BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VI KHUẨN LACTIC TỪ THỰC PHẨM LÊN
MEN TRUYỀN THỐNG CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM
MỐC SINH AFLATOXIN Aspergillus spp.

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG
Sinh viên thực hiện
MSSV: 1211100167

: LƯU ĐẠI KIM PHƯỢNG
Lớp: 12DSH01

TP. Hồ Chí Minh, 2016


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu
trong đồ án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào
khác.

Xin chân thành cảm ơn các bạn học cùng lớp 12DSH đã gắn bó, chia sẻ, giúp đỡ
và đóng góp ý kiến cho em trong suốt bốn năm đại học.
Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn các Thầy Cô trong Hội Đồng Phản Biện đã
dành thời gian đọc, nhận xét đồ án tốt nghiệp này.
TP.HCM, tháng 8 năm 2016.
SVTH: Lưu Đại Kim Phượng

ii


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT.......................................................................................vii
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................... viii
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH...................................x
MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1
1. Tính cấp thiết của đề tài .........................................................................................1
2. Tình hình nghiên cứu .............................................................................................2
2.1. Ngoài nước .........................................................................................................2
2.2. Trong nước .........................................................................................................3
3. Mục tiêu nghiên cứu ...............................................................................................3
4. Mục đích nghiên cứu ..............................................................................................3
5. Nhiệm vụ nghiên cứu ..............................................................................................3
6. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................4
6.1. Phương pháp luận ..............................................................................................4
6.2. Phương pháp xử lý số liệu ..................................................................................4
7. Kết quả đạt được của đề tài ...................................................................................4
8. Kết cấu đồ án ...........................................................................................................5
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN..........................................................................................6

1.2.4.1. Sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn lactic ....................................................... 38
1.2.4.2. Ứng dụng của vi khuẩn lactic ................................................................................. 40
1.2.5. Khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn lactic ..........................................40
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................46
2.1. Địa điểm nghiên cứu ..........................................................................................46
2.2. Thời gian thực hiện............................................................................................46
2.3. Vật liệu ................................................................................................................46
2.3.1. Thiết bị và dụng cụ ........................................................................................46
2.3.2. Hóa chất ........................................................................................................46
2.3.3. Giống nấm .....................................................................................................50
2.4. Phương pháp luận..............................................................................................50
2.5. Phương pháp thí nghiệm ...................................................................................53

4


Đồ án tốt nghiệp

2.5.1. Thu thập mẫu .................................................................................................53
2.5.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn lactic .........................................................53
2.5.2.1. Tăng sinh ...................................................................................................................... 53
2.5.2.2. Phân lập ....................................................................................................................... 53
2.5.3. Các thí nghiệm dùng để định danh vi khuẩn lactic. ......................................55
2.5.3.1. Nhuộm Gram ............................................................................................................... 55
Kết quả: ........................................................................................................................................ 55
2.5.3.2. Nhuộm bào tử .............................................................................................................. 55
2.5.3.3. Thử nghiệm Catalase ................................................................................................ 56
2.5.3.4. Thử nghiệm khả năng sinh acid ............................................................................. 56
2.5.3.5. Thử nghiệm khả năng di động ................................................................................ 57
2.5.3.6. Thử nghiệm khả năng lên men đường và khả năng sinh khí .......................... 57


