Tóm tắt
Tính cấp thiết: Ngộ độc thực phẩm đã trở thành 1 trong những vấn đề cấp thiết cần
được giải quyết để bảo vệ sức khỏe con người, việc dùng chất bảo quản thực phẩm
hóa học đang bị hạn chế sử dụng vì những tác dụng phụ không có lợi của nó. Hiện
nay, đã có nhiều nghiên cứu chứng minh rằng nhóm vi khuẩn lactic được phân lập
trong các loại thực phẩm lên men có khả năng sinh chất kháng khuẩn. Dạng chất
kháng khuẩn này có khả năng chống lại sự phát triển của mầm bệnh và được ứng
dụng như chất bảo quản thực phẩm.
Mục tiêu nghiên cứu: Phân lập 1-2 chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh chất
kháng khuẩn trong các thực phẩm len men và men tiêu hóa đông khô.
Nội dung nghiên cứu: Phân lập các chủng vi khuẩn lactic từ các sản phẩm kiệu muối
chua, cơm mẻ, lạp xưởng tươi, antibio, khảo sát đặc điểm hình thái, kiểm tra sinh hóa
các chủng phân lập được, cuối cùng khảo sát khả năng sinh chất kháng khuẩn của
các chủng phân lập được.
Phương pháp: Kiểm tra khả năng sản sinh các chất kháng khuẩn từ các dòng phân lập
bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch kết hợp với vi khuẩn chỉ thị
Escherichia coli.
Quá trình khảo sát được tiến hành trên 2 thí nghiệm:
- Thí nghiệm 1: Phân lập vi khuẩn lactic từ sản phẩm cơm mẻ, lạp xưởng tươi, kiệu
muối chua và antibio đồng thời thực hiện một vài kiểm tra nhận diện vi khuẩn lactic.
- Thí nghiệm 2: Khảo sát và chọn lọc các chủng vi khuẩn lactic sinh chất kháng
khuẩn.
Kết quả: Phân lập được 11 chủng vi khuẩn lactic và kiểm tra tính kháng khuẩn, trong
đó 5 chủng có khả năng tổng hợp chất kháng khuẩn: CM1, LX1, LX2, A1 và A2
nhưng tính kháng khuẩn của chúng khá yếu. Vì vậy, các chủng vi khuẩn lactic trong
các mẫu phân lập được sinh kháng khuẩn yếu.

iii


Lời cam kết

2.1. Giới thiệu về cơm mẻ, kiệu muối chua, lạp xưởng tươi và antibio ............................. 3
2.1.1. Cơm mẻ .................................................................................................................... 3
2.1.2. Kiệu muối chua ........................................................................................................ 3
2.1.3. Lạp xưởng tươi ......................................................................................................... 5
2.1.4. Antibio ..................................................................................................................... 5
2.2. Vi khuẩn lactic ............................................................................................................ 6
2.2.1. Đặc điểm chung........................................................................................................ 6
2.2.2. Sự phân bố................................................................................................................ 7
2.2.3. Phân loại vi khuẩn lactic .......................................................................................... 7
2.2.4. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic .................................................................. 9
2.2.5. Những ứng dụng của vi khuẩn lactic ..................................................................... 10
2.3. Quá trình lên men lactic ............................................................................................ 12
2.4. Sơ lược về vi khuẩn chủng chỉ thị Escherichia coli (E.coli) .................................... 13
2.4.1. Phân loại khoa học (Castellani & Chalmers, 1919) ............................................... 13
2.4.2. Đặc điểm cơ bản của Escherichia coli (Nguyễn Lân Dũng, 2008)........................ 13
v


2.5. Chất kháng khuẩn ...................................................................................................... 15
2.5.1. Tính kháng khuẩn của vi khuẩn lactic ................................................................... 15
2.5.2. Sơ lược về bacteriocin ............................................................................................ 15
2.5.2.1. Giới thiệu chung .................................................................................................. 15
2.5.2.2. Phân loại .............................................................................................................. 16
2.5.2.3. Cơ chế tác động ................................................................................................... 17
2.5.3. Lợi ích và hạn chế của bacteriocin ......................................................................... 18
2.6. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn lactic trong và ngoài nước....................................... 19
2.6.1. Trong nước ............................................................................................................. 19
2.6.2. Ngoài nước ............................................................................................................. 20
Chƣơng 3 Phƣơng pháp nghiên cứu............................................................................. 21
3.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................................. 21

