BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROBIOTIC
CHỊU NHIỆT SỬ DỤNG TRONG THỨC ĂN CHO
CHĂN NUÔI HEO, GÀ QUY MÔ PILOT
Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. Phạm Huỳnh Ninh
Sinh viên thực hiện

: Trần Lệ Quyên

MSSV: 1311100608

Lớp: 13DSH04

TP. Hồ Chí Minh, 2017


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học. Các số liệu, kết quả
nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình
nào. Các tài liệu tham khảo trích dẫn đều có nguồn gốc xác thực
Sinh viên thực hiện

MỤC LỤC........................................................................................................................ i
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT......................................................................................... iv
DANH MỤC BẢNG BIỂU ............................................................................................ v
DANH MỤC HÌNH ẢNH ............................................................................................ vii
LỜI MỞ ĐẦU ................................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 3
1.1 Đại cương về probiotic .............................................................................................................3
1.1.1 Lịch sử nghiên cứu probiotic ..................................................................................................3
1.1.2 Định nghĩa probiotic .................................................................................................................4
1.1.3 Các VSV probiotic thường gặp..............................................................................................4
1.1.4 Tiêu chuẩn lựa chọn chủng vi sinh vật probiotic ..............................................................7
1.1.5 Cơ chế tác động của Probiotic................................................................................................8
1.1.6 Vai trò của probiotic đối với vật nuôi ...............................................................................11
1.1.7 Probiotic từ bào tử ...................................................................................................................12
1.1.8 Tình hình nghiên cứu và sử dụng Probiotic trên thế giới và Việt Nam ....................13
1.2 Đại cương về vi khuẩn Bacillus ...........................................................................................18
1.2.1 Đặc điểm sinh học của Bacillus ...........................................................................................18
1.2.2 Bào tử Bacillus .........................................................................................................................22
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .......................................................... 25
2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài……...………...…………………………...... .........25
2.2 Vật liệu ........................................................................................................................25
2.2.1 Chủng vi sinh vật:..................……………………………….……….........................………25
2.2.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ……………………………………….…. ......................…....25
2.3 Môi trường nghiên cứu………………………………………………..…………26
2.4 Các phương pháp nghiên cứu (theo sơ đồ bố trí TN tổng quát)…………........... 30
2.5 Phương pháp nhuộm Gram……………………………………………… .......…31
i


2.6 Phương pháp nhuộm bào tử theo Schaeffer và Fulton......................... ............ ….32

3.4 Thiết lập đường cong tăng trưởng chủng Yoi…………… .........……………………….56
3.4.1 Thiết lập đường chuẩn……………………………………………… ....................................56
3.4.2 Thiết lập đường cong tăng trưởng………………………… ..........................…………….58
3.5 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự tạo thành bào tử của các
chủng Sub và Yoi……………………………………………………………..… .....................……58
3.6 Kết quả khảo sát các điều kiện tạo bào tử tốt nhất………………… .......……………..59
3.7 Sản xuất bào tử quy mô pilot……………………………………………… .............……...61
3.7.1 Kết quả khảo sát thời gian thích hợp để đạt sinh khối cao nhất với quy mô
pilot………………………….………………………………………..….....................................……61
3.7.2 Tiến hành tạo bào tử…………...……………………………….................................…..…..62
3.8 Tạo chế phẩm……………………………………………………………… ..................……..64
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ……………………… …………………....65
4.1 Kết luận………………………………………………………..………...…. …….65
4.2 Kiến nghị……………………………………………………………….… ...................………65
TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………… ................ …66
PHỤ LỤC…………………………………………………………………….…......... 74
Phụ lục I: Bảng biểu…………………………………………… ………………….….74
Phụ lục II: Hình ảnh……………………………… ................................ ………….….85

