BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ
HOẠT TÍNH CỦA SOPHOROLIPIDS QUA QUÁ
TRÌNH LÊN MEN CHỦNG Candida bombicola

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀNG DŨNG
Sinh viên thực hiện
MSSV: 1151110044

: HUỲNH THỊ DIỄM TRINH
Lớp: 11DSH01

TP. Hồ Chí Minh, 2015


LỜI CAM ĐOAN
Người thực hiện đề tài: Huỳnh Thị Diễm Trinh
Sinh viên trường: Đại học Công nghệ Tp. Hồ Chí Minh
Khoa: Công nghệ Sinh học - Thực phẩm - Môi Trường
Ngành: Công nghệ Sinh học
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Văn Tâm đã luôn bên cạnh giúp đỡ, chia sẻ kiến thức, kinh nghiệm cũng như những
niềm vui nỗi buồn cùng tôi. Tất cả các anh chị, các bạn đang nghiên cứu ở phòng Vi
sinh ứng dụng, Viện Sinh học nhiệt đới đã nhiệt tình giúp đỡ và chỉ dạy cho tôi nhiều
điều trong suốt quá nghiên cứu.
Tập thể lớp 11DSH01, trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, đã sát
cánh bên tôi trong suốt những năm tháng trên giảng đường đại học.
Cuối cùng, con xin chân thành cảm ơn Ba, Mẹ và các em trong gia đình đã chăm
sóc, lo lắng và luôn dõi theo từng bước con đi. Sẵn sàng bên cạnh động viên và khích
lệ những lúc con khó khăn nhất, để con có thể vững tin và bước tiếp trên con đường đã
chọn.
Huỳnh Thị Diễm Trinh


MỤC LỤC
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT........................................................................................iv
DANH

MỤC

BẢNG

.......................................................................................................v DANH MỤC HÌNH
.......................................................................................................vi

MỞ

ĐẦU

.........................................................................................................................1
1. Tính cấp thiết của đề tài .............................................................................................1

2.2. Vật liệu nghiên cứu ...............................................................................................20
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu ......................................................................................20
2.2.2. Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu ........................................................................20
2.2.3. Hóa chất ...........................................................................................................21
2.3. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................................22
2.3.1. Tăng sinh và bảo quản chủng C.bombicola ATCC 22214 ..............................23
2.3.2. Nuôi cấy và thu nhận Sophorolipids từ chủng C.bombicola ATCC 22214 ....23
2.3.3. Định tính SLs thu được bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (TLC) ......................25
2.3.4. Xác định thành phần SLs thu được bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao
(HPLC)............................................................................................................26
2.3.5. Khảo sát một số hoạt tính của SLs thu được ..................................................27
2.3.5.1. Khả năng nhũ hóa .....................................................................................27
2.3.5.2. Khả năng kháng oxy hóa ..........................................................................28
2.3.5.3. Khả năng kháng khuẩn .............................................................................29
2.4. Phương pháp xử lý số liệu ....................................................................................31
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..............................................................32
3.1. Kết quả thu nhận sophorolipids từ nguồn dầu thải và glucose .............................32
3.2. Kết quả ảnh hưởng của thời gian nuôi lên quá trình thu nhận Sophorolipids ......32
3.3. Kết quả định tính SLs thu được bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (TLC)...............33
3.4. Kết quả khảo sát thành phần SLs thu được bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng
cao (HPLC)............................................................................................................35
ii


3.5. Kết quả khảo sát khả năng nhũ hóa của SLs thu được .........................................37
3.6. Kết quả khảo sát khả năng kháng oxy hóa của SLs thu được...............................37
3.7. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs thu được..................................38
3.7.1. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs thu được bằng phương pháp
khuếch tán trên đĩa thạch. ...............................................................................38
3.7.2. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs thu được bằng phương pháp

Dimethyl sulfoxide

DPPH

2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

HPLC

High performance liquid chromatography

IC

Inhibitory concentration

IC50

Inhibitory concentration 50%

OD

Optical density (mật độ quang học)

