TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

HOÀNG THỊ NHUNG

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC
HỢP CHẤT STEROID TỪ DỊCH CHIẾT METHANOL
CÂY THẠCH VĨ (Pyrrhosia Lingua (Thunb.)Farwell)
HỌ DƯƠNG XỈ (Polypodiaceae)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Ngành: Sư phạm Hóa học

Phú Thọ, 2017


TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

HOÀNG THỊ NHUNG

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC
HỢP CHẤT STEROID TỪ DỊCH CHIẾT METHANOL
CÂY THẠCH VĨ (Pyrrhosia Lingua (Thunb.) Farwell)
HỌ DƯƠNG XỈ (Polypodiaece)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Ngành: Sư phạm Hóa học

NGƯỜI HƯỚNG DẪN: 1.ThS. Nguyễn Thị Bình Yên
Trường Đại học Hùng Vương

-i-

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ............................................ iii
DANH MỤC CÁC BẢNG................................................................................ v
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Lý do lựa chọn đề tài ................................................................................. 1
2. Mục tiêu của đề tài ..................................................................................... 2
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ................................................... 2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3
1.1 Giới thiệu về chi Pyrrhosia ..................................................................... 3
1.2 Đặc điểm thực vật loài Thạch vĩ .............................................................. 4
1.3 Các nghiên cứu về hóa thực vật chi Pyrrhosia của Việt Nam ................ 5
1.4 Sơ lược về lớp chất steroid ...................................................................... 5
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU .................................................................................................................. 8
2.1 Đối tượng nghiên cứu.................................................................................. 8
2.2 Nguyên vật liệu và thiết bị ....................................................................... 8
2.2.1 Nguyên vật liệu .................................................................................. 8
2.2.2 Thiết bị nghiên cứu ............................................................................ 9
2.3 Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 11
2.3.1 Phương pháp ngâm chiết ................................................................ 11
2.3.2 Phương pháp sắc ký ........................................................................ 12
2.3.3 Phương pháp phổ hồng ngoại ......................................................... 15
2.3.4 Phương pháp phổ khối lượng .......................................................... 15
2.3.5 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân(NMR) ......................... 16
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................ 19
3.1 Quá trình điều chế cặn dịch chiết MeOH cây Thạch vĩ ........................ 19
3.2 Quá trình phân lập các chất từ dịch chiết MeOH cây Thạch vĩ ............ 20
3.2.1 Khảo sát thành phần định tính và lựa chọn dung môi .................... 20

13

C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy: Phổ cộng
hưởng từ hạt nhân carbon 13

DEPT
s: singlet

Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer: Phổ DEPT
d: doublet

t: triplet

m: multiplet

❖ Tên của các hợp chất được viết theo nguyên bản Tiếng Anh


-iv-

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Hình ảnh cây Thạch vĩ ...................................................................... 4
Hình 1.2. Cấu tạo khung steroid ....................................................................... 6
Hình 2.1. Cây Thạch vĩ (tại Lâm Thao) ............................................................ 8
Hình 2.2. Máy cất quay chân không ................................................................. 9
Hình 2.3. Cột sắc ký với kích thước khác nhau .............................................. 10
Hình 2.4. Bộ chưng cất dung môi ................................................................... 10
Hình 2.5. Máy soi UV ..................................................................................... 11
Hình 2.6: Hộp thủy tinh chạy bản mỏng ......................................................... 11
Hình 2.7.Sơ đồ chung của phương pháp ngâm chiết ...................................... 12

