Header Page 1 of 128.

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
NGUYỄN THỊ QUY

NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT TÁCH CHIẾT SILUMARIN TỪ HẠT KẾ SỮA
VÀ AXIT AMIN TỪ ĐẬU TƯƠNG LÀM NGUYÊN LIỆU CHO THỰC
PHẨM CHỨC NĂNG TĂNG CƯỜNG CHỨC NĂNG GAN

Ngành: Sinh học

2015

Footer Page 1 of 128.


Header Page 2 of 128.

1

LỜI CẢM ƠN
Để có thể hoàn thành luận văn thạc sĩ một cách hoàn chỉnh, bên cạnh sự
nỗ lực cố gắng của bản thân còn có sự hƣớng dẫn nhiệt tình của quý Thầy Cô,
cũng nhƣ sự động viên ủng hộ của gia đình và bạn bè trong suốt thời gian học
tập nghiên cứu và thực hiện luận văn thạc sĩ.
Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Phạm Việt
Cƣờng- Phòng Công nghệ sinh học - Viện Hóa sinh Biển, ngƣời đã hết lòng
giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành luận văn này.
Đồng thời, tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn tớ
các anh chị em trong phòng Công nghệ sinh học - Viện Hóa sinh Biển đã tận


ủa flavonoid..................................................... 10

1.1.4. Tác dụng sinh học của

. ........................................................ 14

1.1.4.1. Sơ lƣợc về lịch sử sử dụng cây

làm thuốc. ............................. 14

1.1.4.

ủa silymarin và ứng dụng .................................... 15

1.1.5

...........................................18

1.1.6. Những thành tựu trong nghiên cứu chế phẩm silymarin ...................... 18
.............................................................. 20
1.2.1. Cây đậu tƣơng ....................................................................................... 20
............................................. 20
.................................................................................. 21
1.2.3.1. Thành phần Protein đậu tƣơng ........................................................... 21
1.2.3.2. Tính chất của Protein đậu tƣơng ........................................................ 21
ậu tƣơng .......................... 23
............................................... 26
2.1. Vật liệu ..................................................................................................... 26
2.1.1. Nguyên liệu ........................................................................................... 26


2.2.5

................................................................................. 30

2.2.5

................................................................... 30

2.2.5

.......................................................................... 31

2.2.6

..................................................................... 32

CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ ................................................................................ 33
................................................. 33
ết xuất silymarin ....................... 33
3.1.2. Kết

sắc kí HPLC ............................................................................ 37
ả

........... 39
ận axit amin tự

tƣơng................................................................................................................ 42
3.4. Một số đặc tính sinh học của chế phẩm chứa sylimarin .......................... 47

Alanine Aminotransaminase

AST

Aspartate Aminotransaminase

CCI4

Cacbon Tetrachlorid

EtOH

Ethanol

MeOH

Methanol

NaCl
cAMP

C

-

TFN-α

-

LD50

axit amin

............................. 39

3.4: ảnh hƣởng của thời gian thủy phân bột đậu tƣơng bằng protease lên
..................................................................................... 44
3 ................................. 44
3.6: Hàm lƣợng axit amin tự
3.7: Hàm lƣợng axit amin tự

ch thủ

........... 45
ủ

................................................................................................................... 46
Bảng 3.8: Liều uống chế phẩm silymarin trong các lô chuột thực nghiệm thử
độc tính cấp ..................................................................................................... 48
Bảng 3.9: Tác dụng của chế phẩm silymarin trên hoạt độ enzym ALT huyết
thanh chuột thực nghiệm ................................................................................. 51
Bảng 3.10: Tác dụng của chế phẩm silymarin trên bilirubin huyết thanh chuột
thực nghiệm. .................................................................................................... 52
Bảng 3.11: Lƣu lƣợng mật ở các lô chuột thí nghiệm .................................... 53
Bảng 3.12: Hàm lƣợng cắn khô trong dịch mật của chuột thực nghiệm ........ 54
Bảng 3.13: Hàm lƣợng bilirubin trong dịch mật của chuột thực nghiệm ....... 54

Footer Page 6 of 128.


Header Page 7 of 128.


