KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

GVHD: THS. DƯƠNG NHẬT LINH

MỤC LỤC

SVTH: NGÔ THỊ KIM HÀ

1


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

GVHD: THS. DƯƠNG NHẬT LINH

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 Các giống khác nhau của vi khuẩn lactic
Bảng 2.1 Các test sinh hóa khi định danh vi khuẩn lactic........................................28
Bảng 3.1 Bảng kết quả khảo sát đại thể và vi thể vi khuẩn lactic phân lập
Bảng 3.2 Kết quả phản ứng màu khi định lượng LOX của các chủng LAB được phá
vỡ màng tế bào bằng phương pháp Lysozym..........................................................45
Bảng 3.3 Bảng kết quả định lượng LOX của các chủng LAB của các chủng vi
khuẩn LAB được phá vỡ màng tế bào bằng phương pháp Acetone-SDS................46
Bảng 3.4 Bảng kết quả định lượng enzym của các chủng LAB của các chủng vi
khuẩn LAB được phá vỡ màng tế bào bằng phương pháp Lysozym.
Bảng 3.5 Kết quả định danh nhóm LAB lên men đồng hình nhóm A

DANH MỤC ĐỒ THỊ
Đồ thị 3.1 Đồ thị biểu diễn hoạt độ enzym sinh ra của các chủng LAB được phá vỡ
màng tế bào bằng phương pháp Acetone-SDS........................................................ 6
Đồ thị 3.2 Đồ thị biểu diễn hoạt độ enzym sinh ra của các chủng LAB của các được

Hình 3.5. Hình ảnh khuẩn lạc trên môi trường HHD
Hình 3.6. Hình dạng khuẩn lạc trên môi trường MRSA 1% CaCO3
Hình 3.7. Hình dạng vi thể của các chủng vi khuẩn lactic
Hình 3.8. Thử nghiệm catalase đối chứng
Hình 3.9. Thử nghiệm oxidase đối chứng
Hình 3.10. Định tính acid lactic bằng thuốc thử Unphenment mẫu (+)
Hình 3.11. Định tính acid lactic bằng thuốc thử Unphenment mẫu (-)

SVTH: NGÔ THỊ KIM HÀ

3


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

GVHD: THS. DƯƠNG NHẬT LINH

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Bp

base pair (cặp base)

Cs

cộng sự

Dd

dung dịch


L-lactate oxidase

MRS

Môi trường deMan Rogosa and Sharpe

MRSA

Môi trường deMan Rogosa and Sharpe agar

MT

Môi trường

OD

Optical Density (mật độ quang)

PP

Pentose photphat

TB

Tế bào

v/p

Vòng/phút


5


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

GVHD: THS. DƯƠNG NHẬT LINH

Lactate là một chất chuyển hóa chính được hình thành từ quá trình trao đổi
chất kị khí của glucose trong cơ bắp. Khi lượng lactate được tạo ra đủ cao sẽ gây ra
hiện tượng nhiễm toan lactic (Kemp, 2005), các bệnh lý liên quan đến cường lactate
hay các bệnh lý do thiếu hụt oxy như suy tim, suy hô hấp, suy thận, thiếu máu cấp,
nhồi máu cơ tim…Vì vậy, việc kiểm soát nồng độ lactate là một trong những chỉ số
sinh hóa đóng vai trò vô cùng quan trọng. Sự tích lũy của lactate trong cơ thể có thể
do nhiều lí do khác nhau như quá trình chuyển hóa acid pyruvate sinh ra trong quá
trình đường phân của tế bào hoặc từ thức ăn, đặc biệt là các sản phẩm thực phẩm
lên men (Carr, 2002).
Trong những năm gần đây đa số nghiên cứu về lactate tập trung vào mối quan
hệ của lactate đối với khối u. Một nghiên cứu của các nhà khoa học Mỹ đến từ
nhiều trường đại học đã phát hiện lactate-chất tuần hoàn tích tụ trong mô và máu,
gây cứng cơ và cản trở quá trình trao đổi chất là một trong những tác nhân khiến tế
bào ung thư phát triển mạnh và đẩy nhanh tốc độ di căn của các khối u ác tính trong
cơ thể người bệnh (Joanne và cs, 2013). Trong nghiên cứu mới này, các nhà nghiên
cứu đã phần nào làm sáng tỏ vai trò của lactate trong quá trình hình thành các mạch
máu mới trong khối u, cách thức chất này can thiệp vào hệ miễn dịch của cơ thể
phản ứng với các tế bào ung thư cũng như cách thức lactate hình thành môi trường
vi mô có tính acid hay một khu vực bên ngoài tế bào ung thư, có thể đẩy nhanh tốc
độ di căn của khối u ác tính (Hirschhaeuser, 2011). Vì vậy việc kiểm soát hàm
lượng lactate là rất quan trọng.
Trong sự hiện diện của oxy hòa tan, L-lactate oxidase xúc tác quá trình oxy hóa
của L-lactate thành pyruvate và tạo thành hydrogen peroxide (Haccoun và cs,