nhiên, không chỉ chữa khỏi bệnh mà còn giúp cơ thể phòng bệnh như cây
Trinh nữ hoàng cung, cây Giác đế, cây Lược vàng, cây Thạch vĩ,...
Ngày nay, việc dùng các loài thuốc có nguồn gốc tự nhiên ngày càng
được ưa chuộng và các công trình nghiên cứu về chúng cũng ngày càng phát
triển.Cùng với sự phát triển của công nghệ tổng hợp hóa dược tạo ra các biệt
dược, các nhà khoa học vẫn đang cố gắng tìm hiểu, khám phá các hoạt tính
sinh học khác nhau của các hợp chất có nguồn gốc từ nhiều loài thực vật khác
nhau.
Việt Nam là nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, lượng mưa
lớn, độ ẩm tương đối cao, nhiệt độ trung bình tháng trên 18 0C lượng mưa
trung bình từ 1000-1500 mm . Với diện tích tự nhiên lên đến 331.212 km2 và
những đặc thù về khí hậu thiên nhiên đã tạo nên sự đa dạng sinh học cao trong
thành phần các loài thực vật. Trên cơ sở các tài liệu đã công bố của các nhà
sinh vật Việt Nam, được tổng hợp từ những tài liệu đáng tin cậy, trên toàn
lãnh thổ Việt Nam hiện có tới 19.375 loài thực vật trong đó có tới khoảng
13.000 loài hạt kín. Trong số 13.000 loài hạt kín nói trên, theo thống kê của
Viện Dược liệu Việt Nam, hiện biết có khoảng 4.000 loài được sử dụng làm
thuốc chữa bệnh theo kinh nghiệm dân gian và đông y; đã và đang là điều
kiện tốt để mở ra và phát triển hơn nữa tiềm năng nghiên cứu về các hợp
chất tự nhiên từ các loài thực vật của Việt.
Chi Pyrrhosia ở Việt Nam có 17 loài ví dụ như Pyrrhosia Lingua,
Pyrrosia Sheareri, Pyrrosia Petiolosa, Pyrrosia Pekinesis,...và các loài này đã
và đang được sử dụng trong y học cổ truyền [1] mở ra tiềm năng nghiên cứu
hóa thực vật về các loài này.


-2-

Theo Từ điển thực vật thông dụng của tác giả Võ Văn Chi chỉ ra cho
thấy cây Thạch vĩ có chứa triterpenoid diploptene, steroid β–sitosterol. Gần

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Giới thiệu về chi Pyrrhosia
Pyrrhosia Mirb, họ Ráng – Polypodiaceae [Từ chữ Hy Lạp pyros; lửa; ổ
túi bào tử phủ kín mặt dưới phiến lá, nhìn xa nom như màu lửa] – Ráng tai
chuột, Thạch Vĩ.
Ổ túi bào tử tròn hoặc thuôn và xếp thành nhiều hàng, chéo gốc với gân
giữa và gần sát vào nhau, phủ gần kín mặt dưới của phiến lá. Có hai loại lông
hình sao, đều có cuống dài.
Gồm khoảng 100 loài, chủ yếu ở vùng ôn đới và nhiệt đới, một số ít loài
mọc ở châu Phi và Ôxtrâylia. Ở Việt Nam có 17 loài [1].
Pyrrhosia clavata (Baker) Ching - Ráng tai chuột. Loài này có ở Trung
Quốc, Lào và Việt Nam.
Pyrrosia lanceolata(L.) Farw. [P. adnascens (Sw.) Ching] – Ráng tai
chuột thường, Lưỡi mèo tai chuột. Phân bố Nam Trung Quốc và các nước
nhiệt đới châu Á. Ở nước ta, cây mọc phổ biến ở các miền núi, trung du và
đồng bằng.
Pyrrhosia lingua (Thunb.) Farwell. – Thạch vĩ, hay còn được gọi là
thạch bì, thạch lan, phi đao kiếm hay kim tinh thảo ráng hỏa mạc lưỡi,... Ráng
tai chuột lưỡi dao.Phân bố ở Nhật Bản, Đài Loan, Nam Trung Quốc và Việt
Nam. Ở nước ta, gặp nhiều nơi từ Cao Bằng, Lạng Sơn, Lào Cai, Phú Thọ, Hà
Tây, đến Thừa Thiên – Huế và Lâm Đồng.
Pyrrhosia mollis (G. Kunze) Ching – Ráng tai chuột mềm, Thạch vĩ
lông mềm. Phân bố ở Trung Quốc và nhiều nước nhiệt đới châu Á: Ấn Độ,
Mianma, Lào, Việt Nam, Inđônêxia, Phillipin. Ở nước ta, có gặp tại Lào Cai
(Sa Pa), Lâm Đồng (Đà Lạt).
Pyrrhosia piloselloides (L.) M. G. Price [Drymoglossum piloselloides
(L.) C. Presl] – Ráng tai chuột vẩy ốc. Phân bố ở Ấn Độ, Trung Quốc, Thái
Lan, Việt Nam, Inđônêxia, Phillippin và Iran. Ở nước ta có gặp từ Lạng Sơn,
Lào Cai, Quảng Bình, Quảng Nam, Bình Định tới Khánh Hòa và Lâm Đồng.


thấy cây Thạch vĩ có chứa steroid như β – sitosterol (1) [1].
Gần đây, năm 2016 nhóm tác giả Bùi Thị Thu Giang, Nguyễn Thị Sang
đã bước đầu công bố thành phần hóa học cây Thạch vĩ của Việt Nam. Trong
đó từ các dịch chiết EtOAc, n-Hexane đã phân lập được hỗn hợp β–sitosterol
và stigmasterol (2); hopane-22- ol (3).

