BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THU HẰNG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA NẤM
MEN PHÂN LẬP TỪ
HẠT KEFIR

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2013


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THU HẰNG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA NẤM
MEN PHÂN LẬP TỪ
HẠT KEFIR
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi

ĐẶT VẤN ĐỀ.............................................................................................................1
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN .......................................................................................2
1.1 Lịch sử dùng các sản phẩm sữa lên men ...........................................................2
1.2 Hạt kefir ...............................................................................................................3
1.2.1 Nguồn gốc hạt kefir............................................................................................3
1.2.2 Đặc điểm hạt kefir ..............................................................................................4
1.2.3 Tác dụng

hạt kefir ........................................................................................8

1.3 Nấm men ............................................................................................................10
1.3.1 Đặc điểm nuôi cấy ............................................................................................10
1.3.2 Ứng dụng của nấm men ...................................................................................12
1.3.3 Các công trình nghiên cứu về nấm men trong hạt kefir ...................................13
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................15
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị ...............................................................................15
2.1.1. Vi sinh vật sử dụng .........................................................................................15
2.1.2. Nguyên liệu, hóa chất sử dụng ........................................................................15
2.1.3. Môi trƣờng ......................................................................................................15
ụng cụ ..........................................................................................16
2.2. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................16


...........................................................................22

CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM – KẾT QUẢ - BÀN LUẬN ...................................23
................................................23
ấm men từ hạt kefir Hà Lan. ..........................................................23

3.1.3.
3.1.4.

ều kiện hô hấ

................................................25

ồn

..................................................29

ệt độ

3.2. Khảo sát một số đặ
3.2.1. Khả

...................30
...............................32
ẩn có hại ................................................................32

3.2.2. Khả năng chịu pH acid dạ dày ........................................................................35
3.2.3. Khả năng cộng sinh với vi khuẩn lactic ..........................................................36
...................................................................................40

Kl.

Saccharomyces

S.

Candida

C.

Debaryomyces

D.

Pichia

P.

Issatchenkia

I.

Yarrowia

Y.

Torulaspora

T.


7

Bảng 2.1:

Nguyên liệu, hóa chất

15
16

Bảng 2.2:
Bảng 3.1:

Ảnh hƣởng của điều kiện hô hấp đến sự tăng sinh khối

26

Bảng 3.2:

Ảnh hƣởng của hô hấp đến khả năng tiêu thụ đƣờng

26

Bảng 3.3:

So sánh khả năng sinh ethanol của nấm men kefir với S.
cerevisiae tron

28

Bảng 3.4:

mien phi
phi

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Trang
1.1:

H

4
5
24

h 3.2:

24
24
2

27
trên

B. subtilis

B. subtilis

34

34

Baccillus

S.

cerevisiae & S. boulardii

2. Nghiên cứu

kefir

c


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
2

CHƢƠNG I: TỔNG QUAN
1.1

Lịch sử dùng các sản phẩm sữa lên men
Sữa là chất bài tiết giàu dinh dƣỡng của động vật có vú. Giá trị dinh dƣỡng tự

nhiên của sữa đã đƣợc khuyến khích sử dụng cho con ngƣời ngay từ buổi đầu của
xã hội loài ngƣời. Điều này có thể bắt đầu từ khi các loài động vật đầu tiên đƣợc


yogurt, lassi, sh

) [29].

Các sản phẩm sữa lên men ngày càng đƣợc ƣa chuộng trên thế giới vì ngoài
việc cung cấp nguồn dinh dƣỡng thiết yếu, chúng còn có tác dụng chữa bệnh. Một
trong những sản phẩm đƣợc quan tâm nhất hiện nay là sữa chua kefir bởi ích lợi mà
nó mang lại. Kefir là sản phẩm làm từ hạt kefir; vừa lên men lactic nhờ nhóm vi
khuẩn ƣa ấm, vừa lên men rƣợu nhờ nấm men. Kefir khác với các sản phẩm sữa lên
men khác là có sự xuất hiện của một nhóm vi sinh vật trong hạt kefir, có thể thu hồi
đƣợc để lên men tiếp. Các vi sinh vật trong hạt kefir thƣờng tạo ra acid lactic, chất
ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây hỏng và các vi sinh vật gây bệnh [2]. Mặc
dù, trên thế giới hạt kefir đã phổ biến nhƣng ở Việt Nam còn ít đƣợc biết đến.
1.2