6


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
FDA

Fructose-bisphosphate aldolase

ATP

Adenosin triphosphat

LAB

lactic acid bacteria /Lactobacillales

DNA

Deoxyribonucleic acid

rRNA

ribosomal Ribonucleic acid

MRS

de Man, Rogosa and Sharpe

Bảng 1.7. Phân lập vi khuẩn lactic với khả năng ức chế độc tố sinh trưởng của nấm
mốc và nấm men ........................................................................................................... 43
Bảng 1.8. Các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn lactic có tính kháng sinh.
(Holzapfel và cộng sự, 1995) ........................................................................................ 44
Bảng 2.1: Kí hiệu các nguồn phân lập.......................................................................... 53
Bảng 3.1: Bảng kí hiệu các chủng vi khuẩn phân lập .................................................. 68
Bảng 3.2: Hình thái khuẩn lạc dưới kính hiển vi x4 và hình thái vi khuẩn dưới kính
hiển vi x100 ................................................................................................................... 73
Bảng 3.3: Kết quả của các thí nghiệm dùng để định danh vi khuẩn ............................ 81
Bảng 3.4: %Acid lactic của 17 chủng vi khuẩn phân lập được................................... 83
Bảng 3.5: Bảng xử lý số liệu khả năng sinh acid và giá trị OD của các chủng phân lập
từ Nem chua .................................................................................................................. 84
Bảng 3.6: Bảng xử lý số liệu khả năng sinh acid và giá trị OD của các chủng phân lập
từ Cơm mẻ ..................................................................................................................... 85
Bảng 3.7: Phân nhóm các chủng vi khuẩn lactic.......................................................... 85
Bảng 3.8: Tổng khả năng kháng nấm của các chủng vi khuẩn .................................... 89
Bảng 3.9: Bảng xử lý số liệu khả năng kháng nấm của các chủng phân lập từ Nem
chua ............................................................................................................................... 90
8


Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.10: Bảng xử lý số liệu khả năng kháng nấm của các chủng phân lập từ Cơm
mẻ .................................................................................................................................. 91
Bảng 3.11: Kí hiệu các thành phần của thí nghiệm ...................................................... 92
Bảng 3.12: Khả năng kháng nấm của Nghiệm thức 1 – Canh trường nuôi cấy và
Nghiệm thức 2 – Canh trường nuôi cấy + Chitosan 0.4% ứng dụng trên đậu phộng... 93
Bảng 3.13: Kết quả kiểm nghiệm Tổng số vi sinh vật hiếu khí và Coliform ............... 97


Hình 3.9: Vi khuẩn E.Coli không sinh bào tử .............................................................. 78
Hình 3.10: Mẫu Vi khuẩn phân lập không sinh bào tử ................................................ 79

1
0


Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.11: Thử nghiệm khả năng lên men đường........................................................ 80
Hình 3.12: Vi khuẩn Lactobacillus L5 có khả năng lên men đường ........................... 81
Hình 3.13: Đồ thị biểu hiện % acid lactic của 17 chủng khuẩn sau 24 giờ nuôi cấy ... 84
Hình 3.14: Khả năng đối kháng nấm CĐP2 của LN4-2 sau 3 ngày ............................ 87
Hình 3.15: Khả năng đối kháng nấm ĐN3 của LN4-2 sau 3 ngày .............................. 87
Hình 3.16: Khả năng đối kháng nấm ĐN3 của LC1-1 sau 3 ngày .............................. 88
Hình 3.17: Khả năng đối kháng nấm ĐN2 của LC1-1 sau 3 ngày .............................. 88
Hình 3.18: Đồ thị biểu thị Tổng khả năng kháng nấm của các chủng vi khuẩn .......... 89
Hình 3.19: Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của Chủng L9B-LC1-1 (Từ trái
qua: Ngày 1, ngày 3, ngày 5, ngày 7, ngày 9, ngày 13) ................................................
95
Hình 3.20: Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của Chủng L11-LN4-2 (Từ trái
qua: Ngày 1, ngày 3, ngày 5, ngày 7, ngày 9, ngày 13) ................................................
96
Hình 3.21: Kết quả tổng số vi sinh vật hiếu khí của TN1-canh trường nuôi cấy (Từ trái
-2

