- 1 -

B
B
Ộ
ỘG
G
I
I
Á
Á
O
OD
D
Ụ
Ụ
C
CV
V
À

Ọ
C
CĐ
Đ
À
ÀN
N
Ẵ
Ẵ
N
N
G
G 






6
0
0
.
.
5
5
4
4
.
.
0
0
2
2 T

NT
T
H
H
Ạ
Ạ
C
CS
S
Ĩ
ĨK
K
Ỹ
ỸT
T
H
H
U

phần vỏ ngoài, hoàn toàn không có hương thơm. Hương và màu sắc
của hạt cà phê chúng ta cảm nhận ñược chỉ hình thành sau khi “ủ”. Ủ
là quá trình lên men yếm khí nhờ hệ vi sinh vật tự nhiên bao gồm:
nấm men, nấm mốc và vi khuẩn. Trong ñó, nấm men và vi khuẩn
lactic là hai tác nhân vi sinh vật có vai trò quan trọng quyết ñịnh ñến
chỉ tiêu chất lượng về hương vị của hạt cà phê sau lên men. Nhiều
nghiên cứu khẳng ñịnh sự có mặt của nấm mốc, nấm men, vi khuẩn
(lactic, axetic, coliform) và một số vi khuẩn gram âm. Trong ñó,
nhiều chủng vi khuẩn lactic trong khối hạt ủ ñược phân lập và ñịnh
tên.
Xuất phát từ bản chất của quá trình lên men yếm khí quả cà
phê tươi xảy ra trong hệ thống tiêu hóa của con chồn, chúng tôi chọn
vi khuẩn lactic làm ñối tượng nghiên cứu quá trình lên men trên quả
cà phê tươi sau thu hoạch, nhằm góp phần “công nghiệp hóa” giai
ñoạn lên men, cải thiện chất lượng về hương vị thay vì chỉ lên men cà
phê thóc như hiện nay. Vì mục ñích ñó, chúng tôi chọn ñề tài:
“Nghiên cứu vai trò của vi khuẩn lactic trong quá trình lên men
tạo hương cà phê hạt tươi”. - 3 -2. Mục ñích nghiên cứu.
- Nghiên cứu vai trò của vi khuẩn lactic tham gia vào quá
trình tạo hương dựa trên khả năng chuyển hoá ñường tạo thành các
axit hữu cơ. Sản phẩm axit hữu cơ tham gia phản ứng este với rượu –
sản phẩm tạo hương chính cho cà phê nhân.
- Lựa chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng chuyển
hóa ñường mạnh ñể ứng dụng cho quá trình lên men cà phê hạt tươi.

huyện EaH’leo, Daklak.
6. Cấu trúc luận văn.
Luận văn gồm các phần:
Mở ñầu.
Chương 1: Tổng quan tài liệu.
Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu.
Chương 3: Kết quả và thảo luận
Kết luận và kiến nghị
Tài liệu tham khảo
Phụ lục. - 5 -Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về cây cà phê.
1.1.1. Nguồn gốc.

1.5.1. Khả năng tạo hương của vi khuẩn lactic.
1.5.2. Một số hợp chất tạo hương trong cà phê.
1.6. Quy trình lên men cà phê thóc.
1.7. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước thuộc lĩnh
vực của ñề tài.
1.7.1. Những nghiên cứu ngoài nước.
1.7.2. Những nghiên cứu trong nước.
- 7 -

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả lựa chọn môi trường.
Phương pháp thực hiện theo mục…, tất cả các khuẩn lạc nghi
ngờ là vi khuẩn lactic như hình dáng khuẩn lạc tròn, nhỏ, màu trắng
hay vàng ngà mọc trên ñĩa petri có chứa môi trường MRS II, MRS
III, MRS IV, MRS V ñược phân lập và thuần chủng. Các chủng ñược
ñem nuôi cấy trong môi trường MRS lỏng có bổ sung nước vắt và
tiến hành ño OD sau 48h. Ký hiệu các khuẩn lạc là C
1
, C
2
, C
3
, C
4
, C
5
,
C
6
, C
7
, C
8
, C
9
, C
10

