn thể lên độ đúng, độ
chính xác với độc tố tự do khi phân tích trên cột Zorbax.............
Bảng 3.21

100

Đánh giá độ đúng, độ chính xác trên mẫu chuân.......................... 102

Bảng 3.22 Thâm định độ chính xác với độc tố toàn phần trên mẫu thực.....

103

Bảng 3.23 Kết quả đánh giá LOD, LOQ trên cột Zorbax Eclipse Plus........

105

Bảng 3.24 Kết quả lấy mẫu nhuyễn thể theo thời gian, địa điểm lấy mẫu


Hình 1.8

31

Phổ ion thứ cấp của ion [M+Na]+ của OA (a), DTX2 (b), DTX1
(c) [24]..............................................................................................

Hình 1.7

30

Phổ ion thứ cấp của ion [M-H]" của OA (a), DTX2 (b), DTX1
(c) [24] ..........................................................................................

Hình 1.6

29

Cơ chế phân mảnh ion thứ cấp từ ion [M-H]- của OA, DTX1,
DTX2 [24] .......................................................................................

Hình 1.5

28

Phổ khối FAB của OA: (a) chế độ ion dương, (b) chế độ ion
dương m/z từ 400 đến 1000, (c) chế độ ion âm [19].....................

Hình 1.4


Kết quả ion thứ cấp thu được khi bắn phá ion sơ c ấp DTX1........

56

Kết quả ion thứ cấp thu được khi bắn phá ion sơ c ấp D TX2........

56

Kết quả tối ưu hoá CE cho các ion thứ cấp....................................

57

Kết quả tối ưu hoá CXP cho các ion thứ cấp.................................

58

Sắc ký đồ chuẩn độc tố ở cùng tỷ lệ pha động sử dụng dung môi
là ACN (A,B) và MeOH (C,D).......................................................

60

Kết quả khảo sát ảnh hưởng nồng độ acid formic trong pha động
tới đáp ứng pic của các độc tố .........................................................

vill

61



Kết quả đáp ứng sắc ký của các độc tố tại LOD với cột Cortecs...

94

Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu trên cột Zorbax........................

95

Kết quả đáp ứng sắc ký của các độc tố tại LOQ với cột Zorbax...

106

Kết quả đáp ứng sắc ký của các độc tố tại LOD với cột Zorbax...

107

Một số sắc ký đồ khi phân tích bằng M S/M S................................

112

Kết quả phát hiện độc tố trên vẹm xanh.........................................

113

Kết quả phát hiện độc tố trên hàu...................................................

114

Kết quả phát hiện độc tố trên sò lông.............................................




ĐẶT VẤN ĐỀ
•

Vệ sinh an toàn thực phẩm là một trong những vấn đề có tầm quan trọng thường
trực cho việc đảm bảo chất lượng cuộc sống của cả cộng đồng và đang nhận
được sự quan tâm sát sao của toàn xã hội tại Việt Nam hiện nay. Trong lĩnh vực
này, nổi cộm hơn cả là việc thực phẩm bị “nhiễm bẩn” bởi các tác nhân gây hại
tới sức khỏe con người có nguồn gốc rất đa dạng, song tựu chung lại có thể
phân loại thành 2 nhóm lớn: Thứ nhất, đó là những chất độc hại nhiễm vào thực
phẩm do các hoạt động vô ý hay cố ý của con người, như lạm dụng thuốc bảo
vệ thực vật trong canh tác cây lương thực, thực phẩm, cây ăn quả, hay việc lạm
dụng kháng sinh, chất kích thích tăng trưởng trong nuôi trồng thủy sản, chăn
nuôi gia súc, hoặc những chất thải độc hại ngấm vào thực phẩm qua các hoạt
động khác của con người như sản xuất công nghiệp, xả thải công nghiệp, rác
thải sinh hoạt bừa bãi ra khí quyển, nguồn nước... Thứ hai là những độc tố mang
nguồn gốc tự nhiên xâm nhập, tích lũy trong thực phẩm, trong đó điển hình có
thể kể đến các độc tố vi nấm trong các loại hạt ngũ cốc, các độc tố vi tảo [13],
[88] và vi khuẩn trong các loại thủy hải sản, nhất là các loại nhuyễn thể. Trong
số các độc tố tự nhiên có thể tích lũy trong thực phẩm, cho tới nay những nghiên
cứu đã được công bố cho thấy các độc tố do các loài vi tảo hai roi sản xuất là
nguyên nhân gây ra rất nhiều hội chứng ngộ độc cho người. Khả năng gây độc
rất đa dạng, trong đó hay gặp nhất là các triệu chứng trên hệ thần kinh (gây tê
liệt, hôn mê, mất trí n h ớ . , có thể tử vong trong các vụ ngộ độc nghiêm trọng)
và hệ tiêu hóa (đau bụng, tiêu chảy, nôn mửa...), dẫn tới những vụ ngộ độc ở
quy mô khác nhau tại nhiều nơi trên thế giới [33], [133]. Trong các hội chứng
ngộ độc đường tiêu hóa do độc tố của vi tảo hai roi gây ra có hội chứng tiêu
chảy do ngộ độc thuỷ sinh vật vỏ cứng (Diarrhetic Shellfish Poisoning - DSP)
với tác nhân là nhóm độc tố gồm acid okadaic (OA) và các dẫn xuất gọi chung