3


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
KL

Khuẩn lạc

MT

Môi trường

Bảng 3.2. Tỷ lệ sống sót của 11 chủng vi khuẩn trong môi trường muối mật
2%........................................... ........................ ..............................................................47
Bảng 3.3. Hoạt tính enzyme ngoại bào của các chủng Bacillus.......... ............... ..........49
Bảng 3.4. Hoạt tính đối kháng của các chủng Bacillus với vi khuẩn kiểm định ...... ....51
Bảng 3.5. Tổng hợp một số đặc tính probiotic của chủng Sub và Yoi... ................... ...54
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát đường chuẩn chủng Sub............................................. .......55
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát đường chuẩn chủng Yoi...... ................................. .............57
Bảng 3.8. Tỷ lệ hình thành bào tử ở các khoảng thời gian khác nhau với quy mô
pilot............................................. ....................................... ...........................................63
Bảng 5.1. Số lượng khuẩn lạc và mật độ tế bào vi khuẩn sống sót trong môi trường pH
thấp................ ........................................ ........................................................................74
Bảng 5.2. Số lượng khuẩn lạc và mật độ tế bào vi khuẩn sống sót trong môi trường
muối mật 2%................................................ ....................................... ..........................75
Bảng 5.3. Số liệu đường chuẩn của chủng Sub....................................................... ......76
Bảng 5.4. Kết quả phân tích sự tuyến tính giữa giá trị OD và log N của chủng
Sub................................................................................... ..............................................77
Bảng 5.5. Số liệu đường cong tăng trưởng chủng Sub.......... .................................. .....78
Bảng 5.6. Số liệu đường chuẩn chủng Yoi.............. ..................................... ................79
Bảng 5.7. Kết quả phân tích sự tuyến tính giữa giá trị OD và log N của chủng
Yoi.................................... ............................................. ................................................80
Bảng 5.8. Số liệu đường cong tăng trưởng chủng Yoi................. .................... ............81
5


Bảng 5.9. Số liệu khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự tạo thành tế bào
và bào tử của các chủng Sub......................................... .................................... ............82
Bảng 5.10. Số liệu khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự tạo thành tế bào
và bào tử của các chủng Yoi............................... .............................. ............................82
Bảng 5.11. Tỷ lệ hình thành bào tử qua 7 môi trường của 2 chủng Sub và Yoi.......... .83
Bảng 5.12. Mật độ bào tử của các phương pháp tạo bào tử tốt ở các khoảng thời gian

chủng Bacillus subtilis ..……………… ...................................................................... .60
Hình 3.11. Mật độ tế bào với quy mô pilot của chủng Bacillus subtilis ..................... ..61
Hình 5.1. Máy ly tâm Avanti JXN Series .................................................................... .87
Hình 5.2. Chế phẩm thử nghiệm bào tử Bacillus subtilis… ......................................... 87
Hình 5.3. Hệ thống lên men 5 L………………........................................................... .88

vii


LỜI MỞ ĐẦU
Tính cấp thiết của đề tài
Khí hậu Việt Nam nóng ẩm theo mùa, thời tiết thay đổi thường xuyên, nhiệt độ
không ổn định là môi trường lí tưởng để vi khuẩn gây bệnh bùng phát ở các chuồng trại
chăn nuôi. Ngành chăn nuôi gặp rất nhiều vấn đề về bệnh tật xuất phát từ đường ruột
và hệ tiêu hóa. Theo thống kê hằng năm, tỷ lệ gia súc và gia cầm chết do mắc bệnh
đường ruột lớn nhất so với nguyên nhân gây bênh khác. Không chỉ vậy, trong chăn
nuôi còn tồn tại các vấn đề khác như lạm dụng kháng sinh và chất tăng trọng gây tác
hại đối với người sử dụng, lãng phí thức ăn do vật nuôi không hấp thụ hết thức ăn, dinh
dưỡng. Vì vậy, để giải quyết được những vấn đề trên đồng thời có thể nâng cao năng
suất hiệu quả kinh tế cho bà con nông dân, Probiotic là một giải pháp hiệu quả nhất
hiện nay. Các tác dụng cơ bản của probiotic là tăng cường khả năng miễn dịch, chống
lại vi khuẩn gây bệnh bằng cách cạnh tranh vị trí bám dính và dinh dưỡng của vi khuẩn
có hại trong hệ tiêu hóa.
Một lượng lớn các sản phẩm probiotic được sản xuất hay nhập khẩu, phân phối
và sử dụng trong chăn nuôi. Các chế phẩm này chủ yếu chứa các vi khuẩn sống thuộc
các giống Bacillus, Lactobacillus, Enteroccocus, nấm men. Số lượng và chủng loại chế
phẩm probiotic ứng dụng trong chăn nuôi tại Việt Nam hiện nay rất đa dạng. Tuy
nhiên, không phải chế phẩm nào cũng đạt chuẩn và phù hợp với môi trường, khí hậu,
điều kiện chăn nuôi Việt Nam. Một chế phẩm probiotic đạt hiệu quả ở một quốc gia
nông nghiệp tiên tiến nhưng có thể hoàn toàn không hiệu quả ở một quốc gia nông

