ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Trần Thị Kiều Oanh

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ
ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA QUERCETIN TỪ MỘT
SỐ LOÀI THỰC VẬT Ở VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2018

i


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Trần Thị Kiều Oanh

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ
ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA QUERCETIN TỪ
MỘT SỐ LOÀI THỰC VẬT Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC


Trần Thị Kiều Oanh

iii


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................. i
DANH MỤC BẢNG ...................................................................................................viii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................................... ix
MỞ ĐẦU ........................................................................................................................ 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................ 3
1.1 Tổng quan về flavonoid ............................................................................................ 3
1.1.1. Giới thiệu chung về flavonoid .............................................................................. 3
1.1.2. Sinh tổng hợp flavonoids ..................................................................................... 3
1.1.3 Các dạng khác nhau của flavonoid ........................................................................ 5
1.2. Quercetin và một số tính chất đặc trƣng .................................................................. 7
1.2.1. Định danh v đặc tính của quercetin ................................................................... 7
1.2.2. Đặc tính chống oxi hóa của Quercetin ................................................................ 8
1.2.3. Một số tác dụng của Quercetin ........................................................................... 10
1.3. C c phƣơng ph p t ch chiết hợp chất.................................................................... 14
1.3.1. Khái quát về phƣơng ph p t ch chiết ................................................................. 14
1.3.2. C c phƣơng ph p t ch chiết ............................................................................... 15
1.4. Giới thiệu một số thực vật nghiên cứu .................................................................. 17
1.4.1. Rau má ................................................................................................................ 17
1.4.2. Cây đinh lăng ...................................................................................................... 18
1.4.3. Hoa hòe ............................................................................................................... 18
1.4.4. Rau đắng biển ..................................................................................................... 19
1.5.5. Bụp giấm............................................................................................................. 19
CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 20



DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Con đƣờng sinh tổng hợp Flavonoids và Quercetin ở A. thaliana...............4
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của hợp chất nhóm flavonols (quercetin, kaempferol,
myricetin và isorhamnetin) ..........................................................................................5
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của nhóm flavones (luteolin, apigenin)...........................5
Hình 1.4. Cấu trúc hóa học nhóm flavanones (eridictyol, hesperetin, naringenin).....6
Hình 1.5. Cấu trúc nhóm flavan-3-ols (catechins và epicatechins..............................6
Hình 1.6. Cấu trúc hóa học nhóm theaflavins.............................................................6
Hình 1.7. Cấu trúc hóa học nhóm anthocyanidins (cyanidin, delphinidin, malvidin,
pelargonidin, peonidin và petunidin)...........................................................................7
Hình 1.8. Cấu trúc hóa học của quercetin...................................................................7
Hình 1.9. M tả qu trình loại gốc oxi hóa (R) bởi Flavonoids.................................9
Hình 1.10. Các vị trí thực hiện liên kết với gốc oxi hóa tự do tại vòng A, B..............9
Hình 2.1. Quy trình thủy phân mẫu cho nghiên cứu TLC và HPLC........................26
Hình 3.1. Kết quả đ p ứng tín hiệu khi rửa giải theo hệ 1..........................................37
Hình 3.2. Khảo sát thời gian lƣu v độ phân giải theo các hệ pha động khác nhau.....38
Hình 3.3. Sắc ký đồ mẫu thử (hoa hòe) tại λ = 370nm rửa giải theo hệ pha động
táchđƣợc lựa chọn (3a-hệ 4) v kh ng t ch đƣợc (3b-hệ 5).......................................39
Hình 3.4. Kết quả khảo sát thể tích tiêm mẫu mẫu chuẩn quercetin (4a) và mẫu thử
dịch chiết hoa hòe (4b)...............................................................................................39
Hình 3.5. Ảnh 3D quét phổ ở 4 bƣớc sóng trong điều kiện có chuẩn quercetin........41
Hình 3.6. Thông số sắc ký qua 5 lần thí nghiệm........................................................42
Hình 3.7. Thời gian lƣu của đỉnh quercetin chuẩn khi thay đổi áp suất đầu cột từ mức
35 bar lên mức khoảng 59-60 bar...............................................................................43
Hình 3.8. Kết quả chạy mẫu bụp giấm trƣớc thủy phân............................................43
Hình 3.9. Kết quả chạy mẫu đinh lăng trƣớc thủy phân...........................................43
Hình 3.10. Kết quả chạy mẫu hoa hòe trƣớc thủy phân...........................................44
Hình 3.11. Kết quả chạy mẫu rau đắng biển trƣớc thủy phân..................................44



DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt

Ý n hĩ

ASE

Kỹ thuật chiết nhanh với dung môi

DCM

Dichloromethane

DEPT

Distortionless Enhancement by Polarisation
Transfer

DMEM

M i trƣờng Dulbecco’s Modified Eagle

DMSO

Dimethyl sulfoxide

DPPH


MTT

3-(4,5-dimethylthiazolyl-2)-2,5diphenyltetrazolium
bromide

NCI

Viện Ung thƣ Hoa kỳ

NMR

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân

SFE

Kỹ thuật chiết siêu tới hạn

UAE

Kỹ thuật chiết bằng sóng siêu âm

v/v

Thể tích / Thể tích

w/v

Khối lƣợng / Thể tích


để thu nhận quercetinanglycol trực tiếp từ thực vật, kh ng qua giai đoạn trung gian
nhờ vào dạng quercetin liênhợp. Để giải quyết đƣợc vấn đề này thì cần phải nghiên

1


cứu c c phƣơng ph p đ nh giá nhằm x c định quercetin ở dạng tự do và liên hợp,
cũng nhƣ độ ổn định của quercetin về hóa lý và sinh học trong quá trình thu nhận.
Để góp phần đ p ứng nhu cầu thực tế đó, chúng t i thực hiện đề t i “Nghiên
cứu tách chiết v đ nh gi hoạt tính sinh học của quercetin từ một số loài thực vật ở
Việt Nam”với mục tiêu:
- X c địnhmột số đặc tính hóa lý và sinh học của dịch chiết methanol chứa
quercetin từ một số loài thực vật tại Việt Nam.
- Xác định các thông số sắc ký phù hợp cho phân tách quercetin trong dịch
methanol từ hoa hòe trên cột sắc ký và hệ thống HPLC.

2


CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tổng quan về flavonoid
1.1.1. Giới thiệu chung về flavonoid
Hợp chất flavonoid là nhóm các sắc tố m u đỏ, xanh da trời và tím ở thực vật.
Từ mô tả đầu tiên về các hiệu ứng axit v bazơ trên c c sắc tố thực vật của Robert
Boyle năm 1664 đến sự hình thành các gen cấu trúc v điều tiết hình thành các hợp
chất flavonoid vào cuối thế kỷ 20, hiện nay đã thu thập đƣợc rất nhiều thông tin về cấu
trúc, hoạt động hóa học và sinh tổng hợp những hợp chất này.
Flavonoid là nhóm các phân tử có cấu trúc hợp chất v ng thơm, đa dạng và
có nguồn gốc từ axit amin Phenilalanin và malonyl-coenzyme A (CoA; thông qua con
đƣờng chuyển hóa axit béo). Các hợp chất flavomoid bao gồm 6 phân nhóm chính

loci đƣợc đặt tên là testa trong suốt hoặc đột biến. Hầu hết các gen cấu trúc, cũng nhƣ
một số gen điều h a có tƣơng quan với locus đột biến cụ thể trong cây Arabidopsis.
Loài này dƣờng nhƣ kh ng sử dụng flavonoid theo c ch tƣơng tự nhƣ một số loài
khác tuy nhiên, những đột biến này có ích trong việc x c định vai trò của các hợpFlavonoids
chất in plants

Falcone Ferreyra et al.

n y trong c c qu trình nhƣ bảo vệ tia cực tím và vận chuyển auxin [14,63,65].
A
FLAVONOLS
4-coumaroyl CoA
+ 3 malonyl CoA
MYB11/12/111