-3

-4


1


Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Ngày xưa, con người chỉ quan tâm đến việc ăn sao cho no, mặc sao cho đủ. Thế
nhưng, ngày nay, cùng với sự phát triển của xã hội, nhu cầu của con người cũng được
nâng cao. Con người bắt đầu đặc biệt quan tâm đến sức khỏe hơn, thay vì ăn cho no thì
họ bắt đầu lựa chọn những thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, có lợi cho sức khỏe.
Vì vậy, vấn đề về vệ sinh an toàn thực phẩm là vấn đề quan trọng hàng đầu ở mỗi quốc
gia, nó liên quan đến đời sống hàng ngày cũng như sức khỏe của con người. Theo
thống kê gần đây của ngành Y tế, ngộ độc thực phẩm có nguy cơ tăng dần và ngày
càng phức tạp. Nguyên nhân chính dẫn đến ngộ độc thực phẩm phần lớn có nguồn gốc
từ các vi sinh vật hoặc nấm gây bệnh hiện diện trong thực phẩm, nước uống…
Xã hội ngày càng phát triển nên con người luôn phải chạy theo sự phát triển đó.
Cuộc sống của họ trở nên bận rộn hơn, họ bắt đầu “sống vội” hơn. Thay vì sử dụng các
thực phẩm xanh, sạch thì con người lại chọn những thực phẩm chế biến sẵn mà không
biết hầu hết chúng đều được bảo quản bằng chất hóa học. Bản thân thực phẩm cũng có
thể chứa các mầm bệnh là nguyên nhân trực tiếp gây ra các dịch bệnh hiện nay. Mặc dù
áp dụng tiến bộ kỹ thuật trong công nghệ và quy phạm vệ sinh an toàn thực phẩm
(GMP, HACCP…), nhưng nguy cơ nhiễm các vi sinh vật gây bệnh trong quá trình chế
biến thực phẩm ngày càng gia tăng (Besselink, et al., 2008). Chính vì thế, các cơ sở sản
xuất thực phẩm phải dùng đến các chất bảo quản hóa học. Mặc dù, nếu chúng được sử
dụng với liều lượng cho phép nhưng các chất phụ gia này vẫn gây ra các tác dụng
không mong muốn cho người tiêu dùng. Nhưng còn có rất nhiều trường hợp, do lợi
nhuận, các nhà sản xuất còn sử dụng các loại hóa chất bị nghiêm cấm để có thể tăng
hương vị sản phẩm hoặc kéo dài được hạn sử dụng hơn. Có thể nói: Hiện nay con
người dường như đang sống cùng hóa chất và sức khỏe con người đang đứng trước bờ

Phân lập và chọn lọc dòng vi khuẩn Lactobacillus plantarum 21B có khả năng
kháng nấm. (Lavermicocca et al.., 2000)


Khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic (Magnusson J., 2003)
Hoạt động kháng nấm của vi khuẩn Lactobacillus paracasei (Hassan et al.., 2008)
Ngoài ra còn có nhiều công trình nghiên cứu về hoạt động kháng nấm của vi
khuẩn lactic ở nhiều nước trên thế giới.
2.2. Trong nước
Nguyễn Hoài Hương, Đoàn Kim Như (2013). Phân lập tuyển chọn vi khuẩn lactic
từ nem chua truyền thống làm giống khởi động lên men nem chua. Tạp chí Khoa học
và công nghệ (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam), 51: 200-204
Phân lập và khảo sát vài đặc điểm phân loại của vi khuẩn lactic, muối chua nấm
rơm (Hồng Thị Hiền, 1998)
Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm vi khuẩn lactic có hoạt tính sinh học và chế phẩm
tỏi trong sản xuất thịt lên men (nem chua- xúc xích lên men) (Nguyễn Thị Lan Phương,
2012)
Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng sinh chất kháng khuẩn (Ngô
Thị Phương Dung, 2011)
Phân lập vi khuẩn Lactobacillus thuần từ tự nhiên để sản xuất măng tre lên men
chua (Nguyễn Văn Chương, 2008)
3. Mục tiêu nghiên cứu
Phân lập các chủng vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả
năng kháng nấm nhiễm thực phẩm. Mục tiêu cuối cùng là tuyển chọn được chủng vi
khuẩn lactic có khả năng tăng sinh mạnh và kháng nấm tốt.
4. Mục đích nghiên cứu
Cung cấp chủng vi khuẩn lên men lactic có khả năng tăng sinh mạnh và kháng
nấm cao được phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống cho phòng thí nghiệm bộ
môn Công nghệ sinh học, khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường.
5. Nhiệm vụ nghiên cứu


 Đánh giá sơ bộ khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic khi ứng dụng trên đậu
phộng.
8. Kết cấu đồ án
Mở đầu
Chương 1: Tổng quan tài liệu – nội dung chương đề cập đến các nội dung liên
quan đến tài liệu nghiên cứu
Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu – nội dung chương đề cập đến
các dụng cụ, thiết bị và các phương pháp nghiên cứu trong đồ án.
Chương 3: Kết quả và biện luận – nội dung chương đưa ra những kết quả mà đề
tài thực hiện được và đưa ra những biện luận cho kết quả thu được.
Kết luận và kiến nghị – nội dung chương tóm lại những kết quả mà đề tài đạt
được và đề nghị cho những hướng cải thiện thêm trong đề tài.