sản xuất ra tetrodotoxin (TTX) [143], một độc tố thần kinh có độc tính rất mạnh.
Độc tố do các tác nhân này sản xuất ra sẽ theo nhiều con đường khác nhau (chẳng
hạn như qua chuỗi thức ăn, qua phơi nhiễm trong môi trường sống) xâm nhập và
tích lũy vào trong cơ thể các loài hải sản mà con người tiêu thụ, qua đó gây ngộ
độc cho người. Tùy thuộc tính chất của từng nhóm độc tố, sự phân bố của các loại
hải sản theo khu vực địa lý cũng như đặc điểm hoạt động nuôi trồng, đánh bắt,

3


mỗi nhóm độc tố có thể gây phơi nhiễm trên người thông qua những loài hải sản
khác nhau. Ngộ độc TTX đã được ghi nhận khi tiêu thụ cá nóc [143], con so biển
[68]. Các hội chứng DSP [148], PSP [72], ASP [16], NSP [26] và AZP [120] xảy
ra chủ yếu khi tiêu thụ các loài hải sản vỏ cứng không xương sống (NT2MV, giáp
xác, v .v ...). Ngộ độc do hội chứng ciguatera xảy ra chủ yếu khi tiêu thụ một số
loài cá biển vùng nhiệt đới [146]. Hội chứng ngộ độc do tảo biển xuất hiện khi
tiêu thụ rau câu [90], trong khi hội chứng ngộ độc rùa biển xuất hiện khi ăn một
số loài rùa biển [99]. Trên đây mới chỉ là những hội chứng ngộ độc và độc tố gây
ảnh hưởng xấu tới sức khỏe con người nên được nghiên cứu, tìm hiểu kỹ. Ngoài
ra, còn nhiều trường hợp sinh vật biển bị ngộ độc ở quy mô khác nhau đã được
ghi nhận, nhất là trong những đợt “tảo nở hoa” [56]. Hiện tượng “tảo nở hoa” là
hiện tượng tự nhiên đã có từ thời xa xưa, khi con người chưa tác động nhiều đến
các hệ sinh thái ven biển. Khi điều kiện môi trường thuận lợi như ánh sáng, nhiệt
độ, độ mặn của nước b i ể n . , các quần thể tảo phát triển nhanh chóng, chứa hàng
triệu tế bào tảo trong một lít nước biển và có thể đổi màu nước biển. Tuy nhiên
các khảo sát mới đây cho thấy tần suất các đợt nở hoa tảo độc xuất hiện ngày càng
thường xuyên trên khắp thế giới, khả năng phơi nhiễm của con người với độc tố
sinh vật biển qua tiêu thụ hải sản, nhất là độc tố của tảo đơn bào, sẽ ngày càng
tăng lên. Điều này cũng dẫn tới việc kiểm soát độc tố của tảo đơn bào trong hải
sản được cơ quan quản lý các nước trên thế giới quy định ngày càng chặt chẽ.

thuỷ sinh vật vỏ cứng (PSP) [54].
Tuy nhiên, tác nhân thực sự gây ra những hiện tượng ngộ độc đó mới chỉ bắt đầu
được tìm ra và nghiên cứu một cách có hệ thống từ cuối thế kỷ 19, khi Taharain
phát hiện ra TTX, một loại độc tố có quan hệ chặt chẽ với hiện tượng ngộ độc khi
ăn một số loài cá nóc vào năm 1880 [64]. Sau đó, TTX cũng đã lần lượt được
phân lập từ nhiều loài sinh vật biển khác [95]. Hiểu biết của con người về “hội
chứng ciguatera” bắt đầu có những bước tiến đáng kể từ năm 1959, khi Randall
đưa ra giả thiết tác nhân gây ngộ độc được đưa vào chuỗi thức ăn do các loài cá
ăn thực vật đã tiêu thụ các loài vi tảo độc, rồi sau đó lại bị các loài cá ăn thịt lớn
hơn ăn [103]. Những tiến bộ mang tính đột phá đạt được bao gồm việc phát hiện
và phân lập được “ciguatoxin” (CTX) vào năm 1967 từ một loài tảo đơn bào hai
roi Gambierdiscus toxicus [88] tiết ra độc tố, xác định cấu trúc hóa học và các dẫn
xuất của CTX.
Nhóm độc tố là nguyên nhân gây ra bệnh NSP được phân lập vào thập niên 1970,
cấu trúc hóa học của chúng được xác định trong thập niên 1980. Nhóm độc tố này
do các loài tảo Karenia brevis tiết ra và được đặt tên là các “brevetoxin” [13].
Trong trường hợp của bệnh PSP, mối liên hệ chính xác giữa tình trạng ngộ độc

5