KAEMPFEROL

CHS
MYB11/12/111

naringenin chalcone

FLS MYB11/12/111
FLS MYB11/12/111
F3’H
dihydroquercetin
dihydrokaempferol

F3H


ANR
poly
pelargonin
me r
flavan-3-ol
izat
TT2/TT8/TTG1
ion
UFGT
riz
me

leucocyanidin

PAP1/PAP2

ANS TT8/GL3/EGL3
TTG1

cyanidin
PAP1/PAP2

UFGT TT8/GL3/EGL3
TTG1

PELARGONIN
3-GLUCOSIDE

ANTHOCYANINS


P1
P1
chalcone isomerase; C1/PL
F3H
Flavanone
3 FNR
hydroxylase;
C1/PL P1 F3'H, flavonoid-3'-hydroxylase; DFR,
P1
CHS
R/B

C1/PL

R/B

C1/PL

R/B
dihydroflavonol 4-reductase;
FNR,R/Bflavanone-4-reductase;
ANS, anthocyanidin synthase,
naringenin chalcone
naringenin
eriodictyol

F3’H

P1
C1/PL


P1

DFR C1/PL

P1
C1/PL
R/B

P1

DFR C1/PL

FLAVONOL

phenylalanine thành 4-coumaroyl-CoA, cuối cùng đi v o con đƣờng sinh tổng hợp
R/B

leucopelargonin

R/B

leucocyanidin

flavonoid (Hình 1.1). Enzyme đầu tiên
hiệu cho conANS
đƣờng
flavonoid là chalcone
C1/PL
C1/PL

isomerase; F3H, flavanone 3-hydroxylase; F3′ H, flavonoid-3′ -hydroxylase; DFR,


synthase xúc tác cho phản ứng tạo ra các chalcone mà từ đó tất cả c c flavonoid đƣợc
tổng hợp [65].
Con đƣờng trung tâm cho sinh tổng hợp flavonoid đƣợc bảo tồn trong thực vật,
tùy thuộc vào loài một nhóm c c enzym nhƣ isomerases, reductases, hydroxy-lases, và
một số dioxygenases phụ thuộc Fe2+. Hợp chất 2-oxyglutarate phụ thuộc vào bộ
xƣơng flavonoid cơ bản, dẫn đến các phân lớp flavonoid khác nhau. Cuối cùng,
tranferases thay đổi xƣơng sống flavonoid với đƣờng, nhóm methyl hoặc acyl
moieties, điều chỉnh hoạt động sinh lý của flavonoid kết quả bằng c ch thay đổi độ
hòa tan, phản ứng v tƣơng t c với các mục tiêu tế bào [67].
1.1.3 Các dạng khác nhau của flavonoid
Quercetin là một flavonoid phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Tên n y đã đƣợc
sử dụng từ năm 1857 v có nguồn gốc từ quercetum (rừng sồi), sau là Quercus.
Quercetin là chất ức chế vận chuyển auxin có tự nhiên[49]. Quercetin là một trong
những chất flavonoid đƣợc sử dụng nhiều[16,17] với mức tiêu thụ trung bình hàng
ngày khoảng 25-50 miligam/ngƣời.

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của hợp chất nhóm flavonols (quercetin, kaempferol,
myricetin và isorhamnetin) [40]

Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của nhóm flavones (luteolin, apigenin) [40]

5


Hình 1.4. Cấu trúc hóa học nhóm flavanones (eridictyol, hesperetin, naringenin) [40]

Hình 1.5. Cấu trúc nhóm flavan-3-ols (catechins và epicatechins) [40]



1 2 2 Đặc tính chống oxi hóa của Quercetin
Các chất chống oxi hóa đƣợc nghiên cứu, sử dụng đƣợc hiểu theo nhiều nghĩa
khác nhau tùy theo hoạt động oxy hóa của nó. Halliwell v Gutteridge định nghĩa của
chất oxi hóa là bất kỳ chất nào giảm thiểu, ngăn chặn hoặc loại bỏ gốc oxi hóa tự do
gây hại cho phân tử mục tiêu. Với định nghĩa n y t c dụng sinh lý của các hợp chất
chống oxi hóa l để ngăn chặn những thiệt hại cho thành phần tế bào do những hệ quả
của phản ứng hóa học liên quan đến gốc tự do. Quá trình nhặt c c “r c” gốc oxi hóa
tự do của các chất thuộc nhóm Flavonoids đƣợc trình bày hình 1.9.