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về nấm
1.1.1. Giới thiệu chung
Giới nấm (tên khoa học: Fungi) bao gồm những sinh vật nhân chuẩn tự dưỡng có
thành tế bào bằng chitin. Phần lớn nấm phát triển dưới dạng các dạng sợi đa bào được
gọi là sợi nấm (hyphae) tạo nên hệ sợi (mycelium). Nấm thường sinh sản qua bào tử
hoặc qua hình thức sinh sản tự dưỡng. Quá trình sinh sản có thể là vô tính hay hữu tính.
Những đại diện tiêu biểu của nấm là nấm mốc, nấm men và nấm lớn (nấm quả
thể). Phần lớn các nấm thường không quan sát được bằng mắt thường. Đa phần chúng
sống trong đất, chất mùn, xác sinh vật chết, cộng sinh hoặc kí sinh trên cơ thể động vật,
thực vật và nấm khác. Vi nấm đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái, chúng phân
hủy các chất hữu cơ và không thể thiếu được trong chu trình chuyển hóa và trao đổi vật
chất.
1.1.2. Độc tố nấm
Độc tố nấm mốc (mycotoxin) là nhóm hợp chất có cấu trúc đa đạng, có khối

Ngoài Aflatoxin, một số độc tố vi nấm thường gặp là ochratoxin Penicillium và
Aspergillus tiết ra. Độc tố zearalemon và tricothecenes chủ yếu do nấm Fusarium tiết,
độc tố patulin lại do nấm Penicillium và Fumonisin tiết.
1.1.3. Tác hại của nấm
1.1.3.1. Tác hại của nấm gây ra cho người và động vật
 Dị ứng hoặc ngộ độc do ăn hoặc tiếp xúc với nấm.
Có khoảng 70 loài nấm sinh bào tử là những tác nhân gây dị ứng. Chúng có thể là
nấm mốc trong nhà hay ngoài trời, đa phần là nấm sợi như các chi Alternaria,
Aspergillus, Cladosporium, Helminthosporium, Epicoccum, Penicillium, Fusarium...,
chỉ có vài loài là nấm đơn bào như Candida, Rhodotorula,có một số loài là nấm lớn
như Agaricus, Coprinus, Fomes, Ganoderma...Bào tử nấm có thể gây ra những chứng
như hen suyễn, viêm mũi dị ứng, các bệnh nấm dị ứng phế quản phổi và viêm phổi quá
mẫn. Ngộ độc do ăn phải nấm độc, có thể từ rối loạn tiêu hoá, ảo giác, hoặc trầm trọng
có thể tử vong.
 Nấm kí sinh trên cơ thể người gây bệnh trực tiếp.
Những loài có thể gây bệnh cho người thuộc các chi như Aspergillus, Candida,
Cryptococcus, Histoplasma và Pneumocystis. Chúng có thể gây ra các bệnh ngoài da ở
người như nấm chân, nấm móng, nấm tóc, hắc lào, lang ben,… cho đến những bệnh


nguy hiểm có thể gây chết người như viêm màng não (nấm Cryptococcus) hay viêm
phổi do nấm Pneumocystis carinii.
1.1.3.2. Tác hại của nấm gây ra cho thực vật
Những loài nấm gây bệnh trên cây trồng có thể gây thiệt hại lớn cho ngành nông
nghiệp và lâm nghiệp.Ví dụ như nấm đạo ôn (Magnaporthe oryzae)gây bệnh cho
lúa.Những loài gây bệnh cho cây thuộc các chi Fusarium, Ustilago, Alternaría và
Cochliobolus. Chúng làm thối rễ, tổn thương các bộ phận của cây trồng, hoa, quả, làm
giảm năng suất hoặc chất lượng sản phẩm nông nghiệp do bị ẩm mốc,...
1.1.4. Một số chủng nấm gây độc trong thực phẩm
Trong hệ vi khuẩn, nấm mốc thiên nhiên (fungal flora) có 3 chủng giống nấm