. Do các

loại thuốc thảo dƣợc và sự kết hợp đông –tây y không những chữa đƣợc bệnh
mà ít có tác dụng phụ. Vì vậy, thuốc có nguồn gố

, đặc biệt là

những cây thuốc đã đƣợc dùng rộng rãi theo kinh nghiệm cổ truyền để chữa
bệnh đƣợc các nhà khoa học trên thế giới và Việt Nam quan tâm nghiên cứu.
ọ
cơ thể con ngƣờ

làm cho gan bị xơ, và
g
t

viêm gan siêu vi

là một trong những bệnh truyền nhiễm phổ

biến nhất trên thế giới, ảnh hƣởng đến sức khỏe cộng đồng trong thập niên
này. Hiện có 6 loại virus gây viêm gan : A, B, C, D, E và G, trong đó phổ biến
và nguy hiểm nhất là siêu vi B và C. Khoảng 2 tỷ ngƣời trên thế giới đã hoặc
đang nhiễm virus viêm gan B

. Có khoảng 3% dân số thế giới
nhiễm virus viêm gan C và trên 170 triệu ngƣời

n

“

axit amin
.”

1. Nghiên cứu quy trình tách chiết Sylimarin từ hạt kế sữa.
2. Nghiên cứu quy trình thuỷ phân thu nhậ


.





Footer Page 9 of 128.

.
.
.


Header Page 10 of 128.

9

CHƢƠNG 1
1.1.
1.1.1
(Sylibum marianum (L.) Gaernt)

.

Dịch chiết của hạt cây chứa khoảng 70-80% silymarin flavonolignans và
khoảng 20-30% thành phần không xác định, chủ yếu là các hợp chất
polyphenol oxy hóa và trùng hợp. Thành phần chính của tổ hợp silymarin là
silybin, đồng nghĩa với silybinin. Ngoài silybin là hỗn hợp của 2
diastereomers A và B với tỉ lệ khoảng 1:1, một lƣợng lớn các flavonolygnants

Footer Page 10 of 128.


Header Page 11 of 128.

10

khác có trong silymarin, đó là iosilybin, dehydrosilybin, silychristin,
silydanin, và một số flavonoids, chủ yếu là taxifolin (hình 1.1) [28].
Những tài liệu dƣợc lý, y học và quang hóa, tranh luận rất nhiều về hiệu
của silymarin/silybin. Nguyên nhân chính của sự không thống nhất và
không chắc chắn về hiệu

của silymarin/silybin là thành phần khác nhau

của chế phẩm silymarin đƣợc sử dụng trong phần lớn nghiên cứu. Các dẫn
chứng tài liệu cho thấy tỉ lệ của từng chất trong các loại silymarin khác nhau
phụ thuộc rất lớn vào nguồn S.marianum (giống cây và điều kiện trồng) và
quá trình tách chiết, xử lý. Gần đây, silymarin/silybin nhận đƣợc sự quan tâm
do các hoạt tính có lợi của nó không liên quan trực tiếp đến hiệu

bảo vệ

không tan trong ether và chloroform. Flavonoid có hƣơng thơm và vị đắng.
Có khả năng hấp thụ tia tử ngoại nhờ hai vòng benzen A và B. Có hai dải hấp
thụ cực đại: Dải I ở bƣớc sóng 320-380nm, dải II ở bƣớc sóng 220-280nm.
 Tính chất hóa học
Do đặc điểm cấu tạo của flavonoid có các nhóm hydroxyl phenolic,
nhóm carbonyl, vòng thơm benzen nên chúng có khả năng phản ứng rất lớn.
Tính chất hóa học của flavonoid còn phụ thuộc vào vị trí nhóm OH, hệ nối
đôi liên hợp và các nhóm thế.
phản ứng hóa học đặc trƣng của flavonoid:
*Phản ứng của nhóm hydroxyl (OH)
Tính oxy hóa: Dƣới tác dụng của các chất oxy hóa ( nitrat bạc,
ferricyanit, persulfate, các gốc tự do…) hay enzym polyphenoloxydase
,flavonoid sẽ bị oxy hóa thành các gốc phenoxy ArO* (gốc tự do bền). Các
gốc này có thể dimer hóa hay phản ứng oxy hóa và các phản ứng làm bẻ gãy
vòng.

Footer Page 12 of 128.


Header Page 13 of 128.

