BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

THỬ NGHIỆM CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ KHẢ
NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN
BACILLUS SPP. VÀ LACTOBACILLUS SPP. ĐỐI VỚI
MỘT SỐ NẤM MỐC SINH ĐỘC TỐ AFLATOXIN

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG
Sinh viên thực hiện
MSSV: 1515100007

: LÊ NGÔ VŨ PHƯỢNG
Lớp: 15HSH01

TP. Hồ Chí Minh, 2016.


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự
hướng dẫn của TS. Nguyễn Hoài Hương khoa Công Nghệ Sinh Học- Thực PhẩmMôi Trường của trường Đại Học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh.

TP. HCM, ngày 12 tháng 8 năm 2016
Sinh viên thực hiện
Lê Ngô Vũ Phượng

ii


Đồ án tốt nghiệp

3


MỤC LỤC
TRANG
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .......................................................... vi
DANH MỤC BẢNG .................................................................................. vii
DANH MỤC HÌNH ................................................................................... ix
MỞ ĐẦU .................................................................................................... 2
CHƯƠNG I: TÔNG QUAN ................................................................... 4
1.1. Tổng quan về nấm: ..................................................................................4
1.1.1. Giới thiệu chung....................................................................................4
1.1.2.
Độc
tố
do
.............................................................................4

nấm

tiết


vật
phẩm

1.2. Tổng quan về hợp chất kháng nấm: ........................................................7
1.2.1.
Hợp
chất
kháng
................................................................10

nấm

hóa

học

1.2.2. Tác hại của hợp chất kháng nấm hóa học .............................................10
1.2.3. Hợp chất kháng nấm trong sinh học .....................................................13
1.2.3.1.

Hợp chất kháng nấm từ thực vật: ....................................................13

1.2.3.2.

Hợp chất kháng nấm từ vi khuẩn: ...................................................17
a. Khả năng kháng nấm mốc của Bacillus spp. .............................17
b. Khả năng kháng nấm mốc của Lactobacillus spp......................19

1.3.

..........................................................................................................................35
2.6.5. Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng che phủ theo phương pháp đỗ dĩa 2
lớp của 2 chủng vi khuẩn Bacillus spp. và Lactobacillus spp. với nấm mốc: .
..........................................................................................................................39
2.6.6. Một số phương pháp khảo sát hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa của một số
chủng vi khuẩn .................................................................................................43
2.6.6.1. Nhuộm gram........................................................................................43
2.6.6.2. Nhuộm bào tử......................................................................................44
2.6.6.3. Một số thử nghiệm sinh hóa:...............................................................44


Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN .......................................... 45
3.1. Định danh sơ bộ khảo sát sinh lý - sinh hóa của một số chủng vi khuẩn
..................................................................................................................... 45
3.1.1. Nhuộm Gram:.................................................................................... 45
3.1.2. Nhuộm bào tử:................................................................................... 46
3.1.3. Một số thử nghiệm sinh hóa:............................................................. 47
3.2. Khảo sát sự tăng trưởng của nấm mốc: ...............................................
48
3.3. Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phương pháp ria 2 đường vi khuẩn
của 2 chủng VK Bacillus spp. và Lactobacillus spp. với các chủng nấm mốc:
..........................................................................................................................50
3.4. Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phương pháp đặt thạch
khuếch tán của 2 chủng VK Bacillus spp. và Lactobacillus spp. với các chủng nấm
mốc:..................................................................................................................66
3.5. Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng che phủ thep phương pháp đỗ dĩa 2
lớp 2 chủng VK Bacillus spp. và Lactobacillus spp. với các chủng nấm mốc
..........................................................................................................................81


VK

Vi khuẩn

VSV

Vi sinh vật


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1.Một số hợp chất kháng nấm hóa học được sử dụng để bảo quản hạt giống
..........................................................................................................................9

Bảng 1.2.Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men
(Corsetti và cộng sự, 1998) ..............................................................................18
Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái của các chủng Bacillus spp. .............................45
Bảng 3.2. Một số phản ứng sinh hóa của các chủng Bacillus spp. .................47
Bảng 3.3. Thống kê số liệu tỉ lệ ức chế các chủng nấm mốc của các chủng vi khuẩn
Bacillus spp. theo từng nhóm với phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn...........
..........................................................................................................................53
Bảng 3.4. So sánh sô liệu tỉ lệ ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn Bacillus
spp. mạnh nhất trong từng nhóm theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn....
..........................................................................................................................54
Bảng 3.5. Thống kê số liệu tỉ lệ ức chế của các chủng nấm mốc của các vi khuẩn
Lactobacillus spp. theo từng nhóm với phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn
..
..........................................................................................................................62