5
373 273 284 246 236
6 C
6
287 263 283 239 233
7 C
7
321 291 310 287 270
8 C
8
310 289 300 276 270
9 C
9
293 261 254 233 231
10 C
10
303 280 291 289 277
11 C
11
288 270 275 261 254
12 C
12
305 289 295 269 260 - 9 -

13 C
13
320 295 308 289 251

, C
11
, C
12
, C
13

ñược thử catalase, nhuộm màu Gram và quan sát hình dạng tế bào
theo phương pháp ở mục 2.2.3 chương 2. Kết quả ñược trình bày ở
bảng sau:
Bảng 3.2: Đặc ñiểm hình thái các chủng vi khuẩn phân lập
từ cà phê lên men
Chủng

Hình thái khuẩn lạc
Hình dạng

tế bào
Nhuộm
Gram
Catalase

C
1
Màu trắng sữa, tròn, lồi,
mép phẳng.
Hình oval + +
C
2


6

Tròn, bề mặt trơn, mép
răng cưa.
Hình que
ngắn
+ -
C
7

Trắng trong, mép nhẵn, bề
mặt lồi
Hình chuỗi - +
C
8

Trắng sữa, bề mặt xù xì,
mép lượn sóng.
Hình chuỗi + +
C
9

Trắng sữa, nhân hơi vàng,
cấu trúc ñồng nhất
Que ngắn,
mảnh
+ -
C
10
Trắng ñục, ñều, không lồi.

, C
13
(Catalase ( - ); gram (+)).
Các chủng này ñược thử khả năng chuyển hóa ñường thành
axit lactic, từ ñó lựa chọn các chủng có khả năng chuyển hóa ñường
cao.
3.3. Khả năng chuyển hóa ñường thành axit lactic và khảo
sát ñộng thái sinh trưởng của các chủng vi khuẩn .
3.3.1. Kết quả ñịnh tính khả năng sinh axit lactic. - 11 -

Kết quả cho thấy tất cả 7 chủng phân lập C
3
, C
4
, C
5
, C
6
, C
9
,
C
12
, C
13
có khả năng tạo axit lactic (làm chuyển màu tím của dung
dịch thuốc thử sang màu vàng chanh như mẫu ñối chứng). Xin xem

Chủng
24h 48h 72h 96h
1 C
3
34,78

88,39

82,80

64,42

2 C
4
89,47

120,63

115,80

114,87

3 C
5
112,72

142,74

158,80


144,17

7 C
13
55,99

120,90

120,30

118,88

- 12 -Từ bảng kết quả thực nghiệm, chúng tôi nhận thấy các chủng
C
5
, C
12
có khả năng sinh axit lactic cao nhất, vì vậy, chúng tôi chọn 2
chủng ñó ñể tiếp tục khảo sát ñộng thái sinh trưởng.
3.3.3. Khảo sát ñộng thái sinh trưởng của 2 chủng vi khuẩn
lựa chọn.

100
150
200
250
300
350
400
OD
386nm
C5
11
172
276
310
320
332
337
C12
8
165
293
325
336
343
345
0h 12h 24h 36h 48h 60h 72h- 13 -


(CFU/ml)
18 x 10
7
51 x 10
8

Vậy, sau 36h nuôi cấy trên môi trường MRS III, sinh khối vi
sinh vật ñạt giá trị cao nhất và tại thời ñiểm ñó, chủng C
5
tương ứng
số tế bào là 18x10
7
và C
12
là 51x10
8
. Chúng tôi chọn thời ñiểm này
bổ sung vào khối lên men cà phê hạt.
3.4. Nghiên cứu khả năng tạo este của các chủng giống.
3.4.1. Nuôi cấy thuần chủng.
3.4.1.1. Bố trí thí nghiệm.
- Mẫu M
1
, M
2
là các mẫu cà phê có bổ sung vi khuẩn tương
ứng là C
5
, C
12

hóa ñường của hai chủng C
5
và C
12
khi nuôi cấy hỗn hợp như thế
nào, chúng tôi ñã tiến hành lên men hỗn hợp hai chủng này và so
sánh với mẫu ñối chứng là mẫu không bổ sung vi khuẩn.
3.4.2. Nuôi cấy hỗn hợp chủng vi khuẩn C
5
, C
12
.
3.4.2.1. Bố trí thí nghiệm.
M
1
: mẫu bổ sung hỗn hợp vi khuẩn C
5
: C
12
(1:1).
M
2
: Mẫu ñối chứng là mẫu không bổ sung vi khuẩn.
3.4.2.2. Kết quả
229.75a
222.08b
212.38c