Hạt kefir

1.2.1 Nguồn gốc hạt kefir
Cách đây hàng nghìn năm, hạt kefir đƣợc biết đến nhƣ một thứ nấm dùng
chữa bệnh, xuất xứ từ cách nuôi riêng của các tu sĩ Ấn Tạng. Hạt kefir có thể làm
biến đổi sữa nhờ một hệ vi sinh vật phức tạp gồm nhiều loài vi khuẩn và nấm men
đƣợc chứng minh là rất có lợi cho sức khoẻ. Dân miền núi Caucasus thuộc nƣớc Xô
Viết cũ - nguyên quán của Kefir - đã bào chế nó từ sữa của các sinh vật khác nhau
và Kefir đƣợc lên men tự nhiên trong những túi da thú hoặc bồn bằng gỗ sồi. Việc
tiêu thụ thƣờng xuyên Kefir đã giúp họ tránh đƣợc bệnh ung thƣ, lao, dạ dày… và
họ thọ đến trung bình là 110 tuổi. Núi Caucasus là vùng duy nhất trên trái đất mà
con ngƣời giữ đƣợc sức khỏe ở lứa tuổi này.
Đến cuối thế kỉ 19, Kefir trở thành sản phẩm quen thuộc của ngƣời dân các
nƣớc Đông Âu (Nga, Ucraina, Balan, Czech, Hungari...) và các nƣớc vùng

vật ở bên trong ít hơn so với phần bên ngoài của hạt (hình 2). Các sợi nguyên liệu
nhỏ (có thể là kefiran polysaccharide) đƣợc quan sát thấy ở phần bên ngoài cũng
nhƣ phần bên trong hạt [24].


5

b
A- H
(B, C) – V
(D) – N

:

–
– Polysaccharid
–

[24].

Hạt kefir chứa một hỗn hợp vi sinh vật cộng sinh phức tạp gồm vi khuẩn lactic
(Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc và Streptococcus spp.), nấm men
(Kluyveromyces, Saccharomyces và Torula) và đôi khi còn tìm thấy cả vi khuẩn
acetic (Acetobacter), trong mạng lƣới của polysaccharid và protein [32].
Mạng lƣới

là một phức hợp có 13% protein (tính theo trọng

lƣợng khô), 24% polysaccharide, cộng với mảnh vỡ tế bào và các thành phần chƣa
biết. Các polysaccharide chính là một chất hòa tan trong nƣớc đƣợc biết đến nhƣ

lactose, vi khuẩn lên men theo cơ chế đồng hình sản xuất ra acid lactic còn dị hình
(e) tạo ra acid lactic và CO2. Một số loài lên men citrate: Lc. lactis, Leu.
mesenteroides ssp. cremoris

Leu. mesenteroides ssp, trong đó Lc. lactis sản xuất

diacetyl, acetaldehyde, ethanol & acetate còn Leu. mesenteroides ssp. cremoris và
Leu. mesenteroides ssp. sản xuất diacetyl, ethanol và acetate [14].
Nấm men gồm những loài lên men đƣợc lẫn không lên men đƣợc đƣờng
lactose. Các loài nấm men lên men đƣợc đƣờng lactose thƣờng đƣợc tìm thấy tại
các vị trí gần bề mặt hạt kefir. Ngƣợc lại, các loài nấm men không lên men đƣợc
đƣờng lactose lại đƣợc tìm thấy tại các vị trí sâu bên trong hạt. Các tế bào nấm men
tạo ra rƣợu và CO2. Gần đây, sử dụng trình tự sao chép các gen rRNA, ngƣời ta
phát hiện nấm Dipodascus capitatus và Trichosporon coremiiforme, tác nhân gây
bệnh, có trong hạt kefir. Đó là cơ sở cho yêu cầu kiểm soát của các chất lƣợng của
vi sinh vật trong hạt kefir [14], [19].
Việc nghiên cứu về hạt kefir rất khó khăn bởi các nguồn gốc khác nhau đang
tồn tại trong các sản phẩm Kefir. Hơn nữa, với số lƣợng lớn vi sinh vật có những
đặc điểm tƣơng tự khiến việc phân lập và xác định các loài riêng biệt trở nên khó.Vì
vậy, hiện nay, nhiều trong số các vi sinh vật trong hạt kefir chỉ xác định đƣợc bằng
cách sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử tiên tiến [8].