1.4 Sơ lược về lớp chất steroid
Steroid là một loại hợp chất hữu cơ có chứa một sự sắp xếp đặc trưng
của bốn vòng cycloalkane được nối với nhau. Ví dụ về các steroid bao gồm
các chất béo ăn cholesterol, hormon sinh dục estradiol và testosterone, và
thuốc chống viêm dexamethasone. Lõi của steroid bao gồm 20 nguyên tử
cacbon liên kết với nhau mang hình thức của bốn vòng hợp nhất: ba vòng


-6-

cyclohexane (được xem như là vòng A, B, và C) và một vòng cyclopentane
(vòng D). Các steroid khác nhau đối với từng nhóm chức năng gắn liền với
cốt lõi bốn vòng và oxi hóa của các vòng.
Steroid là các hợp chất chất béo hữu cơ hòa tan có nguồn gốc tự nhiên
hoặc tổng hợp, có công thức từ 17 nguyên tử cacbon sắp xếp thành 4 vòng và
bao gồm cả các sterol và axit mật, thượng thận, và kích thích tố giới tính. Một
số steroid có nguồn gốc thiên nhiên như: hợp chất digitalis, và các tiền chất
của một số loại vitamine nhất định. Steroid rất đa dạng và phong phú, bao
gồm các hình thức của một số loại vitamine D, digitalis, sterol (ví dụ:
cholesterol) và các axit mật. Các sterol là các dạng đặc biệt của các steroid,
với một nhóm hydroxyl tại vị trí-3 và một khung lấy từ cholestane.Hàng trăm
steroid riêng biệt được tìm thấy ở thực vật, động vật và nấm. Tất cả các
steroid được sản xuất ở các tế bào từ các sterol lanosterol (động vật và nấm)
hoặc từ cycloartenol (thực vật). Cả lanosterol và cycloartenol lấy từ

2.2 Nguyên vật liệu và thiết bị
2.2.1 Nguyên vật liệu
Dung môi được sử dụng như n-hexane, CH2Cl2, EtOAc, MeOH, Acetone
đều là các hóa chất kỹ thuật của Việt Nam, Hàn Quốc được chưng cất lại
trước khi sử dụng. Các dung môi có độ phân cực tăng dần từ n-Hexan đến
MeOH như trong bảng sau [8]:


-9-

Bảng 2.1: Độ phân cực một số dung môi thông dụng
Dung môi

Nhiệt độ sôi

Độ phân cực

n-Hexan

69◦c

0,001

Diclomethan

41◦c

0,815

Etylacetat

-10-

đều là của Merck. Khối lượng silica gel nhồi cột gấp khoảng 30 lần lượng
chất (ví dụ: mchất=1g thì msilica gel=30g). Còn sắc ký lớp mỏng sử dụng bình sắc
ký lớp mỏng Camag của Đức và bản mỏng sắc ký tráng silicagel 60 F 254 trên
tấm nhôm 20 × 20 cm của Đức. Các lớp chất sẽ được thể hiện thông qua các
vệt màu trên bản mỏng nhờ thuốc thử Ceri sunfat (các vệt chất hiện màu
giống nhau sau khi nướng) hoặc thuốc thử Vanilin (các vệt chất hiện màu đặc
trưng).

Hình 2.3. Cột sắc ký với kích thước khác nhau
Dung môi sử dụng được chưng cất bằng bộ chưng cất dung môi của hãng
IKA: dung môi được cho vào bình chưng cất (thêm đá bọt) sau đó được làm
lạnh bằng hệ thống sinh hàn, ngưng tụ và chảy xuống eclen.