5.2. Kiến nghị ................................................................................................................... 44
Tài liệu tham khảo ............................................................................................................ 45

vii


Danh sách hình
Nội dung

Trang

Hình 1: Cơm mẻ ........................................................................................................... 3
Hình 2: Kiệu muối chua ............................................................................................... 4
Hình 3: Lạp xưởng tươi ................................................................................................ 5
Hình 4: Antibio ............................................................................................................ 6
Hình 6: Vi khuẩn lactic hình que ................................................................................. 6
Hình 5: Vi khuẩn lactic hình cầu ................................................................................. 6
Hình 7: Vi khuẩn E.coli ............................................................................................. 14
Hình 8: Khuẩn lạc vi khuẩn E.coli ............................................................................. 14
Hình 9: Vi khuẩn E.coli chụp dưới kính hiển vi 100X ............................................. 14
Hình 10: Mô tả vòng kháng khuẩn trên đĩa petri ....................................................... 29
Hình 11: Hình thái khuẩn lạc trên mẫu Antibio: A1 .................................................. 33
Hình 12: Hình thái khuẩn lạc trên mẫu cơm mẻ: CM2 .............................................. 33
Hình 13: Hình thái khuẩn lạc trên mẫu Kiệu: K1 ...................................................... 34
Hình 14: Hình thái khuẩn lạc trên mẫu Lạp xưởng tươi: LX1 ................................... 34
Hình 15: Hình thái tế bào vi khuẩn của chủng A1 ..................................................... 36
Hình 16: Hình thái tế bào vi khuẩn của chủng CM2.................................................. 36
Hình 17: Hình thái tế bào vi khuẩn của dòng K1 ....................................................... 37
Hình 18: Hình thái tế bào vi khuẩn của dòng LX1 .................................................... 37
Hình 19: Kết quả kiểm tra sinh hóa của chủng A1 .................................................... 38


Trang

Sơ đồ 1: các bước phân lập vi khuẩn lactic từ kiệu muối chua .................................. 23
Sơ đồ 2: phân lập vi khuẩn lactic từ cơm mẻ, lạp xưởng tươi, antibio ...................... 25
Sơ đồ 3: quy trình nhuộm gram ................................................................................. 26
Sơ đồ 4: kiểm tra khả năng sinh chất kháng khuẩn .................................................... 30

x


Danh sách chữ viết tắt
A: Antibio
CM: Cơm mẻ
K: Kiệu
LAB: Vi khuẩn Lactic
LX: Lạp xưởng

xi


Chƣơng 1
Giới thiệu
1.1. Đặt vấn đề
Ngày nay, ngộ độc thực phẩm đã trở thành một trong những vấn đề cấp thiết cần
được giải quyết để bảo vệ sức khỏe con người. Bên cạnh đó, việc dùng chất bảo quản
thực phẩm hóa học đang bị hạn chế sử dụng vì những tác dụng phụ không có lợi của
nó. Theo thống kê của Bộ Y tế, hàng năm có khoảng 200 – 600 trường hợp ngộ độc
thực phẩm, trong đó chiếm 50% là ngộ độc do vi sinh vật (Lương Đức Phẩm, 2005).
Ở nước ta, các sản phẩm lên men truyền thống đã có từ rất lâu đời và được ứng dụng

1


Đề tài “Phân lập vi khuẩn lactic trên rau quả muối chua, cơm mẻ, lạp xưởng tươi và
antibio có khả năng sinh chất kháng khuẩn” được thực hiện. Nhằm làm tiền đề cho
việc nghiên cứu dòng vi khuẩn lactic có khả năng kháng khuẩn cao để ứng dụng
trong sản xuất và bảo quản thực phẩm lên men.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu
Phân lập được 1 - 2 chủng vi khuẩn có khả năng sinh chất kháng khuẩn trong các sản
phẩm kiệu muối chua, cơm mẻ, lạp xưởng tươi, antibio và khảo sát khả năng kháng
khuẩn của chúng.
1.3. Nội dung nghiên cứu
Phân lập các chủng vi khuẩn lactic từ các sản phẩm kiệu muối chua, cơm mẻ, lạp
xưởng tươi, antibio và khảo sát đặc điểm hình thái, kiểm tra sinh hóa các chủng
phân lập được.
Khảo sát khả năng sinh chất kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn lactic phân lập
được.