7

Bảng 1.1: Các vi sinh vật có trong hạt kefir [8], [32], [19].
Vi khuẩn
Lactobacilli
L. acidophilus o
L. brevis e

Acetobacter
Acetobacters aceti
Acetobacters racens
Nấm men
Kluyveromyces
Kl. lactis l
Kl. marxianus ssp bulgaricus
Kl. marxianus ssp marxianus
Saccharomyces
S. cerevisiae n
S. delbrueckii n
S. unisporus n
Candida

S. pastorianus n
S. turicensis n
S. exiguus n


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
8

C. kefir l
C. famata l

trữ trong nƣớc chỉ có thể đƣợc trong 8-10 ngày; trong

không khí khô hoặc đông khô có thể đƣợc lƣu giữ trong 12-18 tháng mà không làm
giảm hoạt động của hạt kefir. Hạt đông lạnh bảo quản ở -200C duy trì vi sinh vật
hoạt động cho 7-8 tháng, trong khi hạt lạnh cho thấy giảm hoạt động sau 10 ngày
[22].
1.2.3 Tác dụng

hạt kefir

Tên kefir nguồn gốc từ Thổ Nhĩ Kỳ kefi, dịch là 'cảm thấy tốt'. Có rất nhiều
các loại đồ uống làm từ hạt kefir bằng cách lên men sữa động vật (lạc đà, bò, dê


9

cừu), sữa thực vật (hạnh nhân, đậu phộng, sữa đậu nành), trái cây hay nƣớc đƣờng
nhƣng những tác dụng của kefir vẫn không thay đổ
), kefir

đƣợc coi nhƣ là một chế phẩm sinh học [19].

Tác dụng probiotic của kefir: kefir bổ sung nhiều vi sinh vật có lợi giúp cân
bằng hệ vi sinh đƣờng ruột. Trong lịch sử, kefir đã đƣợc đề nghị điều trị các bệnh
nhƣ có vấn đề về tiêu hóa, tăng huyết áp, dị ứng, và bệnh thiếu máu cơ tim [19].
Tác dụng trên ruột: Kefir đã đƣợc chứng minh là làm giảm số lƣợng Clostridia
spp. trong ruột và tăng số lƣợng Bifidobacteria và Lactobacilli. Tác dụng probiotic
của kefir tập trung ở khả năng điều chỉnh hệ vi sinh vật đƣờng ruột: giảm vi sinh vật
gây bệnh ở niêm mạc ruột bằng các sản phẩm acid và chất diệt khuẩn đƣợc tạo ra để
ức chế trực tiếp hay loại trừ bằng cạnh tranh, đồng thời gia tăng số lƣợng vi khuẩn

thực bào [18].
Giúp dung nạp lactose: Một số vi sinh vật trong kefir có khả năng phân giải
lactose thành đƣờng đơn (glucose, galactose) giúp cho những ngƣời không dung
nạp đƣợc lactose có thể sử dụng đƣợc sữa [18].
Giảm cholesterol: Một số nghiên cứu cho thấy giảm cholesterol huyết thanh và
phospolipids trên những con chuột có chế độ ăn uống cholesterol cao bổ sung kefir.
Vì thế, có lợi cho việc ngăn ngừa các sự xuất hiện của nhiều bệnh tim mạch nhƣ đau
tim và đột quỵ [18].
Ngoài ra, kefir có rất nhiều tác dụng khác nhƣ giảm cân, chống oxy hóa, giảm
stress, tăng hoạt động của não, cung cấp các vitamin, tăng cƣờng hoạt động miễn
dịch… [33].
1.3

Nấm men

1.3.1 Đặc điểm nuôi cấy
Nấm men có thể thuộc về hai lớp nấm: nấm túi (Ascomycetes) và nấm bất toàn
(Deuteromecetes hoặc Fungi imperfect). Nấm men là nhóm nấm cơ thể đơn bào
hoặc tập hợp đơn bào, nhân chuẩn, hiển vi. Tế bào nấm men có hình cầu, hình oval
hoặc elip, hình quả chanh, hình trụ, hình chùy hoặc đôi khi còn kéo dài ra thành sợi.
So với các vi sinh

khác, tế bào nấm men có kích thƣớc tƣơng đối lớn khoảng 7 ×

8-12 µm [27], [29].
Dinh dƣỡng
- Nguồn cacbon: gồm các loại đƣờng và dẫn chất, các rƣợu, acid hữu cơ, acid
amin... Tất cả các loại nấm men đều sử dụng đƣợc glucose. Nhiều loài nấm men,
trong đó có giống Saccharomyces không sử dụng đƣợ


khí và hiếu khí tùy thuộc vào điều kiện oxy cung cấp cho quá trình trao đổi của
chúng. Trong điều kiện hô hấp kị khí, nấm men tạo ra ít năng lƣợng hơn so với hiếu
khí vì vậy để đảm bảo cung cấp năng lƣợng nấm men tiêu tốn nhiều cơ chất hơn [9].
Nhiệt độ:
Đa số nấm men có nhiệt độ thích hợp là 28÷32oC
0

C. Nhiệt độ không chỉ ảnh hƣởng đến cƣờng độ lên men và

sinh trƣởng của nấm men còn ảnh hƣởng tới sinh tổng hợp các sản phẩm. Nhiệt độ
càng cao càng dễ sinh và tích tụ các sản phẩ
pH

[9].