8


Hình 1.9. Mô tả quá trình nhặt gốc oxi hóa (R) bởi Flavonoids [46]
Các chất chống oxi hóa invintro hoạt động phụ thuộc vào cách bố trí các
nhóm chức năng trên cấu trúc lõi của nó. Cả hai cấu hình và tổng số lƣợng của nhóm
hydroxyl (-OH) ảnh hƣởng đ ng kể tới cơ chế hoạt động chống oxy hóa.
Các cấu hình vòng B hydroxyl là yếu tố quyết định tới hoạt động chống gốc
oxy hóa. Trong hình 1.9. mô tả hoạt động tách H+ (nhóm –OH) của chất chống oxi
hóa và gốc oxi hóa R. làm chúng mất khả năng t c động xấu tới tế b o đ ch, c c gốc
tự do dạng Fl-O có thể phản ứng tƣơng tự. Kết quả của quá trình là tạo ra cấu trúc
Quinine ổn định [46]. Hoạt động chống oxi hóa invitro có thể đƣợc tăng lên bằng
phản ứng trùng hợp c c flavonoid l m tăng số lƣợng nhóm hydroxyl trong phân tử
qua đó hoạt động chống gốc oxi hóa đƣợc tăng lên.

Hình 1.10.Các vị trí thực hiện liên kết với gốc oxi hóa tự do tại vòng A, B [46]
Quercetin là chất chống oxi hóa mạnh dựa vào khả năng t ch c c gốc tự do và
liên kết với các ion kim loại chuyển tiếp. Khả năng chống oxi hóa đó trƣớc hết liên
quan đến sự tồn tại của 2 loại nhóm liên kết chống oxi hóa bên trong phân tử có hình

Quá trình sinh học liên quan đến lão hóa có thể đƣợc khắc phục chủ động bởi
một số yêu tố m i trƣờng, ví dụ nhƣ chất chống oxi hóa tự nhiên (nhƣ vitamin E,
tỏi…). Th ng qua c c thuộc tính chống oxi hóa của quercetin và mối liên hệ giữa tuổi
tác và sự stress oxi hóa. Vai trò của quercetin là hình thành ảnh hƣởng tích cực lên
khả năng tồn tại, phát triển độc lập, v v ng đời của các nguyên bào sợi nguyên thủy
của ngƣời (HFL-1); hơn nữa, khi các tế b o lão hóa đƣợc nuôi trong sự có mặt của
quercetin, quan s t đƣợc sự trẻ hóa [19].