2


Chƣơng 2
Lƣợc khảo tài liệu
2.1. Giới thiệu về cơm mẻ, kiệu muối chua, lạp xƣởng tƣơi và antibio
2.1.1. Cơm mẻ
Lên men cơm mẻ chủ yếu là lên men vi khuẩn lactic có nhiều chủng loại vi khuẩn
lactic tham gia theo kiểu đồng hình hay dị hình. Hệ vi sinh vật trong cơm mẻ truyền
thống gồm: tuyến trùng, nẩm men và vi khuẩn lactic. Vi khuẩn lactic lên men chua
(sản sinh acid lactic) từ tinh bột chín (Nguyễn Văn Bá, 2008).
C6H12O6

động, pH 5 – 5,5: vi khuẩn đường ruột phát triển, pH 2,5 – 3: nấm men dại hoạt
động, pH 1,2 – 3: nấm mốc phát triển).
Giai đoạn 3: Khi kiệu đã chua, pH giảm xuống đến 3, thì ngay cả vi khuẩn lactic
cũng bị ức chế, nếu cứ để tự nhiên như vậy thì các nấm men dại, nấm mốc sẽ bắt đầu
phát triển phân giải axit lactic thành CO2 và H2O, pH tăng lên, sản phẩm bắt đầu có
váng (váng dưa, váng cá) và môi trường giảm chua, có mùi mốc, có nhiều bọt khí
(nấm men dại thường có là Geotrichumcandidum).
Khi muối kiệu lên men lactic ra sẽ có thành phẩm đạt yêu cầu:
- Tạo được sinh khối vi khuẩn có ích, át các sinh vật gây thối.
- Gây chua, tạo hương vị thơm ngon cho sản phẩm.
- Chuyển kiệu về dạng “chín sinh học” do đó mà hiệu suất tiêu hóa tăng. Nếu muốn
giữ sản phẩm không cho “quá lactic” thì có thể giữ ở nhiệt độ thấp (20C-40C) đồng
thời bổ sung chất diệt nấm như bensozt natri 1%, dịch chiết tỏi, gừng, giềng... Cần
nói thêm rằng vi khuẩn lactic không phá vỡ tế bào thực vật, nên kiệu muối chua vẫn
có hình dạng gần như không thay đổi.

Hình 2: Kiệu muối chua (Trịnh Huyền Na, 2014)

4


2.1.3. Lạp xƣởng tƣơi
Lạp xưởng tươi là sản phẩm thịt lên men phổ biến của một số tỉnh miền Tây: Tiền
Giang, Sóc Trăng… với sự phối trộn hài hòa giữa thịt, mỡ, một số phụ gia và sự lên
men lactic của hệ vi sinh vật làm cho lạp xưởng chua có kết cấu, hương vị và màu
sắc đặc trưng. Vì hàm lượng nước trong sản phẩm còn cao (khoảng 45%) nên sản
phẩm có cấu trúc mềm hơn lạp xưởng khô và để tránh hư hỏng phải bảo quản sản
phẩm ở nhiệt độ lạnh.

Hình 3: Lạp xƣởng tƣơi (Nguyễn Hòa, 2008)

Hình 5: Vi khuẩn lactic hình cầu
(Hoàng Văn Vinh, 2006)

Hình 6: Vi khuẩn lactic hình que
(Hoàng Văn Vinh, 2006)