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
12

Mỗi chủ

đều có khoảng pH thích hợp cho sinh trƣởng và phát

triển riêng. Với giống Saccharomyces pH ban đầu thích hợp cho lên men là 5,5.

bánh m , làm nguồn protein-vitamin bổ sung cho thức ăn chăn nuôi… Nghiên cứu
làm bánh mỳ sử dụng hạt kefir nhƣ nấm men bánh m cho thấy: bánh mì đƣợc sản
xuất với kefir giữ lại độ ẩm hơn, độ axit thấp (pH 4,9-5,5) và giữ lại độ „tƣơi‟ của
chúng lâu hơn so với bánh mì làm từ nấm men bánh mì thông thƣờng [4], [30].
Ứng dụng nấm men trong lĩnh vực Y-Dƣợc


13

Nấm men dùng trong dƣợc phẩm gồm tế bào nấm men tƣơi hay đông khô.
P.
pastoris

S. cerevisiae
.

Men bia giúp tăng hoạt tính của enzym trong ruột như disaccharidase,
saccharidase, maltase và lactase để giúp giảm các triệu chứng tiêu chảy; cũng giúp
tăng hoạt động của insulin rất có ích cho bệnh nhân tiểu đường do chứa nhiều
chromium [9]. Trong một nghiên cứ

những người dùng mỗi

ngày 2 muỗng canh men bia trong 8 tuần có thể giúp làm hạ cholesterol trong máu
trung bình được 10% [5].
Một số loài nấm men nhƣ S. cerevisiae, S. boulardii đƣợc bổ sung vào các sản
phẩm probiotic. Đặc biệt là S. boulardii

Biocare, Bio-


điều kiện tối ƣu cho lên men thu đƣợ

lotiones lên men lactose khác nhau

nhiệt độ 28 ℃, thời gian 60h, cấy 3% [25].
Năm 2010, Gorsek A. & Z
ethanol
thời gian lên men.

kefir

nhiệt độ và

l

250C. Giá trị năng lƣợng kích hoạt của sản xuất ethanol là 64,3 kJ/mol [20].
Năm 2013,
Ma

M.G.C.P. Miguel, P.G. Cardoso, K.T.

của nấm men kefir

từ Brazil, Canada và

25 loài nấm men đƣợc phân lập từ sữa lên men kefir

Hoa Kỳ.

chỉ có 3 loài S. cerevisiae, Saccharomyces sp. và Kl. marxianus có thể phát triển ở

E. coli – ATCC25922

: S. cerevisiae –
L. acidophilus– ATCC4653
2.1.2. Nguyên liệu, hóa chất sử dụng
Bảng 2.1: Nguyên liệu, hóa chất
Tên nguyên li
Glucose

Việt Nam
Đức



(NH4)2SO4

Trung Quốc

MgSO4.7H2O

Trung Quốc

KH2PO4

Trung Quốc

Thạch bột

Việt Nam



: 0,5 g

C

: 0,5 g


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
16

(NH4)2SO4

: 0,5 g

(NH4)2SO4

: 0,5 g

MgSO4.7H2O

: 0,1 g

MgSO4.7H2O

: 0,5 g

100ml

100ml

và dụng cụ
Bảng 2.2
Thiết bị

Nguồn gốc

Tủ cấy UV Bioair

Italia

Tủ ấm, tủ sấy Memmert

Đức

Nồi hấp ALP

Nhật

Lò vi sóng Daewoo

Hàn Quốc

Tủ lạnh Toshiba


-

acid

.

-

lactic.

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
ấy giống đƣợc tiến hành trong tủ cấy vô trùng. Tủ cấy đƣợc tiệt
trùng trƣớc khi sử dụng bằng cách lau sạch bằng cồn 70o và bật đèn UV trong 20
phút.
2.3.1. Phương pháp
MT2

0

-

gi
0

C/24h.

2.3.2.
Pha môi trƣờng

thạch tan hế