10


Chống dị ứng
Quercetin là hợp chất tự nhiên có khả năng t c động các chất liên quan đến các
loại dị ứng và hoạt động nhƣ một chất ức chế tiết dƣỡng bào, dẫn đến sự giảm tiết ra
tryptase, các protein tín hiệu do đại thực bào gây ra: MCP-1 và IL-6 và sự điều chỉnh
giảm histidine decarboxylase (HDC) mRNA từ một số ít dòng tế b o dƣỡng bào [55].
Cũng nhƣ c c hợp chất polyphenol, flavonoids khác có tác dụng chống viêm và
kháng khuẩn và thể hiện hoạt động chống dị ứng, quercetin cũng thể hiện nhƣ một loại
thuốc chống dị ứng tiềm năng. Hiện tại, tổ chức nghiên cứu dị ứng thực phẩm (Food
Allergy Herbal Formula -FAHF) đ nh gi quercetin có tiềm năng tƣơng tựchất chống
dị ứng an toàn nhƣng cần có nhiều những nghiên cứu tác dụng phụ hơn để trở thành
thuốc chống dị ứng thực sự [13].
Khả năn bảo vệ hệ tuần hoàn
Quercetin cũng đƣợc đặc biệt chú ý nhƣ một hợp chất có tác dụng giúp điều trị
cũng nhƣ ph ng ngừa các bệnh về tim. Trong thực tế, việc sử dụng quercetin có liên
quan sự giảm tỉ lệ chết do bệnh tim và giảm tỉ lệ đột quỵ. Pashevin [41] báo cáo số
liệu mới về đặc tính bảo vệ tim mạch của quercetin trong nghiên cứu chỉ ra, thử
nghiệm trên thỏ sau một thực đơn gi u cholesterol, sau đó cho thỏ uống trong vòng 1
tháng Corvitn (dạng h a tan trong nƣớc dẫn xuất Quercetin) thấy giảm đ ng kể mọi
loại hoạt động thủy phân protein của phức hệ proteasome trong các mô và bạch cầu

đến lipid bao gồm Fnta, Pon1, Pparg, Aldh1b1, Apoa4, Abcg5, Gpam, Acaca, Cd36,
Fdfft1 và Fasn. Các mô hình biểu hiện của c c gen n y đƣợc quan sát bằng phản ứng
chuỗi polymerase-transriptase v đƣợc x c định bằng hệ thống lai miễn dịch. Các kết
quả chỉ ra rằng quercetin ngăn chặn béo phì gây ra bởi chế độ ăn nhiều chất béo trong
chuột C57b1/6, và tác dụng chống béo phì của nó có liên quan đến c c quy định của
lipogenesis ở mức độ phiên mã [19].
Điều trị viêm khớp
Trong sự kết hợp với các chất dinh dƣỡng khác, quercetin có thể làm giảm các
triệu chứng của viêm xƣơng khớp (viêm khớp): trong nghiên cứu với 20 bệnh nhân
viêm khớp dạng thấp có bổ sung hàng ngày cùng lúc 3 loại thuốc: quercetin (16
6mg/viên); với vitamin C (33 mg/viên), lipoic acid (300 mg/viên) trong vòng 4 tuần
liên tiếp thì thấy rằng nồng độ cytokine gây viêm hoặc protein C-reactive (CRP) trong
huyết thanh không có sự khác biệt đ ng kể v cũng chƣa có t c dụng điều trị. Nhƣng
khi nghiên cứu lên tới 46 ngƣời và thời gian kéo dài lên tới 3 tháng có kết hợp với
hoạt động hàng ngày thì đã thấy dịch lỏng đƣợc tiết ra trong các mô viêm khớp [30].

12


Giảm nguy cơ mắc hen suyễn
Nghiên cứu về mối quan hệ giữa quercetin hay các dẫn xuất của nó đối với các
triệu chứng của bệnh hen suyễn do c c t c nhân m i trƣờng (phấn hoa, côn trùng) gây
nên cũng chƣa đƣợc rõ nét. Tuy nhiên, các tài liệu cho thấy t c động của một loại
quercetin glycoside là isoquercitrin enzyme đã t c động lên những triệu chứng của dị
ứng dạng trên. Điều trị với 100-200mg/ngày với dạng quercetin glycoside trong vòng
8 tuần có hỗ trợ những hiện tƣợng dị ứng dạng trên tại mắt nhƣng tại mũi thì chƣa có
kết quả đ ng tin cậy [21].
Điều trị tiểu đường
Nghiên cứu những con chuột mắc bệnh tiểu đƣờng cho thấy sự gia tăng đ ng
kể về cácchỉ số tỉ trọng giữa thận/trọng lƣợng cơ thể, lƣợng đƣờng trong m u, lƣợng