12

Tính axit: Các flavonoid có tính acidyếu nên dễ dàng phản ứng với dung
dịch kiềm để tạo thành muối tan trong nƣớc khi đun nóng, cho màu vàng cam
hay đỏ thắm. Antoxyan trong dung dịch amoniac hay natri cacbonate cho màu
xanh hoặc tím.
Sự tạo thành liên kết hydro: Khi không có trở ngại gì về mặt cấu trúc
không gian liên kết hydro đƣợc hình thành giữa các nhóm OH trong cùng
phân tử hoặc giữa các phân tử với nhau.


tự do hình thành trong quá trình viêm nhiễm bệnh lý. Chúng có khả năng giải
tỏa các điện tử tự do trên mạch vòng của nhân thơm và hệ thống nối đôi liên
hợp, làm triệt tiêu các nguồn gốc tự do sinh ra trong quá trình viêm nhiễm, do
tính bền vững về mặ

a học nên chúng không tham gia vào dây chuyền

phản ứng oxy hóa [23].
Flavonoid còn có tác dụng bảo vệ cho adrenalin hoạt động một cách bình
thƣờng do chúng có khả năng tạo phức với Cu2+, có tác dụng là chất xúc tác
cho phản ứng oxy hóa adrenalin, leucholamin [23].
Flavonoid ảnh hƣởng đến hệ thống nội tiết, làm tăng sức đề kháng của
cơ thể đối với tác dụng gây độc bất kể loại nào, tăng chức năng thải độc của
gan, tăng trao đổi glucose, tăng tổng hợp glucogene, ảnh hƣởng đến quá trình
tổng hợp prothrombin của gan [25].
Các chất thuộc nhóm flavonoid có tác dụng làm giảm sức thấm của mạch
mao nhƣ sinh tố P, một trong những chất quan trọng đó là rutin. Rutin có tác
dụng chữa các bệnh xuất huyết mao

n, làm cho thành mạch đƣợc bền

vững, chữa cao huyết áp tăng, cƣờng công hiệu vitamin khỏi bị oxy hóa. Nó
còn ảnh hƣởng tốt đến chuyển hóa canxi và còn chống đƣợc tia phóng xạ.
Về mặt dƣợc lý, các bioflavonoid có tác dụng chống viêm, giãn cơ trơn,
chống dị ứng, ức chế sự phát triển của ung thƣ, làm giảm các tổn thƣơng xuất
huyết nhỏ trong bệnh đái đƣờng.
Về mặt miễn dịch học, nhiều bioflavonoid có tác dụng kích thích lympho
bào, sản xuất interferol, ức chế hiện tƣợng thoát bọng chứa các amin hoạt
mạch từ tế bào mastocyte, ức chế sụ nhân lên của virus.

23-79 sau CN) ghi lại rằng, nƣớc ép cây

trộn với mật ong làm thuốc lợi

mật rất tốt. Đây có thể là ghi nhận đầu tiên về tác dụng của cây

liên

quan đến gan [20].
Nhiều thế kỷ sau,

đã trở thành một cây thuốc quen thuộc ở Đức

và đã đƣợc nhắc đến trong một bản thảo tiếng Đức cổ “Physica” của
Hildegarde viết năm 1150 và đƣợc xuất bản vào năm 1533. Tác giả đã viết về
công dụng của rễ, toàn cây và lá

. Một số tác giả khác nhƣ Otto

Brunfels (1534), Hieronimus Bock (1595), Jacobus Theodorus (1664) và
Adam Lonicerus (1679) đã giới thiệu dùng

để trị bệnh về gan [24] .

Vào cuối thế kỷ XVIII, Culpepper (1787) cho rằng

là thứ thuốc

tuyệt vời làm thông tắc gan, lách và vì vậy dùng rất tốt để chữa bệnh vàng da.
Giữa những năm 1772 đến 1850, một chế phẩm có tên gọi là “Cồn thuốc của


đó là trên khắp thế giới. Vào những năm 1990, doanh số bán chế phẩm này ở
Đức lên tới trên 180 triệu đôla/năm. 31% số bệnh nhân mắc bệnh về gan ở
Mỹ đã dùng dƣợc thảo mà chủ yếu là dùng
1.1.4.2.
Hạt củ

[20] .