cao có thể gây tổn thương não và chết. Qua thử nghiệm trên động vật nuôi trong nhà đã
xác định có một số độc tố vi nấm gây rối loạn tới sự sao chép DNA và gây hậu quả là
đột biến hoặc quái thai.
1.2. Tổng quan về vi khuẩn lactic
1.2.1. Giới thiệu vi khuẩn lactic
1.2.1.1. Giới thiệu chung
Từ lâu vi khuẩn lactic đã được con người ứng dụng rộng rãi để chế biến các loại
thức ăn chua (sữa chua, muối dưa, muối cà,...), ủ chua thức ăn cho gia súc hoặc để sản
xuất acid lactic và các loại muối của acid lactic. Từ năm 1780, lần đầu tiên nhà hóa học
người Thụy Điển Scheele đã tách được acid lactic từ sữa bò lên men chua. Năm 1875,
L.Pasteur đã chứng minh được rằng việc làm sữa chua là kết quả hoạt động của một
nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic. 21 năm sau đó (1878), Lister đã phân
lập được vi khuẩn lactic và đặt tên là Bacterium lactic (ngày nay gọi là Streptococcus
lactic) và đến năm 1881 ngành công nghiệp lên men nhờ vi khuẩn lactic đã được hình
thành.


Vi khuẩn lactic có vai trò quan trọng trong công nghiệp sữa, muối chua rau quả,
làm yaourt,... cũng như trong nông nghiệp và dược phẩm. Và một đặc tính quan trọng
khác của vi khuẩn lactic là chúng có khả năng tạo ra bacteriocin (chất kháng khuẩn)
như lactacin, brevicin, lacticin, helveticin, sakacin, plantacin,... có tác dụng ức chế một
số vi sinh vật gây bệnh, ngăn chặn sự phát triển của các nguồn bệnh trong thực phẩm
(Batt, 1999; Dubernet et al., 2002).
Vi khuẩn lên men lactic gọi là vi khuẩn lactic, chúng được Pasteur tìm ra từ sữa
bị chua và hiện nay chúng được công nhận là an toàn sinh học (generally recognized as
safe - GRAS), được sử dụng thường xuyên trong thực phẩm và có đóng góp trong hệ vi
sinh vật có ích của con người.
1.2.1.2. Khái niệm
Vi khuẩn lactic là một nhóm các vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, có khả
năng lên men đường để tạo acid lactic, có một sự thống nhất về hình thái, đặc điểm



Hình 1.1: Cây phát sinh loài của vi khuẩn lactic. (Owen R. Fennema et al. 2004)

Trong đó: - Khoảng cách tiến hóa gần bằng nhau.
- Trong đó nhóm được đống khung là nhóm vi khuẩn được xem là an
toàn với con người.
1.2.1.3. Đặc tính chung
Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, catatalase âm
tính và là vi khuẩn kỵ khí chịu oxy (aerotolerant organisms), trao đổi chất chủ yếu bằng
con đường lên men và không hô hấp do không có cytochromes, chỉ trừ giống
Bifidobacterium là kỵ khí bắt buộc. Vi khuẩn lactic có thể lên men các loại đường
monosaccharide và disaccharide nhưng không phải tất cả các vi khuẩn lactic đều lên
men được bất kỳ loại disaccharide nào, một số không lên men được saccharose, một số


không sử dụng được lactose, các vi khuẩn lactic không lên men được tinh bột (trừ
chủng Lactobacillus delbruceckii) và các polysaccaride khác.
Theo khóa phân loại của Bergey 1986 giới thiệu về các giống của vi khuẩn lactic,
thì có 5 giống phù hợp với mô tả chung về vi khuẩn lactic: Streptococcus, Pediococcus,
Lactobacillus, Leuconostoc, Aerococcus. Trước đây giống Bifidobacterium cũng được
xếp vào nhóm vi khuẩn lactic trong khóa phân loại của Bergey 1957, trong đó chúng
được xem là Lb. bifidum mặc dù Bifidobacterium không phù hợp với các mô tả chung
của vi khuẩn lactic mà chúng liên quan nhiều hơn đến nhóm Actinomycetaceae một
nhóm vi khuẩn gram dương và có con đường lên men đường khác với vi khuẩn lactic.
Trong 5 giống thuộc vi khuẩn lactic thì có 4 giống được mô tả và nghiên cứu
nhiều nhất đó là: Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus, Leuconostoc. Đây là
những trực khuẩn hoặc cầu khuẩn không sinh bào tử. Tất cả vi khuẩn lactic đều không
chuyển động, gram dương, hô hấp yếm khí tùy nghi.
Đường kính của các dạng cầu khuẩn lactic từ 0.5 – 1.5μm. Các tế bào hình cầu