Sàng lọc các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh L-lactate oxidase.
 Nội dung thực hiện:
− Phân lập các chủng vi khuẩn lactic từ các sản phẩm lên men truyền thống
− Định tính khả năng sinh enzym L-lactate oxidase
− Xác định hoạt tính enzym L-lactate oxidase.
− Định danh chủng bằng phương pháp sinh hóa.
−

SVTH: NGÔ THỊ KIM HÀ

7


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

GVHD: THS. DƯƠNG NHẬT LINH

1...................................................................T
ỔNG QUAN

SVTH: NGÔ THỊ KIM HÀ

8


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

GVHD: THS. DƯƠNG NHẬT LINH

TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LACTIC


9


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

GVHD: THS. DƯƠNG NHẬT LINH

Giống I: Lactobacillus
Giống II: Pediococcus
Họ II: Enterococceae
Giống: Enterococcus
Họ III: Leuconoscaceae
Giống: Leuconostoc
Họ IV: Streptococcaceae
Giống I: Streptococcus
Giống II: Lactococcus
Nhóm vi khuẩn này rất đa dạng gồm nhiều giống khác nhau. Tế bào của chúng
có dạng hình cầu như Streptococcus, Lactococcus, Enterococcus, Leuconostoc,
Pediococcus hoặc hình que như Lactobacillus. Theo Kandler và Welss (1986),
nhóm vi khuẩn lactic còn được bổ sung thêm vi khuẩn Bifidobacterium. Ngoài ra
dựa vào khả năng lên men người ta chia LAB thành hai nhóm LAB đồng hình và
LAB dị hình (Kenneth, 1990).

SVTH: NGÔ THỊ KIM HÀ

10


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP


Leuconostoc

Cầu

Chuỗi

Lactic dị hình

36 - 43

Farrow và cộng
sự, 1989

Pedicoccus

Cầu

Tụ cầu

34 - 42

Schleifer, 1986

Lactobacillus

Que

Chuỗi
(tetrade)

men acetic

Theo Trivisan năm 1889 giống Streptococcus thuộc họ Streptococcaceae,
thuộc lớp vi khuẩn Gram (+) bao gồm các cầu khuẩn lên men lactic đồng hình (trừ
một số ít loài) theo con đường hexose diphosphate tạo sản phẩm chủ yếu là acid
lactic D (+), bất động (trừ một số ít loài), đường kính cầu khuẩn 0,5 - 1µm, sau khi
phân chia theo một phương chúng tạo thành một chuỗi, sống hoại sinh trong đất, bề
mặt cây, da người, ruột... (Kenneth, 1990).

SVTH: NGÔ THỊ KIM HÀ

11


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

GVHD: THS. DƯƠNG NHẬT LINH

Hình 1.1 Streptococcus
a: Streptococcus dưới kính hiển vi điện tử
b: Streptococcus nhuộm Gram
(Nguồn: Internet)
1.1.2.2 Giống Leuconostoc
Thuộc lớp cầu khuẩn Gram (+) dạng đôi, khi phân chia chúng tạo thành cặp
hoặc chuỗi ngắn, kỵ khí tùy nghi, không di động, không sinh bào tử. Phần lớn
chúng lên men dị hình theo con đường hexose – monophosphat tạo acid lactic D (-),
ethanol và CO2 (Kenneth Todar, text book), vài chủng có khả năng oxi hóa và tạo
acid acetic thay vì ethanol (Van và cs, 1878).