6


2.2.2. Sự phân bố
Ít gặp trong đất và nước, thường phát triển trong những môi trường có chứa nhiều
chất hữu cơ phức tạp như:
- Trong sữa và các sản phẩm từ sữa thường gặp Lactobacillus lactic, Lactobacillus
bulgarius, Lactobacillus helviticus, Lactobacillus casei, Lactobacillus ferment,
Lactobacillus brevis, Streptococcus diacetyllactis. Để tồn tại trong môi trường sữa vi
khuẩn lactic tổng hợp ATP từ cơ chất lactose.
- Trên bề mặt thực vật và xác thực vật đang bị phân giải hay có Lactobcillus
plantanium, Lactobcillus delnikii, Lactobcillus ferment, Lactobacillus brevis,
Streptococcus lactis... Chúng còn được tìm thấy trên các loại rau quả, trái cây.
- Trong ruột và các niêm dịch ở người và động vật có Lactobacillus acidophilus,
Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus salivanius, Streptococcus
pyogenes, Bifidobacterrium, Pneumococcus.
2.2.3. Phân loại vi khuẩn lactic
Dựa vào quá trình lên men đường: có 2 loại
- Vi khuẩn lactic đồng hình: Streptococus lactic, Streptococcus cremoris,… Vi
khuẩn lên men lactic đồng hình sản sinh 85%- 95% acid lactic. Do thiếu porphyrin
và cytochrom, không có chuỗi vận chuyển electron nên chúng thu năng lượng bằng
con đường lên men bắt buộc. Trong tế bào vi khuẩn có chứa enzymealdolase và
triosophotphatizomerase.
- Vi khuẩn lactic dị hình: Vi khuẩn lên men lactic dị hình sản sinh 50% acid

Lactat

DL và L(+)

Lactobacillus

Đồng hình

Lactat

Thermobacterium

Đồng hình

Lactat

D(-), L(+), DL

Streptobacterium

Dị hình

Lactat : axetat

D(-), L(+), DL

(tùy tiện)

1:1


chuỗi ngắn.
- Giống Leuconostoc có hình dạng hơi dài hoặc hình ovan, đường kính từ 0,5 m 0,8 m và chiều dài khoảng 1,6 m. Trong một số điều kiện chúng cũng có dạng hơi
tròn, chiều dài khoảng 1-3 m. Sau khi phân chia chúng thường sắp xếp thành chuỗi,
không tạo thành đám tập trung.
- Giống Lactobacillus có dạng hình que. Tùy vào điều kiện của môi trường sống mà
hình dạng của chúng thay đổi từ hình que ngắn đến dài. Sắp xếp thành chuỗi hay
đứng riêng lẻ.
- Giống Pediococcus là những tứ cầu khuẩn hoặc song cầu khuẩn. Có hoạt tính thủy
phân protein rất yếu.
- Giống Bifidobacterium là những trực khuẩn, khi mới phân lập có thể phân nhánh
dạng chữ Y, V và tập hợp thành khối. Sau nhiều lần cấy truyền chúng trở thành dạng
trực khuẩn thẳng hoặc hơi cong.
Dựa vào tính mẫn cảm với oxi: có 3 nhóm
8


-Vi khuẩn lactic kỵ khí nghiêm ngặt
- Vi khuẩn lactic yếm khí tùy tiện: Pediococcus cerevisiae
- Vi khuẩn lactic vi hiếu khí (hiếu khí tùy tiện)
Dựa vào nhiệt độ phát triển tối ưu: Các vi khuẩn ưa ấm có nhiệt độ tối thích từ 250C
– 370C, các loài ưa nhiệt có nhiệt độ tối thích từ 500C – 650C, nhóm ưa lạnh phát
triển ở nhiệt độ 50C hoặc thấp hơn (Nguyễn Thị Minh Uyên, 2008)
- Vi khuẩn lactic ưa ấm: Streptococus lactic, Lactobacillus casei, L. plantarum,…
- Vi khuẩn lactic ưa nhiệt: Streptococus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus, L.
helvetcus,…
2.2.4. Nhu cầu dinh dƣỡng của vi khuẩn lactic
Các loại vi khuẩn lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau. Chúng
không chỉ có nhu cầu về các nguồn cơ chất chứa các nguyên tố cơ bản như cacbon,
nitơ, photphat và lưu huỳnh mà còn có nhu cầu về một số chất cần thiết khác như
vitamin, muối vô cơ… (Lê Văn Việt Mẫn, 2004).