hợp với một hoặc nhiều phƣơng ph p kh c nhau (bảng 1.2). C c bƣớc chuẩn bị cho
tách chiết mẫu thực vật:
Lựa chọn mẫu thực vật phù hợp trƣớc khi tách chiết rất quan trọng. Ta cần lựa
chọn mẫu phù hợp nhất để đem lại các kết quả tốt nhất sau khi tách chiết.
Mẫu tươi v mẫu khô: Các mẫu kh đƣợc ƣu tiên hơn vì chúng chứa hàm
lƣợng flavonoid cao hơn so với mẫu tƣơi v thời gian bảo quản mẫu kh lâu hơn [9].
Mẫu nghiền và mẫu b t: Sử dụng các mẫu này có thể l m tăng bề mặt tiếp xúc
giữa mẫu thực vật và các dung môi chiết xuất. Các mẫu bột chứa các hạt nhỏ hơn c c
mẫu nghiền, dẫn đến sự tiếp xúc bề mặt tốt hơn.Trong khi đó việc nghiền mẫu chỉ làm
mẫu nhỏ hơn, do đó mẫu bột phổ biến hơn.
Phương pháp tiền tách chiết: Có 4 phƣơng ph p tiền tách chiết: Sấy khô bằng
khí, sấy bằng lò vi sóng, sấy khô và sấy đ ng kh (Bảng 1.2) [7].

14


Bảng 1.2. So s nh c c phƣơng ph p tiền tách chiết [7]
Phƣơn
pháp
Cách sử
dụng

Thời gian

Đặc điểm

Ƣu điểm

Sấy bằng khí



hiện tƣợng

nhiệt

thăng hoa

Ngắn hơn
sấy bằng
khí

Qua đêm
(12h)

Có hiện tƣợng

Làm khô

Làm khô

l m nóng đồng

nƣớc bằng

bằng nhiệt

thời

nhiệt độ



chống oxi

nhiệt độ không ổn định phytochemicals

hoá

H m lƣợng
phenolic
cao hơn
Mẫu có thể
bị mất.Tốn
kém

1 3 2 Các phƣơn pháp tách chiết
Có nhiều phƣơng ph p t ch chiết gồm phƣơng ph p truyền thống và hiện đại
với mục đ ch l t ch đƣợc các hợp chất mong muốn. C c phƣơng ph p t ch chiết
truyền thống: Ngâm, chiết, thấm và sắc; chiết bằng máy chiết Soxhlet (Bảng 1.3).
C c phƣơng ph p t ch chiết hiện đại: Chiết bằng lò vi sóng (MAE), chiết bằng
sóng siêu âm (UAE), chiết nhanh với dung môi (ASE) và chiết siêu tới hạn (SFE)
(Bảng 1.4). C c phƣơng ph p ASE v SFE đƣợc sử dụng ít vì tốn kém và hiệu quả
thấp. Mỗi phƣơng ph p t ch chiết đƣợc sử dụng cần phù hợp với mẫu chiết và dung
môi chiết khác nhau. Dung môi chiết có thể phân cực hoặc không phân cực. Các dung
m i thƣờng sử dụng nhƣ ethanol, methanol, n-hexane, ethyl acetate [7].

15


Bảng 1.3. So s nh c c phƣơng ph p t ch chiết truyền thống [7]
Phƣơn

này mẫu đƣợc ngâm trong thời gian
trên 2 giờ.
- Mẫu mịn đƣợc đặt trong một túi xốp
hoặc "bao" đƣợc làm từ giấy lọc hoặc
xenlulô nằm trong buồng của thiết bị
Soxhlet.
- Dung môi chiết xuất đƣợc đun nóng
trong bình đ y, v bay hơi v o buồng
mẫu, ngƣng tụ trong bình ngƣng v
nhỏ giọt.
- Khi lƣợng chất lỏng, dung dịch
trong bình cạn và quá trình chiết lặp
lại.

16

Nhƣợc
điểm

Ứng dụng

Dùng để
Dễ
Chất thải tách chiết các
dàng
vẫn
chất trong các
v đơn chứa
lo i nhƣ
giản