LB

Luria bertani

MIC

Minimum inhibitory concentration



DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Tế bào nấm men C.bombicola.........................................................................7
Hình 1.2. Cấu trúc của sophorolipid..............................................................................11
Hình 1.3. Quá trình sinh tổng hợp sophorolipids ..........................................................12
Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu ...........................................................................................22
Hình 2.2. Quy trình thu nhận sophorolipids ..................................................................24
Hình 2.3. Quy trình phân tích mẫu SLs trong sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) .......27
Hình 2.4. Cơ chế phản ứng DPPH.................................................................................28
Hình 3.1. Sophorolipids thu được .................................................................................32
Hình 3.2. Biểu đồ sản lượng SLs thu được ở những thời gian lên men lên men khác
nhau...............................................................................................................33
Hình 3.3. Sắc ký đồ mẫu SLs thu được .........................................................................34
Hình 3.4. Sắc ký đồ mẫu SLs thu được bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao........36
Hình 3.5. Sắc ký đồ mẫu SLs chuẩn 1′,4″-Sophorolactone 6′,6″-diacetate. .................36
Hình 3.6. Biểu đồ thể hiện khả năng bắt các gốc tự do DPPH của hỗn hợp SLs thu
được. .............................................................................................................38
Hình 3.7. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs thu được trên đĩa thạch ...39

6


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Chất hoạt động bề mặt (CHĐBM) đóng vai trò quan trọng trong cuộc sống hằng
ngày của con người. Chúng có mặt trong hầu hết các sản phẩm thiết yếu, trong mọi
ngành công nghiệp, góp phần phát triển và mang lại lợi nhuận vô cùng to lớn cho
ngành công nghiệp hóa chất. Chất hoạt động bề mặt là một trong những nhóm hóa chất
công nghiệp được sản xuất nhiều nhất hiện nay, với tổng sản lượng trên toàn thế giới
vượt quá 15 triệu tấn/năm và đang tăng dần theo thời gian. Chất hoạt động bề mặt được

chế biến dầu nành (SDO) và đạt sản lượng 90 g/l. Tương tự, Daverey và Pakshirajan
(2009) công bố rằng họ thu được lượng 63,7 g/l SLs thông qua lêm men C.bombicola
ATCC 22214.
Hiện nay tại Việt Nam, một số công trình đề cập đến việc phân lập, nghiên cứu
khả năng tạo CHĐBMSH của một số chủng vi khuẩn đã được công bố. Đa số các
chủng được phân lập từ môi trường nước mặn nhằm mục đích xử lý ô nhiễm dầu. Tuy
nhiên, những công trình liên quan đến việc sản xuất và ứng dụng SLs vẫn chưa được
nghiên cứu thấu đáo.
3. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu thu nhận sophorolipids qua quá trình lên men của chủng
C.bombicola ATCC 22214 từ nguồn dầu thải.
Khảo sát một số hoạt tính của sophorolipids.
4. Nhiệm vụ nghiên cứu
-

Lên men chủng C.bombicola ATCC 22214 trên môi trường chứa glucose và dầu
thải.

-

Thu nhận sophorolipids từ dịch lên men.

-

Định tính và xác định thành phần sophorolipids.

-

Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian lên men đến sản lượng sophorolipids



Khả năng chống oxy hóa của SLs cũng được xác định thông qua khả năng bắt
các gốc tự do DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl).

-

Khả năng nhũ hóa của SLs được xác định bằng phương pháp đo tỷ lệ hệ nhũ
tương được tạo thành so với hệ dung dịch ban đầu.

6. Các kết quả đạt được
Sản lượng SLs thu được sau quá trình lên men đạt 21,9 g/l. Thời gian lên men
thu nhận SLs từ chủng C.bombicola thích hợp nhất là 7 ngày.
Trong hỗn hợp SLs thu được có khoảng 10 cấu trúc SLs khác nhau. Bước đầu
xác định được sự hiện diện của 1′,4″-Sophorolactone 6′,6″-diacetate.
Khả năng kháng oxy hóa của SLs ở nồng độ 20 mg/ml là 84,32 % và IC50 cũng
được xác định 4,4531 mg/ml. Nồng độ ức chế tối thiểu đối với một số vi khuẩn cũng
được xác định S.aureus (1,25 mg/ml), P.aeruginosa (2,5 mg/ml), B.subtilis (0,6
mg/ml). Chỉ số nhũ hóa (E24) của SLs từ 39,39 – 65,45 % đối với các loại dầu hạt cải,
dầu nành và xăng.


7. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp
Kết cấu của đồ án tốt nghiệp gồm 4 chương:
Chương 1: Tổng quan
Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Chương 3: Kết quả và thảo luận
Chương 4: Kết luận và kiến nghị


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

[1].
1.1.3.

Sinh sản ở nấm men

Nấm men sinh sản bằng hai hình thức: vô tính và hữu tính.
Sinh sản vô tính bằng cách nảy chồi là hình thức sinh sản phổ biến và điển hình
của tế bào nấm men. Khi tế bào trưởng thành, nhân sẽ dài ra và bắt đầu thắt lại ở giữa.
Trên tế bào mẹ bắt đầu phát triển một chồi con, hoặc cùng một lúc tế bào mẹ có thể tạo
ra nhiều tế bào con ở nhiều hướng khác nhau (tùy theo giống, loài). Mỗi chồi con sẽ


nhận một phần chất nhân và chất nguyên sinh từ tế bào mẹ. Khi chồi con trưởng thành,
nó sẽ hình thành một vách ngăn để tách khỏi tế bào mẹ và sống độc lập. Có trường
hợp, tế bào con không tách khỏi tế bào mẹ mà tiếp tục nảy chồi tạo một tập hợp tế bào
nấm men có dạng xương rồng hay còn gọi là khuẩn ty giả. Ngoài ra, nấm men còn sinh
sản vô tính bằng hình thức phân cắt như ở vi khuẩn, chỉ thấy ở chi nấm men
Schizosaccharomyces và sinh sản bằng bào tử như: bào tử đốt ở chi Geotrichum, bào tử
bắn ở chi Sporobolomyces; bào tử áo ở nấm Candida albicans [1].
Sinh sản hữu tính ở nấm men là do sự tiếp hợp giữa hai tế bào nấm men với
nhau hình thành hợp tử. Hợp tử phân chia thành các bào tử túi nằm trong nang (túi),
nang chín sẽ vỡ bào tử được phát tán ra bên ngoài, gặp điều thuận lợi phát triển thành
một tế bào nấm men mới [1].
1.1.4.

Ứng dụng của nấm men

Nấm men đóng vai trò quan trọng trong đời sống con người, một số ứng dụng
của nấm men như:
Tế bào nấm men cũng như những sản phẩm mà chúng sản sinh ra giàu protein,

được phân lập từ mật của loài ong nghệ (bumble-bees) thuộc chi Bombus sp [47] .
Candida bombicola cùng với một số nấm men như Candida magnolia, Candida
apicola,

Candida

bororiensis,

Wickerhamiella domericqiae

và

Rhodotorula

bogoriensis được biết đến với khả năng sản xuất SLs – một glycolipid ngoại bào [12]
[19][20] [23][47] [48].

Hình 1.1. Tế bào nấm men C.bombicola
Nguồn: Kurtzman và Fell, (2001).


Tế bào nấm men Candida bombicola có dạng hình oval đến hình thon dài,
thường tồn tại riêng rẽ hoặc dính thành cặp, với kích thước tế bào là1,5 – 2,5 µm x 3 –
5 µm (Hình 1.1) [28].
0

Khi nuôi cấy đĩa trên môi trường bột bắp agar sau 7 ngày ở 25 C, tế bào nấm
men Candida bombicola không xuất hiện khuẩn ty giả hoặc tế bào bao gồm rất nhiều
các chuỗi ngắn phân nhánh dày đặc. Phát triển trong điều kiện hiếu khí thì khuẩn lạc có
màu kem đến màu xám tro, trơn, bóng, lồi và ria mép khuẩn lạc có dạng răng cưa [28].

Vi sinh vật sản xuất
Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas sp.
Candida bombicola

Glycolipids

Sophorolipids

Candida apicola
Candida petrophilum
Rhodococcus erythropolis

Trehalolipids

Mycobacterium tuberculosis
Arthrobacter sp.