các chủng vi khuẩn lactic.
- Tương tự như hai acid hữu cơ trên, acid acetic cũng có những tác động quan trọng
đến sự sinh trưởng của tế bào. Nên người ta thường sử dụng acid acetic dưới dạng
các muối acetat để làm chất đệm cho môi trường khi nuôi cấy vi khuẩn lactic.
Nhu cầu muối vô cơ khác:
Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic rất cần các muối vô
cơ. Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt, natri, kali, phospho, lưu
huỳnh, magie đặc biệt là mangan, vì mangan giúp ngăn ngừa quá trình tự phân và ổn
định cấu trúc tế bào.
2.2.5. Những ứng dụng của vi khuẩn lactic
Nhờ khả năng tạo ra acid lactic từ các nguồn cacbon hydrat khác nhau mà các chủng
vi khuẩn lactic đã được ứng dụng trong nhiều ngành sản xuất và chế biến (Lê Văn
Việt Mẫn, 2004).
 Những ứng dụng trong công nghệ thực phẩm:
Trong công nghệ thực phẩm, việc sử dụng quá trình lên men lactic không chỉ nhằm
mục đích bảo quản mà còn nhằm đưa ra thị trường các loại thực phẩm có tính chất và
hương vị mong muốn. Các ứng dụng chủ yếu gồm:
- Chế biến các sản phẩm sữa:
+ Ngoài khả năng lên men làm cho sữa không bị hỏng, các chủng vi khuẩn lactic còn
có nhiều khả năng đặc biệt khác. Nhờ đó mà người ta đã sản xuất hàng loạt các sản
phẩm từ nguồn nguyên liệu sữa ban đầu.
+ Như lợi dụng khả năng làm đông tụ sữa của vi khuẩn Streptococcus lactic để sản
xuất sữa chua hay khả năng tạo ra các mùi vị, tạo các chất thơm của chủng
Leuconostoc để sản xuất bơ, phomat…
- Sản xuất bánh mì đen:
+ Đây là loại bánh mì có chất lượng cao bên cạnh quá trình lên men bởi nấm men tạo
rượu etylic và CO2.
+ Người ta còn sử dụng quá trình lên men của vi khuẩn lactic để tạo vị chua và
hương thơm đặc trưng cho sản phẩm.
- Ủ thức ăn gia súc:

lactic, hạn chế dị ứng do cơ thể không dung nạp được lactose.
- Hơn thế nữa, vi khuẩn lactic còn có tác dụng giảm cholesterol, kháng các tác nhân
gây ung thư. Vài chủng vi khuẩn sinh ra những enzyme có khả năng chuyển những
chất tiền sinh ung thư, những tác nhân sinh ung thư như glucosidase, azoreductase
thành bệnh ung thư.Vi khuẩn lactic có khả năng ức chế sự phát triển các tế bào ung
thư, ức chế hoạt động của các vi khuẩn sinh ra enzyme và phân huỷ nitrosamine.
- Một số vi khuẩn lactic có khả năng bảo vệ chống lại sự phân hủy và đột biến DNA
in vitro và in vivo.
 Một số ứng dụng khác:
- Ứng dụng trong ngành công nghệ vật liệu

11


- Ứng dụng trong ngành mỹ phẩm
Ngoài những mặt có lợi được ứng dụng và phát huy, vi khuẩn lactic còn gây ra
những tác hại. Gây ra hiện tượng vẫn đục và bị chua trong công nghệ sản xuất bia,
nước ngọt, rượu vang, làm ảnh hưởng xấu đến chất lượng của sản phẩm. Do đó
chúng ta cần phải có biện pháp phòng và chống lại những ảnh hưởng xấu đó (Lê Văn
Việt Mẫn, 2004).
2.3. Quá trình lên men lactic
Lên men lactic là quá trình thu năng lượng nhờ vi khuẩn lactic, bao gồm sự biến đổi
một phân tử đường thành 2 phân tử axit lactic và năng lượng tách ra (Lương Đức
Phẩm et al., 2009):
C6H12O6