chăn nuôi heo, gà quy mô pilot”.
Mục đích đề tài
Sản xuất chế phẩm probiotic chứa bào tử vi khuẩn Bacillus với quy mô pilot
Nhiệm vụ của đề tài



Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus có đặc tính probiotic tốt
Khảo sát điều kiện tạo bào tử trong điều kiện lên men lỏng



Sản xuất bào tử Bacillus dạng pilot (5 lít )



Tạo chế phẩm Probiotic


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Đại cương về probiotic
1.1.1 Lịch sử nghiên cứu probiotic
Những nghiên cứu về probiotic mới chỉ bắt đầu vào thế kỷ 20, Henry Tisser
(1900), một bác sỹ người Pháp đã quan sát và thấy rằng phân của những đứa trẻ mắc
bệnh tiêu chảy có ít vi khuẩn lạ hình trứng hoặc hình chữ Y hơn những đứa trẻ khỏe
mạnh [53].
Sau đó năm 1907, Elie Metchnikoff - người Nga, đạt giải Nobel – đã chứng
minh được rằng việc tiêu thụ Lactobacillus sẽ hạn chế các nội độc tố của hệ vi sinh vật
đường ruột. Ông giải thích được điều bí ẩn về sức khỏe của những người Cô-dăc ở
Bulgary, họ sống rất khỏe mạnh và tuổi thọ có thể lên tới 115 tuổi hoặc hơn, nguyên

sung vi sinh vật sống vào thức ăn giúp cải thiện cân bằng của hệ vi sinh vật đường tiêu
hóa theo hướng có lợi cho vật chủ” [26]; (ii) theo tổ chức Y tế thế giới (2001),
probiotic là “các vi sinh vật sống khi đưa vào cơ thể theo đường tiêu hoá với một số
lượng đủ sẽ đem lại sức khoẻ tốt cho vật chủ”.
1.1.3 Các VSV probiotic thường gặp
Chế phẩm probiotic là một tập hợp các chủng VSV có ích. Đó là các TB sống
của các chủng VSV, sống hợp sinh và sản sinh ra một số hợp chất sinh học có tác dụng
đến đời sống cây trồng, vật nuôi, cải thiện MT, đồng thời cũng có tác dụng dương tính
đối với sức khỏe con người khi đưa chế phẩm này vào đường ruột [12].
Chế phẩm probiotic thường gồm các nhóm VSV sau:
Các nhóm VSV cơ bản:
 Nhóm VK lactic [17]:
Đây là nhóm VK thân thuộc với con người từ ngàn xưa. Trong tự nhiên, chúng
phân bố rất rộng rãi, thường gặp nhiều trong các sản phẩm muối chua như dưa chua, cà