Lipopeptides và

Surfactin

Bacillus subtilis

lipoproteins

Lichenysin

Bacillus licheniformis


Emulsan

Acinetobacter calcoaceticus RAG-1

(polymer)

Liposan

Candida lipolytica

Mannoprotein

Saccharomyces cerevisiae

CHĐBMSH

Vesicles và fimbriae

Acinetobacter calcoaceticus

dạng hạt

Whole cells

Nhiều loại vi khuẩn

Nguồn: Desai và Banat, (1997)
Các CHHBMSH thường tiết ra bên ngoài tế bào (extracellular) như các chất
glycolipid, axit béo, photpholipid, polysacarit lipid, lipopetic – lipoprotein, hay chính
bản thân bề mặt tế bào vi sinh vật. Ngoài đặc tính làm giảm sức căng bề mặt nó còn có

không phải là tác nhân gây bệnh, dễ dàng thu hồi sản phẩm, có năng suất và chuyển
hóa cơ chất cao [38].


1.2.2.2. Cấu trúc hóa học của SLs
Về cấu trúc hóa học, SLs gồm phần ưa nước là disaccharide sophoroses (2-O-βD-glucopyranosyl-D-glucopyranose) liên kết với gốc hydroxyl của carbon kế cuối hoặc
cuối trong chuỗi acid béo C16-C18 (phần kỵ nước) bằng liên kết β-glucosidic ở vị trí
C1’ (Hình 1.2) [25].
Trong phân tử SLs, nhóm carboxyl của chuỗi acid béo hoặc ở trạng thái tự do
(cấu trúc SLs dạng mở hay dạng acid) hoặc là phản ứng este hóa nội sinh với nhóm
hydroxyl ở vị trí C 4” của phần sophorose (cấu trúc SLs dạng vòng hay dạng lacton)
[41]. Đây là hai dạng cấu trúc chính trong thành phần cấu tạo của SLs. Các cấu trúc
này có sự khác biệt về mức độ acetyl hóa (ở vị trí 6’ và 6”) của phần sophorose và
thành phần acid béo (chiều dài chuỗi, mức độ bão hòa, vị trí của nhóm hydroxyl) phụ
thuộc vào chủng sản xuất, điều kiện sinh trưởng và nguồn carbon kỵ nước [29].
Các phân tử SLs có cấu trúc khác nhau sẽ dẫn đến một vài sự khác nhau trong
các đặc tính sinh học và hóa lý của chúng và có thể được ứng dụng chuyên biệt trong
các lĩnh vực khác nhau [29]. Các sophorolipid lacton có hiệu quả hơn trong việc làm
giảm sức căng bề mặt và khả năng kháng khuẩn tốt hơn, trong khi sophorolipid acidic
tạo bọt và hòa tan tốt hơn.

Hình 1.2. Cấu trúc của sophorolipid
Nguồn: Van Bogaert và cộng sự (2011)


1.2.2.3. Sinh tổng hợp SLs

Hình 1.3. Quá trình sinh tổng hợp sophorolipids
(1) lipase, (2) cytochrome P450 monooxygenase, (3) alcohol-dehydrogenase,(4)
aldehyde-dehydrogenase, (5) desaturase, (6) cytochrome P450 monooxygenase,

đen (SDO – phụ phẩm của ngành chế biến dầu nành), dầu bắp, dầu nành như là các
nguồn carbon, Kim và cộng sự (2005) đã xác định được giá trị CMC và sức căng bề