5
và C
12
vào khối lên men, chỉ số este (239,86) cao hơn
so với mẫu ñối chứng (208,15) và mẫu chỉ bổ sung giống thuần
chủng(229,75).
Như ñã biết, vi khuẩn lactic lên men dị hình sản phẩm chủ yếu
tạo ra là axit lactic. Theo lý thuyết, phản ứng este chỉ xảy ra khi có
mặt của axit và rượu. Do ñó, ñể có ñược lượng rượu cao phân tử cao
trong quá trình lên men có ñịnh hướng, chúng tôi sử dụng phương án
sử dụng hỗn hợp hai chủng vi khuẩn C
5
và C
12
cùng với nấm men
rượu vang (từ bộ sưu tập giống của viện Công nghệ sinh học quốc
gia) ñể ñánh giá khả năng tạo este. Quá trình thực nghiệm và kết quả
ñược trình bày ở hình 3.8 và 3.9.
3.4.3. Nuôi cấy hỗn hợp chủng vi khuẩn C
5
, C
12
với nấm
men.
3.4.3.1. Bố trí thí nghiệm.
239.86
208.15
190
200
210Hìn
Hình 3.9: Khả năng tạo este của hỗn hợp vi khuẩn và nấm men
Kết quả cho thấy, mẫu bổ sung nấm men có chỉ số este cao hơn
mẫu không bổ sung (380,11>243,56). Chúng tôi chọn mô hình này ñể
nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng ñến chỉ số este.
3.5. Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng ñến chỉ số este.
3.5.1. Nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ hỗn hợp vi khuẩn bổ sung
lên men ñến chỉ số este.
Để xác ñịnh tỷ lệ vi khuẩn thích hợp cho hạt cà phê sau lên
men có hàm lượng este cao, chúng tôi tiến hành bổ sung hỗn hợp vi
khuẩn/khối lượng cà phê hạt tươi lên men ứng với các tỷ lệ 2%, 4%,
6%, 8%.
3.5.1.1. Bố trí thí nghiệm.
243.56
380.11
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Chỉ số este
M4 M5

3.5.2.1. Chuẩn bị mẫu.
Để xác ñịnh tỷ lệ nấm men thích hợp bổ sung vào khối lên men
cà phê kết hợp với hỗn hợp vi khuẩn lactic cho hạt cà phê có hàm
311,05d
356,38b
369,72a
340,47c
280
290
300
310
320
330
340
350
360
370
Chỉ số este
2 4 6 8
Tỷ lệ vi khuẩn (%)- 18 -

lượng este cao, chúng tôi tiến hành bổ sung nấm men/ khối lượng hạt
cà phê ứng với các tỷ lệ 2%, 4%, 6%(v/w).
3.5.2.2. Kết quả.
Mẫu hạt cà phê sau khi lên men ñược ñem phân tích, kết quả
trình bày ở hình 3.13.


600
Chỉ số este
2 4 6 8
Tỷ lệ nấm men bổ sung (%)- 19 -

Để khảo sát ảnh hưởng thời gian lên men ñến chỉ số este chúng
tôi tiến hành lấy mẫu phân tích sau 3, 4 và 5 ngày lên men. Kết quả
phân tích ñược thể hiện ở hình 3.15.
3.5.3.2. Kết quả.
Hình 3.15. Ảnh hưởng thời gian lên men ñến chỉ số este
Từ kết quả thu ñược chúng tôi nhận thấy, sau 4 ngày lên men
chỉ số este ñạt cao nhất (531,23) trong 3 khoảng thời gian khảo sát.
Sau 5 ngày, chỉ số este có giá trị thấp nhất (489,17). Chính vì vậy,
chúng tôi chọn thời ñiểm dừng quá trình lên men là sau 4 ngày.
3.6. So sánh hiệu quả lên men tạo hương cà phê hạt tươi với