Lactobacillus spp. trong các nhóm theo phương pháp đỗ dĩa 2 lớp ...............90
Bảng 3.15. Thống kê điểm các chủng vi khuẩn Bacillus spp. theo từng phương pháp
dựa
theo
xếp
hạng
....................................................................................91

LSD

Bảng 3.16.. Thống kê điểm các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp. theo từng
phương pháp dựa theo xếp hạng LSD..............................................................92

8


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của Metalaxyl .......................................................10
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của Manocozeb ....................................................11
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của Hexacoconazole ............................................11
Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của Pyrones .........................................................14
Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của Viridines ........................................................15
Hình 1.6. Phương pháp cấy ria 2 đường thể hiện sự đối kháng của vi khuẩn
LAB đối với nấm mốc (trích từ Nora Laref, 2013)..........................................20
Hình 1.7. Sơ đồ nghiên cứu khả năng đối kháng của vi khuẩn có lợi theo phương
pháp ria 2 đường vi khuẩn................................................................................21
Hình 1.8. Phương pháp đặt thạch khuếch tán thể hiện sự đối kháng giữa vi khuẩn
Bacillus spp với Calbicans (trích dẫn Mounyr Balouiri, 2015) .......................

Hình 3.4. Sự phát triển của nấm mốc sau 3 ngày trên MT PDA .....................48
Hình 3.5. Sự phát triển của nấm mốc sau 3 ngày trên MT MRS Cải tiến .......49
Hình 3.8. Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế nấm mốc của nhóm Bacillus spp phân lập tử
phụ phế phẩm ...................................................................................................55
Hình 3.9. Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế nấm mốccủa nhóm Bacillus spp phân lập tử
phụ đất ..............................................................................................................56
Hình 3.10 Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế nấm mốc của nhóm Bacillus spp phân lập
tử nước thải ......................................................................................................57
Hình 3.13. Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế nấm mốccủa nhóm Lactobacillus sp phân
lập tử nem .........................................................................................................63

1
0


Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.14. Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế nấm mốc của nhóm Lactobacillus sp phân
lập tử cơm mẻ ...................................................................................................64
Hình 3.18. Biểu đồ thể hiện vòng ức chế nấm mốc của nhóm Bacillus spp phân lập
tử phụ phế phẩm ...............................................................................................70
Hình 3.19. Biểu đồ thể hiện vòng ức chế nấm mốc của nhóm Bacillus 66spp phân
lập tử đất ...........................................................................................................71
Hình 3.20. Biểu đồ thể hiện vòng ức chế nấmmốccủa nhóm Bacillus spp phân lập
tử nước thải ......................................................................................................72
Hình 3.24. Biểu đồ thể hiện vòng ức chế nấm mốc của nhóm Lactobacillus sp
phân lập tử nem ................................................................................................78
Hình 3.25. Biểu đồ thể hiện vòng ức chế nấm mốc của nhóm Lactobacillus sp
phân lập tử cơm mẻ ..........................................................................................79



2. Tình hình nghiên cứu:
Có rất nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật để kháng nấm mốc gây
hại trong nông sản và thực phẩm theo nhiều phương pháp khác nhau.


Trong nước đã có nhiều công trình nghiên cứu dùng vi sinh vật để kháng

lại
nấm mốc theo phương pháp đối kháng trực tiếp (Magaldi,2004) như: “ Phân
lập tuyển chọn vi khuẩn Bacillus spp. ứng dụng trong bảo quản nông sản”
(Văn Hương, 2015), đồ án tốt nghiệp “Khảo sát khả năng kháng nấm nhiễm
thực phẩm Aspergillus Niger và Mucor sp. Của vi khuẩn Lactobacillus
L5”(Phan Nguyễn Hương Thảo, 2015)….


Ngoài nước có công trình nghiên cứu hoạt động kháng nấm của vi

khuẩn
lactic được phân lập từ Kim Chi để kháng lại Aspergillus fumigatus Jeong75, Hàn Quốc theo phương pháp đối kháng che phủ (Magnusson và
Schnurer,2001) .

3. Mục đích nghiên cứu:
Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng kháng nấm mốc cao và hiệu quả
nhất từ bộ sưu tập các chủng vi khuẩn Bacillus spp. và Lactobacillus spp. của
phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm- Môi Trường của trường.