Hình 1.2 Leuconostoc

13


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

GVHD: THS. DƯƠNG NHẬT LINH

Hình 1.4 Enterococcus
a: Enterococcus dưới kính hiển vi điện tử
b: Enterococcus nhuộm Gram
(Nguồn: Internet)
1.1.2.5 Giống Pediococcus
Giống Pediococcus gồm những tứ cầu hoặc dạng song cầu, đường kính 1,0 –
2,0µm, lên men lactic đồng hình, hình thành acid lactic dạng DL hoặc dạng L (+).
Phần lớn Pediococcus không có khả năng sử dụng lactose vì vậy không làm acid
hóa và đông tụ sữa. Các loài Pediococcus khác nhau bởi tính chịu nhiệt, chịu pH,
chịu NaCl và phổ lên men đường (Kenneth, 1990).

Hình 1.5 Pediococcus
a: Pediococcus dưới kính hiển vi điện tử
b: Pediococcus nhuộm Gram
(Nguồn: Internet)

SVTH: NGÔ THỊ KIM HÀ

14


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP



SVTH: NGÔ THỊ KIM HÀ

15


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

GVHD: THS. DƯƠNG NHẬT LINH

nhờ con đường lên men dị hình để tạo thành acid lactic, acid acetic do
phosphocetolase được cảm ứng.
 Nhóm III: Betabacterium, là những vi khuẩn lên men dị hình bắt buộc.
Chúng sinh ra acid lactic, acid acetic, CO 2 và ethanol. Những vi khuẩn này
có phosphocetolase nhưng không có aldolase (Isolauri và cs, 1991).
Giống Lactobacillus gồm nhiều loài được sử dụng làm probiotic, lợi ích của
nhóm này đã được công nhận bằng nhiều công trình nghiên cứu. Một trong những
ứng dụng tiềm năng nhất là trong điều trị bệnh tiêu chảy, bệnh này do rotavirus
trong đường ruột gây nên… (Isolauri và cs, 1991). Nhóm tác giả Isolauri (1991) đã
chứng minh Lactobacillus casei có khả năng làm giảm thời gian bị bệnh tiêu chảy
do Rotavirus. Nghiên cứu của nhóm tác giả Shornikowa và cộng sự (1997) cũng
cho kết quả tương tự.

Hình 1.6 Lactobacillus
a: Lactobacillus dưới kính hiển vi điện tử
b: Lactobacillus nhuộm Gram
(Nguồn: Internet)
1.1.2.7 Giống Bifidobacterium
Bifidobacterium là những trực khuẩn kỵ khí không sinh bào tử, Gram (+), bất
động. Khi mới phân lập chúng là những trực khuẩn có thể phân nhánh có dạng chữ


Hình 1.7 Bifidobacterium
a: Bifidobacterium dưới kính hiển vi điện tử
b: Bifidobacterium nhuộm Gram
(Nguồn: Internet)

SVTH: NGÔ THỊ KIM HÀ

17


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

GVHD: THS. DƯƠNG NHẬT LINH

1.1.3 Sản phẩm của quá trình lên men lactic
Các vi khuẩn khác nhau về khả năng sinh ra acid lactic, là hỗn hợp của hai
đồng phân quang học dạng D-lactic và L-lactic. Chúng phụ thuộc vào sự hiện diện
của lactate dehyrogenase và racemase (Badet, 2008).
Lactic acid có hai đồng phân quang học vì nguyên tử cacbon trung tâm liên
kết với bốn nhóm khác. Đồng phân L-(+) lactic acid hay (S)- lactic acid và đồng
phân còn lại là D-(-) lactic acid hay là (R)- lactic acid (Badet, 2008).

Hình 1.9 Đồng phân quang học D-lactic acid và L-lactic acid (Badet, 2008)

1.1.4 Ứng dụng LAB
Vi khuẩn lactic được ứng dụng lâu đời trong nhiều loại thực phẩm lên men có
nguồn gốc động vật hoặc thực vật vì các tác động có lợi của chúng về dinh dưỡng,
cảm quan và cải thiện tuổi thọ sản phẩm. Vi khuẩn lactic có khả năng tạo ra các hợp
chất kháng khuẩn. Trong đó, việc sản sinh acid lactic và acid acetic là quan trọng

Teragenococcus, Vagococcus, Weisella…. Một vài giống quan trọng như:
Lactobacillus sp, Lactococcus sp, Leuconostoc sp, Streptococcus sp, Pediococcus
sp, Bifidobacterium và Carnobacterium (Abee và cs, 1999).