muối, mắm chua, sữa chua…Ngoài khả năng sinh axit lactic do lên men đồng hình và
dị hình, VK lactic còn có thể sinh hàng loạt chất có hoạt tính kháng sinh được gọi
chung là bacterioxin gồm nizin, diplocoxin, acidofilin, lactoxindin, lactolin, brevin,…
Các chất này được dùng rộng rãi trong bảo quản thực phẩm, trong chăn nuôi với vai
trò là chất kích thích sinh trưởng, ứng dụng trong việc phòng và trị các bệnh đường
tiêu hóa cho người và vật nuôi.
Các chế phẩm probiotic được biết đến nhiều nhất với các chủng VK lactic sau: L.
acidophilus, L. casei, L. plantarum, L. bulgaricus, L. kefir, L. delbruckii, L. sporogenes,
Bifidobacterium, Bifidus bacteria, S. faecalis…[24].
Các chế phẩm probiotic có thể sử dụng 1 chủng VSV như chế phẩm Antibio của
Hàn Quốc (100% là L. acidophilus) hay Biosubtyl của Đà Lạt (100% là bào tử B.
subtilis) hoặc kết hợp nhiều chủng VSV như chế phẩm Emina thuộc Viện Sinh học
Nông nghiệp Hà Nội (ngoài VK lactic còn có VK Bacillus, VK quang dưỡng khử H2S
và nấm men..) [17].

và trị liệu phối hợp trong nhiễm trùng H. pylori [10].
 Nấm mốc:
Điển hình là Asp. oryzae, Asp. niger. Trong chế phẩm probiotic, chúng có vai
trò sản sinh các enzym amylase, protease, cellulase,…nhằm tăng cường khả năng tiêu
hóa thức ăn của con người và vật nuôi, đồng thời cũng có thể được bổ sung vào chế
phẩm để hỗ trợ quá trình phân hủy các hợp chất hữu cơ do thức ăn thừa hay phân do
vật nuôi bài tiết ra [17].
Ngoài ra, còn một số nhóm VSV khác cũng được bổ sung vào chế phẩm
probiotic giúp cải thiện MT nước nuôi trồng thủy sản, tăng khả năng làm sạch ao hồ,


giảm hoặc mất mùi hôi thối do H2S… như: VK nitrat (Nitrobacter và Nitrosomonas),
VK quang dưỡng khử H2S, VK tía có lưu huỳnh và VK tía không chứa lưu huỳnh
(Rhodobacter sp., Rhodospirillum, Rhodopseudomonas viridis, Rhodopseudomonas
palustris…) [17]
1.1.4 Tiêu chuẩn lựa chọn chủng vi sinh vật probiotic
Việc lựa chọn các chủng vi sinh vật probiotic với tiêu chuẩn đầu tiên là phải an
toàn cho quá trình sản xuất và ứng dụng, có khả năng sống sót ở điều kiện khắc nghiệt
trong đường tiêu hóa vật chủ. Các chủng vi sinh vật probiotic được lựa chọn theo các
tiêu chuẩn chủ yếu sau:
-

Khả năng tồn tại trong môi trường axit dạ dày:
Các nhà khoa học đã chứng minh, các probiotic phải trải qua các quá trình tiêu

hóa khắc nghiệt hơn 90 phút trước khi được giải phóng từ dạ dày vào ruột. Tuy nhiên,
các quá trình tiêu hóa có thời gian xảy ra lâu hơn nên VSV probiotic phải chịu được áp
lực của dạ dày với pH thấp đến khoảng 1,5. Do đó, các chủng được sử dụng làm
probiotic phải chịu được pH thấp ít nhất 90 phút, tiếp đến chúng phải gắn vào biểu mô
ruột và phát triển được trong ruột trước khi phát huy vai trò đối với vật chủ. Vì vậy,

khuẩn của chúng có thể theo nhiều cơ chế khác nhau như:
+ Sản sinh ra các chất Bacteriocin.
+ Làm giảm độ pH bởi tạo ra axit lactic.
+ Tạo ra H2O2.
+ Làm giảm độc tố theo các cơ chế khác nhau.
+ Khả năng làm giảm sự bám dính của các vi khuẩn gây bệnh trên bề mặt.
+ Cạnh tranh dinh dưỡng với các vi khuẩn gây bệnh.
-