4. Mục tiêu nghiên cứu:
Tìm ra phương pháp đánh giá khả năng đối kháng vi nấm hiệu quả nhất và dễ
thực hiện áp dụng trên bộ sưu tập các chủng vi khuẩn Bacillus spp. và

thích hợp nhất cho phòng thí nghiệm.

6. Phương pháp nghiên cứu:
a. Phương pháp luận:
Dựa trên các chủng vi khuẩn Bacillus spp. và Lactobacillus spp. đã được phân
lập trong phòng thí nghiệm để thử nghiệm các phương pháp đối kháng nấm đã
được mô tả trong tài liệu.Từ đó, đưa ra phương pháp thích hợp nhất trong phòng
thí nghiệm để đối kháng lại các loại nấm mốc gây hại trên thực phẩm và hạt
giống cây trồng.

b. Phương pháp xử lí số liệu:
 Sử dụng phần mềm Excel để vẽ đồ
thị.
 Sử dụng phần mềm SAS 9.1 để xử lí số
liệu.

7. Kết quả đạt được từ đề tài:
 Tuyển chọn được chủng vi khuẩn Bacillusspp.và vi khuẩn Lactobacillus spp.
có hoạt tính kháng nấm tốt nhất trong bộ sưu tập của phòng thí nghiệm.
 Đánh giá tỉ lệ ức chế các loại vi nấm của 2 chủng vi khuẩn thông qua phương
pháp kháng nấm trực tiếp theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn. (Dual
Culture Two Line Culture Method).
 Xác định đường kính ức chế các loại nấm mốc của 2 chủng vi khuẩn qua
phương pháp đối kháng trực tiếp theo cách đặt thạch khuếch tán (Agar Plug
Diffusion Method).
 Đánh giá khả năng ức chế các loại nấm mốc của 2 chủng vi khuẩn
qua
phương pháp đối kháng che phủ (Overlay Method).
 Đã chọn được phương pháp cho kết quả ổn định nhất trong phòng thí
nghiệm.

Antonio
Micheli (1729) nghiên cứu ra qua tài liệu “Giống cây lạ” (Nova
Plantarum Genera) nhưng theo giáo sư Ekriksson Gunnan (1978) thì
người có công nghiên cứu sâu về nấm mốc lại là Elias Fries (17941874).Những đại diện tiêu biểu của nấm là nấm mốc, nấm men và nấm
lớn (nấm quả thể). Phần lớn các loài nấm này không quan sát được bằng
mắt thường. Đa phần chúng sống trong đất, chất mùn, xác của vi sinh
vật, cộng sinh hay kí sinh trên cơ thể của động vật, thực vật hay nấm
khác. Vi nấm có vai trò quan trọng trong hệ sinh thái, chúng phân hủy
các chất hữu cơ và không thể thiếu trong quá trình chuyển hóa và trao
đổi chất


Nấm mốc (hay còn gọi là vi nấm) là vi sinh vật chân hạch, ở thể tản, là

tế
bào không có diệp lục tố, thường sinh sản thông qua bào tử hoặc sống dị
dưỡng (hoại sinh, kí sinh, cộng sinh),quá trình sinh sản có thể là vô tính
nhay hữu tính.Vách tế bào chủ yếu là chitin, có hoặc không có cenllulose
và một số thành phần khác có hàm lượng thấp. Nấm mốc thường thường
phát triển dưới dạng sợi đa bào gọi là sợi nấm (hyphae) tạo hệ sợi
(mycelium). Có 2 loại sợi:


Sợi nấm dinh dưỡng: nằm trong lớp môi trường, làm nhiệm vụ hấp
thu chất dinh dưỡng cho toàn bộ hệ nấm.



Sợi nấm khí sinh: thường nhô ra môi trường, giữ vai trò sinh sản (tạo
bào tử).

T-2 toxin.



Các độc tố của Alternaria: Axit Tenuazoic, Alternarion, Methyl
Ether Alternarion.

 Các độc tố của Clavicep: các alkaloid của nấm cựa gà.
 Trong đó, nấm gây độc chủ yếu và nguy hại nhất là Aflatoxin. Chúng là
độc tố vi nấm do nấm mốc Aspergillus flavus, A.parasiticus sản sinh ra,
thường gây độc tố ô nhiễm lên các loại đậu (như đậu phộng). Phản ứng
gây độc chủ yếu của chúng là trong gan. Nếu mức độ gây nhiễm thấp sẽ
tích lũy dần trong gan và làm giảm khả năng sinh sản của động vật về lâu
dài sẽ gây ra bệnh ung thư.