mặt tối thiểu trong dung dịch nước của SLs tương ứng là 150 mg/l và 48 mN/m; 82
mg/l và 41 mN/m; 88 mg/l và 40,5 mN/m. Tương tự, Otto và cộng sự (1999) cũng đã
báo cáo rằng 130 mg/l cho CMC và 39 m.N/m cho sức căng bề mặt tối thiểu của SLs
được sản xuất bởi nấm men sử dụng deproteinized whey và dầu hạt cải dầu như là các
nguồn carbon.
Bên cạnh khả năng làm giảm sức căng bề mặt thì khả năng nhũ hóa của SLs
cũng là một hoạt tính quan trọng giúp SLs ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau.
SLs được sản xuất bời nấm men C.bombicola là một chất nhũ hóa kém, không thể ổn
định nhũ tương có chứa nước và một trong hai chất hydrocarbon hoặc dầu thực vật
[13][36] Tuy nhiên, một nghiên cứu của Daverey và Pakshirajan (2009) chứng minh
được rằng SLs được sản xuất bời nấm men C.bombicola ATCC 22214 sử dụng mật rỉ
đường mía như nguồn carbon, đã thể hiện hoạt tính nhũ hóa tốt hơn và ổn định hơn
(Bảng 1.2). Trong một nghiên cứu của Ma và cộng sự (2012) về hoạt tính sinh học và
bề mặt của phân tử SLs được sản xuất bởi Wickerhamiella domercqiae đã cho thấy
rằng SLs có khả năng nhũ hóa mạnh mẽ đối với các cơ chất kỵ nước được chọn cụ thể
là paraffin lỏng, dầu hạt cải dầu và sự nhũ hóa trở nên yếu hơn đối với dầu thô. Hơn
nữa, các nhũ tương được tạo thành ổn định ngay cả khi để yên trong hơn 1 tuần.
Bảng 1.2. Khả năng nhũ hóa của SLs được sản xuất bởi C.bombicola với cơ chất kỵ
nước.
Non – aqueous phase liquids

Emulsification activity

Kerosene

1,584

nghiệt về nhiệt độ, pH và nồng độ muối. Kết quả nghiên cứu của Chandran và Das
(2011) đã cho thấy SLs hoạt động ổn định trong một phạm vi rộng của pH từ 2 – 10,
0

0

nhiệt độ từ 10 C – 100 C và ở nồng độ muối (NaCl) cao 8 – 10%.
1.2.2.5. Ứng dụng của SLs
SLs cho thấy có nhiều khả năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Hiện
nay, việc nghiên cứu phát triển sản phẩm từ SLs đang được nhiều nhóm nghiên cứu
tiến hành, đăng ký bằng sáng chế và một số đã được thương mại hóa. Một trong những
ứng dụng quan trọng nhất của SLs là làm chất hoạt động bề mặt. Công ty Saraya ở
Nhật đã tiến hành thương mại hóa sản phẩm sophoron, một loại nước rửa chén chứa
SLs [18]. SLs cũng có thể được sử dụng trong bột giặt với vai trò là chất tẩy rửa [21].
Vì SLs là một phân tử không mang điện tích nên chúng có thể duy trì được đặc tính có
sức căng bề mặt thấp ngay cả trong điều kiện nồng độ muối cao. Khả năng tạo nhũ
(emulsifying) của SLs cũng được ứng dụng trong các ngành hóa dầu. Chúng có thể
được sử dụng trong việc thu hồi các sản phẩm dầu thứ cấp, loại bỏ thành phần
hydrocarbon trong dầu thô. SLs còn được sử dụng để xử lý đất và nước bề mặt bị


nhiễm hydrocarbon; hấp thu các kim loại nặng có trong trầm tích [7][32] Ngoài ra, đặc
tính tạo nhũ của SLs cũng được áp dụng trong trong công nghiệp thực phẩm để làm
tăng chất lượng của bột mì hay trong các khoang chứa lạnh của máy bay để tránh tạo
các tinh thể đá [5][34].
Bên cạnh đó, SLs cũng được ứng dụng nhiều trong mỹ phẩm. Công ty Soliance
ở Pháp đã thương mại hóa các sản phẩm chăm sóc da, dưỡng thể chứa SLs. Một công
ty của Hàn Quốc cũng đang trong quá trình thương mại hóa các sản phẩm chứa SLs
trong mỹ phẩm. Ngoài vai trò tạo nhũ, SLs còn đóng vai trò kháng khuẩn trong việc trị
mụn, trị gàu và mùi hôi cơ thể [31]. SLs còn cho thấy có nhiều tác động hữu hiệu trong