Khả năng sinh enzyme ngoại bào:

1.1.5 Cơ chế tác động của Probiotic
Đã có nhiều nghiên cứu giải thích cơ chế tác động của probiotic, song vẫn còn
nhiều ý kiến khác nhau. Sau đây là tóm tắt những kiểu tác động của probiotic được
nhiều nhà khoa học chấp nhận [9, 24, 26].
Cơ chế tác động của probiotic được tóm tắt như sau [9, 27]


Cải thiện sức
khỏe và năng suất
Giảm thiểu sự sản sinh
nhóm amin độc hại

Tăng độ hữu dụng
của chất dinh dưỡng

Cải thiện sự cân bằng
hệ VK dạ dày – ruột
Cải thiện sự hấp
thu


với VSV gây bệnh [28].
Đối kháng là hiện tượng một loài VSV bằng cách này hay cách khác ức chế
hoặc tiêu diệt sự ST và phát triển của một loài VSV khác. Một số nhà khoa học cho


rằng, cơ chế tác động đối kháng xảy ra khi nguồn thức ăn cạn kiệt do sự phát triển
nhanh chóng của một vài loại VSV và tạo điều kiện bất lợi cho sự phát triển của VSV
khác
Hoạt động đối kháng với VSV gây bệnh bao gồm:
 Cạnh tranh về vị trí bám dính trên nhung mao ruột để tranh giành
chất
dinh dưỡng và khối lượng các chất được sinh ra. Khi VSV gây bệnh bị cạnh tranh,
thiếu chất dinh dưỡng nên không thể sinh trưởng và phát triển được. Từ đó có thể ức
chế hoặc tiêu diệt VSV gây bệnh, thiết lập lại sự cân bằng hệ VSV đường ruột. Phương
pháp sử dụng probiotic để loại trừ các VK có hại bằng quá trình cạnh tranh tốt hơn
nhiều so với phương pháp sử dụng kháng sinh [24]


Ngoài khả năng gia tăng về số lượng để cạnh tranh vị trí bám với

VSV
gây bệnh, VSV probiotic còn có thể tác động nhờ khả năng sản sinh các chất có hoạt
tính kháng khuẩn như: kháng sinh, bacterioxin, axit hữu cơ, H2O2, ethanol,… Những
chất này được sinh ra trong quá trình sống của VSV, có khả năng tiêu diệt có chọn lọc
các VK gây bệnh, tạo nên sự cân bằng hệ vi sinh đường ruột [17, 20].
-

Gia tăng lượng thức ăn ăn vào và khả năng tiêu hóa: probiotic kích thích tính


hoặc có sự xáo trộn hệ VSV đường ruột [4].
1.1.6 Vai trò của probiotic đối với vật nuôi [17]
Probiotic có tác dụng tốt đối với vật nuôi như gia súc, gia cầm, thủy cầm, thủy
sản. Cụ thể như sau:
- Probiotic giúp phát triển hệ VSV đường ruột bình thường, tăng cường khả năng
tiêu hóa và hấp thu dinh dưỡng từ các loại thức ăn. Đối với gia súc dạ cỏ, probiotic còn
giúp hệ VSV dạ cỏ phát triển và hoạt động tốt hơn.
- Ức chế và có thể tiêu diệt được các VSV có hại. Làm tăng sức đề kháng và khả
năng chống chịu với các điều kiện bất lợi đối với vật nuôi, phòng chống các dịch bệnh
thường gặp, nhất là bệnh phân trắng ở heo con do E. coli.
Nghiên cứu của Phạm Khắc Hiếu và cộng sự (2002) về tác dụng kháng khuẩn
của chế phẩm EM1 (do Nhật Bản sản xuất) cho thấy: chế phẩm này có tác dụng ức chế
E. coli, Salmonella, Klebsiella, Shigella, Proteus, Staphylococcus, Streptococcus,
Clostridium perfringens, Sarcina lutea. Sau khi dùng chế phẩm EM1 trộn với thức ăn
9