và nấm men
3.6.2. Kết quả.
Sau 4 ngày lên men, lấy mẫu hạt ñem rửa sạch và tiến hành
phân tích chỉ số este.
Kết quả thể hiện ở hình 3.17.
Hình 3.17. Chỉ số este theo hai phương pháp lên men.
Kết quả ở bảng biểu thể hiện chỉ số este của phương pháp lên
men cà phê thóc thấp hơn rất nhiều so với lên men cà phê hạt tươi
(211,15 <565,11)
Bằng việc phân lập, lựa chọn nguồn vi khuẩn lactic có sẵn
trong môi trường lên men cà phê tự nhiên và ứng dụng trở lại ñể chủ
ñộng cho quá trình lên men tạo hương, sau khi khảo sát thực nghiệm,
chúng tôi nhận thấy rằng việc lên men cả vỏ có bổ sung nguồn vi
khuẩn kết hợp với nấm men thì chỉ số este của hạt cà phê nhân sau
211,15
565,11
0
100

băng tải (mùa mưa) ñể ñưa cà phê thóc về ñộ ẩm an toàn (< 15%). - 22 -

• Sơ ñồ quy trình.


- 23 -

3.8. Ứng dụng lên men cà phê hạt tươi tại huyện EaH’leo -
Daklak
Từ quy trình ñề xuất, chúng tôi ứng dụng lên men cà phê hạt
tươi tại huyện EaH’leo – Daklak theo quy mô pilot và so sánh với
quy trình lên men hiện nay trên chỉ tiêu este.
Hình 3.20. Chỉ số este theo hai quy trình lên men
Dựa vào kết quả và bảng biểu chúng ta nhận thấy, ở mẫu M
1
là
mẫu lên men hạt cà phê sau khi ñã xát vỏ ( như quy trình sản xuất
hiện nay) có chỉ số este thấp hơn nhiều so với mẫu lên men quả cà
phê tươi bổ sung hỗn hợp vi khuẩn và nấm men (quy trình ñề xuất).
Điều ñó có thể giải thích ñược là do trong mẫu M
2
, chúng tôi ñem lên
men cả quả cà phê có bổ sung hỗn hợp vi khuẩn và nấm men, nên
toàn bộ chất dinh dưỡng trong vỏ quả ñược chúng sử dụng cho quá
trình sinh tổng hợp và chuyển hóa thành những sản phẩm trao ñổi

trường dinh dưỡng MRS cơ bản bổ sung 10ml nước vắt cà phê) nhằm
nuôi sinh khối các chủng vi khuẩn lactic phân lập từ cà phê hạt tươi
lên men tự nhiên, giúp chúng có khả năng thích ứng tốt với môi
trường lên men từ cà phê hạt tươi.
2. Phân lập ñược 7 giống vi khuẩn lactic có khả năng chuyển
hóa ñường thành axit lactic. Từ 7 chủng ñã tuyển chọn ñược 2 chủng
C
5
và C
12
có khả năng chuyển hóa ñường thành axit lactic cao (158,8
và 165,1 mg/l).
3. Bổ sung hỗn hợp hai vi khuẩn C
5
, C
12
với nấm men ñể lên
men cà phê hạt tươi cho hạt cà phê nhân có chỉ số este (380,11) cao
hơn khi chỉ bổ sung vi khuẩn ở dạng ñơn (222,08 và 229,75) là 40 –
42%, và dạng hỗn hợp hai vi khuẩn (239,86) là 37%.
4. Tỷ lệ giữa vi khuẩn lactic và nấm men rượu vang sử dụng
trong nghiên cứu là 6 : 2 (theo v/w) ñể lên men tạo hương ñạt chỉ số
este cao nhất (528,12) ứng với thời gian sau 4 ngày lên men.
5. Phương pháp lên men cà phê hạt tươi ñược bổ sung bằng hỗn
hợp vi khuẩn với nấm men thì chỉ số este của cà phê nhân tăng 63%
so với phương pháp lên men hạt cà phê xát vỏ.
6. Đề xuất quy trình lên men cà phê hạt tươi có bổ sung hỗn
hợp vi khuẩn lactic với nấm men và ứng dụng tại huyện EaH’leo -
thực nghiệm còn tạo ra những sản phẩm gì góp phần tạo hương cà
phê nhân cũng rất cần ñược xác ñịnh.