CH3HONCOOH + 0,075x106J

Lượng sản phẩm tạo thành hoàn toàn phụ thuộc vào giống vi sinh vật, vào môi
trường dinh dưỡng và điều kiện ngoại cảnh, nói chung thì acid lactic thường chiếm


2.4. Sơ lƣợc về vi khuẩn chủng chỉ thị Escherichia coli (E.coli)
2.4.1. Phân loại khoa học (Castellani & Chalmers, 1919)
Vực (domain): Bacteria
Ngành (phylum): Proteobacteria
Lớp (class): Gamma Proteobacteria
Bộ (ordo): Enterobacteriales
Họ (familia): Enterobacteriaceae
Chi (genus): Escherichia
Loài (species): E. coli
2.4.2. Đặc điểm cơ bản của Escherichia coli (Nguyễn Lân Dũng, 2008)
Kích thước: 2 – 3 m x 0,5 m
Khuẩn lạc tròn, màu trắng đục
- Đặc điểm nuôi cấy:
Sống hiếu khí và kị khí tùy tiện
Có thể phát triển ở nhiệt độ từ 50C – 400C, nhiệt độ tối ưu: 370C
pH thích hợp 7,0 – 7,2
Trên môi trường thạch dinh dưỡng NA tạo khóm tròn ướt (dạng S) màu trắng đục.
Trên môi trường Rapid‟ E.coli tạo khuẩn lạc màu tím.
Trên môi trường Macconkey, Endo, SS tạo khóm hồng đỏ.
Trên các môi trường đường.
- Các phản ứng sinh hóa: Indol dương, Methyl Red (phản ứng MR) dương tính,
Voges-Proskauer (phản ứng VP) âm tính và Citrat âm tính, H2S âm tính, hoàn
nguyên nitrat thành nitrit, Lysine decarboxylaza dương tính.
0

Đun 550C trong 1 giờ hoặc 60 C trong 30 phút sẽ bị tiêu diệt.
Dễ bị diệt bởi các thuốc sát trùng thông thường.

13

2.5.2. Sơ lƣợc về bacteriocin
2.5.2.1. Giới thiệu chung
Bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất là protein.
Loại vi khuẩn tạo ra loại bacteriocin nào thì có khả năng kháng lại chính bacteriocin
đó. Ngoài ra không gây ra phản ứng dị ứng trong cơ thể con người gây ra các vấn đề
về sức khỏe, nhưng bacteriocin bị ảnh hưởng bởi tác động của các enzyme như
trypsin, pepsin, α-chymotrypsin…
Những sản phẩm do vi khuẩn sinh ra có khả năng gây ức chế những vi khuẩn khác có
rất nhiều như enzyme, antibiotic, bacteriocin... Hiện nay người ta đã phát hiện ra
nhiều loại bacteriocin do vi khuẩn tổng hợp nên như nisin (Lactococcus lactis),
subtilin (Bacillus subtilis), pediocin (Pediococcus acidilactici)…
Người ta đã đưa ra nhiều tiêu chí để định nghĩa bacteriocin, những tiêu chí này được
dùng trong nhiều trường hợp, áp dụng với nhiều mức độ khác nhau để định nghĩa
những loại bacteriocin khác nhau. Những tiêu chí như sau:
- Phạm vi ức chế đối với những loại khác
- Sự có mặt của loại protein hoạt động
- Cách thức hoạt động có tính kháng khuẩn
- Loại tế bào mà nó tác dụng
15


- Những yếu tố di truyền
- Do quá trình tổng hợp sinh học có tính ức chế
Năm 1953, thương phẩm nisaplin xuất hiện trên thị trường như chất bảo quản thực
phẩm và đến năm 1969, tổ chức WHO công nhận nisin là chất bảo quản an toàn có
nguồn gốc sinh học. Trong công nghệ thực phẩm, nisin là bacteriocin được nghiên
cứu và ứng dụng rộng rãi nhất trong chế biến và bảo quản một số loại thực phẩm như
phomat, xúc xích, sữa chua, một số loại sản phẩm thịt, rau quả đóng hộp...Trong y
dược, bacteriocin còn được ứng dụng như một chế phẩm sinh học để điều trị một số
bệnh như viêm đường tiết niệu, hay nhiễm trùng đường tiêu hoá...