1.2 TỔNG QUAN LACTATE
Lactate là kết quả sự phân ly của acid lactic, là một chất chuyển hóa nội bào
glucose, đặc biệt là sản phẩm cuối cùng của quá trình thủy phân kị khí glucose, từ
chuyển đổi pyruvate thành lactate bởi enzym lactate dehydrogenase (LDH), tích tụ
trong trường hợp thiếu oxy và mệt mỏi. Lactate trong dịch thể và mô, phản ánh các
mô cục bộ có ở trong trạng thái bị thiếu oxy không. Trong tình trạng thiếu oxy cấp
tính, nồng độ lactate cao được tìm thấy trong cơ tim của thai nhi, đại não, ở một số
cơ quan: thận, gan, ruột, phổi. Do đó, phát hiện lactate nhanh, dễ và chính xác là
điều quan trọng để chẩn đoán bệnh và quản lý sức khoẻ. Chẳng hạn như thiếu máu
cơ tim, tổn thương não và suy hô hấp (Qianwei, 2017).
Có nhiều nguyên nhân gây tăng lactate nhưng phổ biến nhất là tăng sản xuất
lactate từ thủy phân kị khí glucose do giảm oxy đến tế bào mô (thiếu oxy mô).
Thiếu oxy do mô là kết quả của quá trình truyền dịch không đủ và làm giảm lượng
oxy trong máu (thiếu oxy huyết), là một đặc điểm chung của nhiều loại bệnh tật
quan trọng, việc đo hàm lượng lactate được sử dụng nhiều nhất để theo dõi oxy hoá
mô ở các bệnh nặng (Higgins và cs, 2010).
Trong cơ thể người, nồng độ L-lactate máu dao động trong khoảng 0.5 – 1.5
mM khi ở trạng thái nghỉ ngơi và có thể tăng đến 12 mM khi vận động ( Martin
1990), thậm chí nó có thể đạt mức 25 mM khi tập các bài tập toàn thân trong những
điều kiện đặc biệt (Gibello, 1999). Nồng độ lactate trong huyết tương đòi hỏi sự kết
hợp một cách hài hòa giữa các yếu tố có ảnh hưởng đến sự cân bằng giữa lượng
lactate được tạo ra và lượng lactate bị đào thải. Nếu sự cân bằng này bị phá vỡ sẽ
gây ra hiện tượng nhiễm toan lactic. Lượng acid lactic được tạo ra có thể tăng trong
bất kì trường hợp nào có liên quan đến quá trình trao đổi chất kị khí như sốc do mất
máu hoặc nghẽn mạch phổi (Valenza, 2005). Nồng độ lactate cũng có thể tăng ở các
trường hợp bệnh lý như tim mạch, sốc nhiễm độc, suy hô hấp, bệnh gan, rối loạn

và cs, 2013).
Tăng hấp thu glucose và tích lũy lactate, trong điều kiện bình thường (tức là
thủy phân hiếu khí glucose hoặc hiệu ứng Warburg), là một đặc điểm chung của các
tế bào ung thư. Di căn của khối u được thúc đẩy bởi lactate tạo ra môi trường thuận
lợi cho di căn. Lactate gây ra sự di chuyển của các tế bào và các cụm tế bào. Các
phát hiện về tương tác của các chất chuyển hóa khối u với các tế bào miễn dịch cho
thấy sự đóng góp của lactate vào sự chống miễn dịch. Các tế bào khối u bảo đảm
cung cấp đủ oxy và dinh dưỡng cho sự tăng sinh nhờ sự tiết VEGF của lactate, dẫn
đến sự hình thành các mạch máu mới. Sự tích tụ lactat trong khối u rất quan trọng
đối với khối u và làm cho sự phát triển của khối u ác tính diễn ra sớm
(Hirschhaeuser và cs, 2011).

SVTH: NGÔ THỊ KIM HÀ

20


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

GVHD: THS. DƯƠNG NHẬT LINH

Trong tất cả các động vật có xương sống, bao gồm cả con người, dạng Llactate là chất có ý nghĩa sinh học. L-lactate là dạng đặc biệt được đo bằng cảm biến
lactate trong các máy phân tích khí máu và thường dùng để đo lactate trong phòng
thí nghiệm lâm sàng. Các phương pháp thông thường dùng để đo lactate huyết
tương dựa trên việc đo lường sản phẩm của hoạt động enzym đối với lactate. Một
trong hai loại enzym thường được sử dụng cho các phân tích này: lactate
dehydrogenase, có nguồn gốc từ mô động vật và lactate oxidase có nguồn gốc từ vi
khuẩn (Pascal và cs, 2009). So với lactate Oxidase thì lactate dehydrogenase có thời
gian phản hồi chậm và phức tạp hơn (Eithne, 1992).