cho heo (khoảng 10 cfu /kg thức ăn), kết quả kiểm tra số lượng E. coli trong 1g phân
heo đã giảm 7% ở heo từ 1 - 21 ngày tuổi, giảm 5,3% ở heo từ 22 - 60 ngày tuổi [24].
- Làm cho gia súc, gia cầm cái mắn đẻ hơn, tăng chất lượng thịt và tăng năng suất
chăn nuôi [17].
Lã Văn Kính (1998) đã tổng hợp các công trình nghiên cứu của các tác giả nước
ngoài khi sử dụng các chế phẩm probiotic trên gà đẻ và gà thịt với kết quả như sau: Đối
với gà đẻ, sản lượng trứng tăng 5% ở mức bổ sung 100mg probiotic/kg thức ăn (Mohal
11


6

và ctv, 1995). Khi bổ sung hỗn hợp L. acidophilus và L. casei (khoảng 10 cfu /kg
thức ăn) đã cải thiện số ngày đẻ trứng, hệ số chuyển hóa thức ăn và chất lượng lòng

-

Sản phẩm probiotic dạng bào tử có thể được bảo quản ở nhiệt độ phòng ở điều

kiện khô mà không bị ảnh hưởng đến độ sống.
-

Bào tử có thể sống sót khi di chuyển qua môi trường pH axit của dịch vị dạ dày

[30,54], trong khi phần lớn các Lactobacillus ở dạng vi khuẩn sẽ bị tiêu diệt [58]. Một
liều lượng nhất định của bào tử có thể được bảo quản vô thời hạn không cần để trong tủ
lạnh và toàn bộ bào tử trong liều dùng đó sẽ được đi vào ruột để phát triển thành vi
khuẩn sống và phát huy tác dụng.
-

Trên thị trường hiện nay có rất nhiều chế phẩm probiotic từ bào tử vi khuẩn,

các loại vi khuẩn hay được sử dụng là: B. clausii, B. subtilis, B. cereus, B.
licheniformis với nhiều dạng bào chế và số lượng bào tử khác nhau.
1.1.8 Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic từ các chủng Bacilllus trong
chăn nuôi gia súc và gia cầm trên thế giới và Việt Nam
Với đặc điểm sinh lý, sinh hóa ưu việt, Bacillus là một nguồn gen phong phú,
được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: trong công nghiệp thực
phẩm, trong lĩnh vực CNSH, trong lĩnh vực y học… Đặc biệt là trong chăn nuôi, con
người đã sử dụng Bacillus một cách hiệu quả trong việc tạo ra nhiều chế phẩm
probiotic giúp phòng và điều trị một số bệnh đường tiêu hóa ở gia súc, gia cầm…
1.1.8.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm probiotic trên thế
giới
Năm 1940, Noriokimura Yokohamo đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm Kumura
từ B. subtilis để ngăn chặn sự phát triển và sinh độc tố của chủng nấm mốc Asp.


tốn thức ăn cũng cải thiện hơn so với lô đối chứng. Trong đó, lô sử dụng 10 cfu B.
licheniformis/kg thức ăn cho kết quả tốt nhất.
Năm 2001, Lema và cộng sự đã dùng probiotic trộn với thức ăn cho cừu ăn liên
6

tục trong 7 ngày với liều 6 x 10 cfu/kg thức ăn để khảo sát sự bài thải của E.coli
O157:H7. Kết quả nghiên cứu cho thấy, sự bài thải E. coli trong phân thấp hơn so với
đối chứng không sử dụng probiotic trộn với thức ăn.
1.1.8.2Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm probiotic ở Việt
Nam
Năm 1962, yaourt và canh trùng subtilis được Đào Trọng Đạt và Vũ Đình Hưng
dùng để phòng và trị bệnh phân trắng ở heo con, bước đầu cho kết quả khả quan [5].
14