của silymarin và ứng dụng
(Sylibum marianum (L.) Gaernt.) đã đƣợc sử dụng

hơn 2000 năm nay để chữa các bệnh rối loạn gan và túi mật nhƣ viêm gan, xơ
gan, vàng da và bảo vệ gan khỏi tác động có hại của hóa chất và các chất độc
ngoài môi trƣờng nhƣ nọc rắn, côn trùng, ngộ độc nấm hoặc rƣợu [43], [52].
 Hiệu

bảo vệ gan:
s
. Đã có những bằng chứng cho thấy silymarin có tác dụng

chữa bệnh xơ gan do rƣợu. Cơ chế của quá trình này do silymarin phục hồi
alanin transaminase, aspartate transaminase và bilirubin huyết thanh về mức
bình thƣờng, giảm γ-glutamyl transpeptidase, làm tăng đáng kể vận tốc biến
đổi của lymphhoccytes và giảm rõ ràng lƣợng tế bào CD8+. Có thể thấy cơ
chế này dựa trên hoạt tính điều biến miễn dịch của silymarin. Silymarin cũng
đƣợc dùng để chữa xơ gan do biến chứng tiểu đƣờng và viêm gan C mãn tính
cùng với các chất khác, gan nhiễm mỡ và đều cho kết

khả quan [18].

- Màng tế bào ổn định và trao đổi năng lƣợng thuận tiện: Sử dụng
silymarin làm giảm đáng kể chức năng dị thƣờng và quá trình xơ hóa.
- Đẩy mạnh hepatic cytothesis: Silymarin có thể kết hợp với estradiol
receptor và hoạt hóa nó trong tế bào gan và kết

là tăng hoạt tính của RNA

polymerase nội bào.
- Cytokine và chức năng miễn dịch: Hiệu

kháng viêm và kháng xơ

hóa là do silymarin hoạt hóa tế bào hình sao (stellate) của gan và ổn định tế
bào lớn (mast). Silymarin có thể làm giảm lƣợng và hoạt tính cytotoxic
lymphocytes và các tế bào natural killer trong máu, điều đó cho thấy
silymarin có chức năng điều biến miễn dịch.
 Chất bảo vệ và chống ung thư : Silymarin/silybin ức chế tác dụng gây
ung thƣ của nhiều loại hóa chất. Một số khối u phụ thuộc hormone steroid
cũng bị ức chế. Những kết

nhận đƣợc khi thử nghiệm với các dòng tế

bào ung thƣ tuyến tiền liệt, buồng trứng…cho rằng điều chỉnh xuống thụ thể
phát triển màng trong mạch (vascular endothelial growth recptor 4 – VEGR)
và điều chỉnh lên angiopoietin-2 là các cơ chế tiềm năng chịu trách nhiệm cho
hoạt tính của các chất này [28], [45], [58].

Footer Page 17 of 128.



chữa bệnh của

silymarin có thể giải thích bởi tác dụng sinh học khác nhau của chất này, đó là
ổn định màng tế bào, chống viêm và ức chế con đƣờng arachiddonic axit.
Hiệu

phòng bệnh của silymarin có lẽ do cơ chế gián tiếp làm giảm đáp

ứng đến histamine và kết

là đáp ứng quá mẫn tức thì [40].

 Bảo vệ da: Cả silymarin và silybin đều biểu hiện hi

bảo vệ

chống ung thƣ do ánh sáng gây ra trên mô hình chuột. Cơ chế bảo vệ da đƣợc
chứng minh do khả năng làm giảm và ức chế tác dụng có hại của tia UV mặt
trời nhƣ stress oxy hóa, viêm, đáp ứng miễn dịch và tổn thƣơng DNA cũng
nhƣ cảm ứng chƣơng trình tự chết của tế bào [40].

Footer Page 18 of 128.


Header Page 19 of 128.

18

 Tương tác với các thụ thể hormone steroid: Cả silymarin và silybin
đều biể

Footer Page 19 of 128.

[56].

-


Header Page 20 of 128.

19

cetat ethyl

t [61].
1.1.6. Những thành tựu trong nghiên cứu chế phẩm silymarin
Các chế phẩm chủ yếu của slymarin là viên nang, viên rắn, thể nhũ,
muối silymarin tiêm, hoặc phối trộn với một số tá dƣợc khác nhƣ PEG, PVP,
cyclodextrin…[18].
Thuốc viên: Nature,
Nature,s Bounty.

, N- Acetyl Cy
.
Viên nang:

: Viên

công ty US Trusted LLC.
, Inc
Bột: Hepatis B Xintai của

[13].

thô

yc
c [41].