21


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

GVHD: THS. DƯƠNG NHẬT LINH

(LOX) từ các vi sinh vật khác nhau. Trong đó, LOX từ Aerococcus viridans được
quan tâm nghiên cứu nhiều hơn cả. Lox từ các chủng của loài này đã được tách
dòng, tinh chế, xác định tính chất. Enzym tái tổ hợp của Aerococcus viridans hiện
đã được thương mại hóa trên thị trường bởi các công ty hoá chất như Sigma
Aldrich, Genzym Diagnostic... Enzym này bao gồm 374 acid amin, có khối lượng
phân tử 44 kDa. L-lactate, D-lactate, glycolate được xác định là cơ chất đặc hiệu
của LOX dưới sự tham gia của FMN (Flavin mononucleotide).
LOX của chủng Lactoccocus lactis subsp. cremoris IFO3427 đã được tinh
sạch và nghiên cứu tính chất. Điểm đẳng điện của enzym được xác định khoảng 4,3
± 0,2. Enzym từ chủng này nhiều đặc điểm tương đồng như enzym từ Aerococcus
viridans, nhưng nó chỉ có khả năng chuyển hóa L-lactate chứ không thể chuyển hóa
được D-lactate (Toda và Nishiya, 1998).
LOX có khối lượng phân tử 44.000Da và sử dụng FMN làm cofactor, đặc hiệu cao đối với
L-lactate, D-lactate, glycolate và D, L-2-Hydroxybutyrate không bị oxy hoá bởi LOX. LOX bị bất
hoạt khi ủ với bromopyruvate (Pernet, 2008).

Cấu trúc tinh thể của LOX được công bố lần đầu tiên năm 1998 bởi Morimoto.
Đến năm 2006, cấu trúc 2.1 Å của LOX từ Aerococcus viridians cũng đã được xác
định và công bố. Trong cấu trúc của LOX 8 tiểu phần protein (A, B, C, D, E, F, G,
H) gắn kết với nhau tạo thành 2 tetramer thể hiện cấu trúc không đối xứng của
enzym. Sự tiếp xúc giữa các tinh thể protein tạo nên các vùng liên kết với kim loại
giữa 2 tetramer (Hình1.8) những vùng này sẽ bị loại bỏ trong quá trình biểu hiện và
tinh sạch protein.

cong khoảng 15º quanh các nguyên tử trung tâm, tạo thành hình dạng chữ U cho
nhóm flavin (Leiros và cs, 2006).

1.4 ỨNG DỤNG CỦA LOX ĐỂ CHẾ TẠO BIOSENSOR
1.4.1 Khái quát về biosensor
Biosensor hiện đang là một trong những hướng nghiên cứu nhận được nhiều
sự chú ý của các nhà khoa học trên thế giới. Được công bố lần đầu tiên trên thế giới
bởi Clark và Lyons vào năm 1962 (Palmisano, 2001), biosensor là sự kết hợp giữa
một thành phần sinh học (enzyme, axit nucleic, tế bào, kháng thể) và bộ cảm biến
hóa lý để nhận biết, phân tích một chất nào đó (Palmisano, 2000). Nói cách khác,
biosensor là thiết bị phân tích chuyển đổi một phản ứng sinh học thành tín hiệu
(Hình 1.10). Thuật ngữ "biosensor" thường được sử dụng chung cho các thiết bị
cảm biến dùng để xác định nồng độ các chất và các thông số khác liên quan đến
sinh học, ngay cả khi không sử dụng trực tiếp một hệ thống sinh học (Park, 1997).
*Nguyên lý hoạt động của biosensor:
Chất cần phân tích trong mẫu sẽ đi vào điện cực, sau đó thấm qua màng ngoài
của biosensor. Thành phần sinh học trong bộ thụ cảm (Bioreceptor) sẽ phản ứng với
các chất cần phân tích và tạo ra các đáp ứng mà bộ biến năng (Transducer) có thể
phát hiện và chuyển nó thành tín hiệu điện. Tín hiệu điện này sẽ được khuếch đại và
xử lý thông qua hệ thống điện tử (Parra, 2006).

SVTH: NGÔ THỊ KIM HÀ

24


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

GVHD: THS. DƯƠNG NHẬT LINH