Ngoài ra, còn có 1 số độc tố của các vi nấm thường gặp như Ochratoxin
Penicillium và Aspergillus tiết ra. Độc tố Zearalenon và Tricothecenes
chủ yếu do nấm Fusarium tiết ra, độc tố Patulin lại do nấm Penicillium
và Fumonisin tiết ra.

7


1.1.3. Tác hại của nấm mốc:
1.1.3.1. Tác hại của nấm gây ra cho con người và động vật:
 Dị ứng hoặc ngộ độc do ăn hay tiếp xúc với nấm: Có khoảng 70 loài nấm
sinh bào tử là những tác nhân gây dị ứng. Chúng có thể là nấm mốc trong
nhà hay ngoài trời, đa phần là nấm sợi thuộc các chi Alternaria,
Aspergillus, Cladosporium, Helminthosporium, Epicoccum, Penicillium,

8


Fusarium và Penicillium thường tiết độc tố vi nấm vào thực phẩm vào
thời gian trước, trong và sau khi thu hoạch ngũ cốc, hạt có dầu, đậu
đỗ,…


Có 4 tác động gây độc của độc tố vi nấm là: độc cấp tính, mãn tính, gây
đột biến và quái thai. Phổ biến nhất là độc cấp tính, làm hư gan và rối
loạn chức năng hoạt động của thận, có thể gây chết đối với trường hợp
nặng. Các độc tố vi nấm tác động lên hệ thần kinh, ở nồng độ thấp gây tê
liệt động vật và ở nồng độ cao có thể gây tổn thương não và chết. Nhiều
công trình thử nghiệm đã xác định độc tố vi nấm có thể gây ung thư, đặc
biệt là ở gan. Qua thử nghiệm trên động vật nuôi trong nhà đã xác định
có một số độc tố vi nấm gây rối loạn tới sự sao chép ADN và gây hậu
quả là đột biến hoặc quái thai.

1.2. Tổng quan về các hợp chất kháng nấm:
Hợp chất kháng nấm là các chất ức chế sự tăng trưởng của nấm có tầm
quan trọng trong việc kiểm soát các tác nhân gây bệnh của nấm đối với
con người và động vật và trong việc phòng chống nấm mốc trong thực
phẩm và các vật liệu khác.
1.2.1. Hợp chất kháng nấm hóa học:
 Các hợp chất kháng nấm hóa học đa số đều có mặt trong các loại thuốc
trừ nấm mốc gây hại cho nông sản như Carbendazim, Metalaxyl, Anvil,
….

9


sulphydryl gây ức chế hoạt động của sáu quá trình sinh hóa khác nhau
trong tế bào chất và ty thể, phá vỡ sự nảy nầm của bào tử nấm mốc.( trích
dẫn từ Chi cục trồng trọt và bảo vệ thực vật tỉnh Lâm Đồng, 2014).

Hình 1.2: Cấu trúc hóa học của Manocozeb

11




Hexaconazole có công thức hóa học là C19H17Cl2N3O3 là hoạt chất có chứa
trong thuốc kháng nấm hóa học Anvil 5SC. Là hoạt chất trừ nấm phổ
rộng, tiêu diệt nấm mốc thông qua cơ chế ngăn cản sinh tổng hợp
Ergosterol (chất cấu tạo nên màng nấm mốc), nấm sẽ bị cô lập và ngừng
phát triển do chúng không hình thành được tế bào mới. Chất này được mô
cây hấp thu rất nhanh, chuyển vị và lưu dẫn mạnh nên kiểm soát nấm mốc
nhanh chóng và hiệu quả và kéo dài cơ chế vừa phòng vừa trị bệnh.

Hình 1.3: Cấu trúc hóa học của Hexaconazole.
1.2.2. Tác hại của hợp chất kháng nấm hóa học:
 Bên cạnh các lợi ích trong việc kháng nấm thì các hợp chất hóa học gây
ảnh hưởng mạnh đến môi trường và sức khỏe của con người và động vật.
Theo điều tra của cục Y tế dự phòng và môi trường Việt Nam, hằng năm
có trên 5000 trường hợp nhiễm độc hợp chất hóa học phải cấp cứu tại
bệnh viện và có trên 300 trường hợp tử vong (do ngộ độc cấp tính) vì
lượng chất hóa học còn tồn đọng quá cao trong thực phẩm. Nếu liều
lượng ít, được đưa gián tiếp vào cơ thể thông qua thực phẩm, về lâu dài
từ 3-5 năm sẽ phát bệnh (tim mạch, ung thư…)