2

Rhizobium c

[12], [13].

1.2.2
Trong

, lipid,

glucid,
, cellul

: Độ ẩm 8-10%,

Protein 35-45%, Lipid 15-20%, Hydratecarbon 15-16%, Cellulose 4-6%,
Vitamin A 710 UI, Vitamin B1 300 UI, Vitamin B2 90 UI, Vitamin C 11 UI,
Muối khoáng 4,6%. Hàm lƣợng axit amin không thay thế trong protein

Footer Page 21 of 128.



với các hệ số sa lắng S20,W là 2S, 7S, 11S, 15
tổng lƣợng protein của hạt.

glixinin

acid

chiếm trên 70%

40%
-

-

1% axit amin S [34].
Trong thực phẩm có PH trung tính và không gia nhiệt thì các globulin 7S
và 11S nói chung đều ở trạng thái hoạt động, không bị biến tính, phân tử ở
dạng dime (7S) và oligome (11S) vì lực ion yếu. Các xử lí nhiệt và thay đổ
.
1.2.3.2. Tính chất của Protein đậu tƣơng
 Sự phân li và sự tập hợp của protein đậu tƣơng

Footer Page 22 of 128.


Header Page 23 of 128.

22

Khi đun nóng dung dịch -conglixinin loãng ở pH=7-8 và lực ion yếu,

làm đông tụ protein thành từng cục tƣơng đối đàn hồi. Nếu đun nóng các cục
đã thu đƣợc bằng kết tủa đẳng điện hoặc bằng canxi sẽ làm các chuỗi
polypeptide bị giãn mạch và tạo nên một mạng lƣới protein ba chiều có kết
cấu của một gel thực thụ.

Footer Page 23 of 128.


Header Page 24 of 128.

23

 Một vài tính chất khác
Protein

cực kỳ bền nhiệt, có thể chịu nhiệt đến 77oC. Tuy

nhiên ở nhiệt độ đó protein không thể tan trở lại. Protein

có thể bền

nhiệt đến 100oC khi thêm vào các yếu tố làm tăng lực ion.
Trong phần lớn các ứng dụng của

, việc gia nhiệt thấp để vô

hoạt các enzym là cần thiết.Tuy nhiên trong một vài ứng dụng, khi protein
gia nhiệt ở nhiệt độ thấ
lipoxygenase hoạt động


cùng một lƣợng axit amin đƣợc sử dụng trong chế độ dinh dƣỡng của bênh
nhân sau mổ hoặc cho ngƣời có tuổ

cũng đƣợc sử dụng

trong dinh dƣỡng thể thao và kiểm soát trọng lƣợng, trong chế độ ăn uống đặc
biệt đối với các bệnh nhân mắc một số bệnh nhƣ pancreatitis, short bowel
syndrome, bệnh Crohn’s và dị ứng thực phẩm. Hoạt tính chống oxy hóa của
protein đậu tƣơng đã đƣợc báo cáo [33]. Những báo cáo cũng cho thấy hàm
lƣợng các axit amin quan trọng trong protein đậu tƣơng đáp ứng yêu cầu dinh
dƣỡng của ngƣời trừ lysine và methionine [27]. Thủy phân protein đậu tƣơng

Footer Page 24 of 128.


Header Page 25 of 128.

24

các phƣơng pháp khác nhau đã nhận đƣợc nhiều peptides hoạt tính sinh
học với các đặc tính chống tăng huyết áp, chống tăng cholesterol, chống béo
phì, chống oxy hóa, chống khối u, điều biến miễn dịch và đối kháng vi sinh
vật [22], [32], [36], [59], [60]. Wang và cs. (2008) đã xác định đƣợc 3
peptides trong protein hydrolysate đậu tƣơng có hoạt tính ức chế
topoisomerase II [57]. Các peptides chống tăng huyết áp và ức chế enzyme
angiotesin – converting (ACE). Enzyme này làm tăng huyết áp bằng cách
biến đổi decapeptide angiotensin I thành octapeptide angiotensin II làm co
mạch, dẫn đến huyết áp tăng. Rất nhiều tài liệu chỉ ra rằng, protein đậu tƣơng
có thể làm giảm nồng độ cholesterol máu ở ngƣời và động vật, nhƣng cơ chế
này đƣợc các tác giả đƣa ra không thống nhất. Một số nhà nghiên cứu cho