Hình 2.4. Bộ chưng cất dung môi


-11-

Hiện màu dưới bước sóng UV 254nm( bước sóng ngắn), 366nm( bước
sóng dài) được thực hiện trên hệ thống đèn UV CAMAG:

Hình 2.5. Máy soi UV
Hộp thủy tinh chạy bản mỏng:

Hình 2.6: Hộp thủy tinh chạy bản mỏng
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp ngâm chiết
Nguyên tắc tổng quát của phương pháp ngâm chiết là lựa chọn dung môi

một số dung môi thông dụng như n-hexane, CH2Cl2, EtOAc, Acetone, MeOH.
Thuốc thử hiện màu được sử dụng là Ceri sulfate, Vanalin.
Cách thực hiện: dùng cappira chấm các chấm nhỏ (mẫu chất được hòa
tan bằng dung môi) lên một điểm đã được cố định trên bản mỏng. Pha hệ
dung môi phù hợp, rồi chạy bản mỏng bằng hộp thủy tinh. Khi dung môi chạy
gần đến mép trên của bản mỏng thì dừng lại.
Cơ sở lý thuyết của phương pháp sắc ký silica gel nói chung là dựa trên
khả năng hấp phụ khác nhau của các chất trên silica gel (pha tĩnh) sẽ được
dung môi rửa giải (pha động) khi đi lên theo lực mao quản sẽ phân tách (giải
hấp) ở các vị trí khác nhau trên đường đi của dung môi. Chất có độ phân cực
kém hơn sẽ đi lên nhanh hơn chất có độ phân cực cao hơn.
Độ linh động của chất được đánh giá thông qua hệ số Rf.

Trong trường hợp minh họa trên:Rf(A) =

; Rf(B) =


-14-

Hai chất A, B được coi là tách riêng khỏi nhau khi triển khai sắc ký
TLC, Rf(A) ≠ Rf(B). Từ hệ dung môi khi khảo sát TLC làm cơ sở để lựa chọn
hệ dung môi cho sắc ký cột silica gel.
2.3.2.2 Phương pháp sắc ký cột

Hình 2.9. Minh họa sắc ký cột
Sắc ký cột thường, với pha tĩnh là silica gel 60, cỡ hạt 0,063-0,200 mm
(70- 230 mesh astm) của hãng Merck, dung môi rửa giải chủ yếu dùng các hệ
dung môi như n-hexane/CH2Cl2, n-hexane/EtOAc, n-hexane/Acetone,
CH2Cl2/MeOH,… với tỉ lệ thích hợp.

• Xác định kết cấu chất đồng vị của các thành phần trong hợp chất
• Xác định cấu trúc của một hợp chất bằng cách quan sát từng phần tách
riêng của nó


-16-

• Định lượng lượng hợp chất trong một mẫu dùng các phương pháp khác
(phương pháp phổ khối vốn không phải là định lượng)
• Nghiên cứu cơ sở của hóa học ion thể khí (ngành hóa học về ion và
chất trung tính trong chân không).
• Xác định các thuộc tính vật lí, hóa học hay ngay cả sinh học của hợp
chất với nhiều hướng tiếp cận khác nhau.
Một khối phổ kế là một thiết bị dùng cho phương pháp phổ khối,
cho ra phổ khối lượng của một mẫu để tìm ra thành phần của nó. Có thể ion
hóa mẫu và tách các ion của nó với các khối lượng khác nhau và lưu lại thông
tin dựa vào việc đo đạc cường độ dòng ion. Một khối phổ kế thông thường
gồm 3 phần: phần nguồn ion, phần phân tích khối lượng, và phần đo đạc.
2.3.5 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân(NMR)
Cộng hưởng từ hạt nhân được miêu tả lần đầu vào năm 1938 bởi Isidor
Rabi, sau đó được phát triển lên nhờ các thí nghiệm của Stern-Gerlach. Khi
đó phổ NMR dựa trên sự ghi lại quá trình cộng hưởng từ sinh ra bởi các hạt
nhân spin khác 0 được kích thích bởi năng lượng của tần số sóng radio RF
dưới tác đông của từ trường Bo bên ngoài. Quá trình này sẽ tạo ra sự khác biệt
về trạng thái spin của các hạt nhân và mức năng lượng tương ứng của chúng.
Ngày nay, cùng với sự kế thừa và phát huy thì cơ sở lý thuyết của
phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân dựa trên tương tác của hạt nhân có
từ tính (1H, 13C, …) với từ trường ngoài[7]. Một số hạt nguyên tử có từ tính
tương tác với môi trường ngoài để lại một số tín hiệu. Những tín hiệu đó được
gọi là phổ cộng hưởng từ hạt nhân. Tùy thuộc mỗi loại hạt cộng hưởng từ ở