BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

QUÁCH NGỌC LUYẾN

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG CỦA OFLOXACIN BẰNG SẮC KÝ LỎNG
HIỆU NĂNG CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI - 2011

1


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

QUÁCH NGỌC LUYẾN
XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN ĐỐI
QUANG CỦA OFLOXACIN BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 60 73 15

n luận văn này

ơn các thầy cô, cán ộ

thuật vi n t i phòng thí

nghiệm trung tâm - Trƣờng đ i học Dƣợc Hà Nội đã hỗ trợ em rất nhiều tr ng
uá trình là

thực nghiệ

C ng xin gửi lời c

v a ua
ơn tới DS V Thị Minh Quỳnh và toàn thể đồng

nghiệp Công ty TNHH MTV Dƣợc Khoa-Trƣờng đ i học Dƣợc Hà Nội, đã
luôn t

điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và công tác; luôn động

viên và chia sẻ những kinh nghiệm quý giá cho tôi trong suốt thời gian qua.
Cuối cùng tôi xin đƣợc gửi lời c
thân y u đã luôn

ơn đến gia đình,

n

, những ngƣời


Diode array detector

DEX

Dextrofloxacin

ĐK

Đăng ý

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng ca -High performance liquid chromatography

IR

Phổ hấp thụ hồng ngo i-Infrared

LC/MS

Sắc ký lỏng khối phổ-Liquid chromatography/Mass spectrometry

LEV

Levofloxacin

LOD

Giới h n phát hiện-Limit of detection



MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ……………………………………………………………………

1

CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN ……………………………………………………

3

1.1.VÀI NÉT VỀ OFLOXACIN VÀ LEVOFLOXACIN ………………………

3

1.1.1. Công thức cấu t o và tính chất của ofloxacin … …………………………

3

1.1.2. Công thức cấu t o và tính chất của levofloxacin …………………………

3

1.1.3. Tác dụng dƣợc lý của ofloxacin……………………………………

4

1.1.4. Tác dụng dƣợc lý của levofloxacin ……………………………………

7


16

1 3 5 Ứng dụng của HPLC……… ……………………… ……………………

18

CHƢƠNG 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …………

21

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ ……………………………………

21

2.1.1. Máy móc, thiết bị …………………………………………………………

21

2.1.2. Hóa chất ……………

21

…………………………………………………

2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ……………………… …………………

22

2.2.1. Kh o sát và lựa chọn các điều kiện phân tích …………… ……………



3 2 1 Độ phù hợp của hệ thống sắc ký …………………………………………

39

3.2.2. Tính chọn lọc ………………………………………

40

3.2.3. Kho ng nồng độ tuyến tính………………………………………………

42

3 2 4 Độ chính xác của phƣơng pháp…………………………………………

43

3 2 5 Độ đúng của phƣơng pháp………………………………………………

45

3.3. ỨNG DỤNG CỦA PHƢƠNG PHÁP……………………………………

43

CHƢƠNG 4 BÀN LUẬN……………………………………………………

46


3.2

Kết qu đánh giá độ phù hợp của hệ thống sắc ký

37

3.3

Kết qu đáp ứng diện tích pic theo nồng độ levofloxacin

39

3.4

Kết qu kh

sát độ chính xác (trong ngày)

40

3.5

Kết qu kh

sát độ chính xác (khác ngày)

41

3.6


Hình

Nội dung

Trang

1.1

Cơ chế t

phức của fl xacin với các tác nhân

12

1.2

Đồ thị biểu diễn mối tƣơng uan diện tích pic và nồng độ

20

3.1

Sắc ý đồ của ofloxacin với ion kim lo i là Zn2+

28

3.2

Sắc ý đồ của ofloxacin với ion kim lo i là Al3+


(3×150mm; 3,5µm)

32

3.8

Sắc ý đồ của ofloxacin tách bằng cột Phenomenex C18
(250×4,6mm;5µm)

33

3.9

Sắc ý đồ đánh giá tính chọn lọc của phƣơng pháp

38

3.10

Đồ thị biểu diễn mỗi tƣơng uan giữa diện tích pic và nồng độ
levofloxacin

36

8


ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, việc sử dụng đơn đồng phân trong các d ng chế phẩm thuốc
thay cho d ng hỗn hợp race ic c xu hƣớng phát triển m nh nhằ

một nghiên cứu tách đồng phân của ofloxacin triển khai bằng phƣơng pháp
CE (Capillary electrophoresis) đƣợc công bố [8].
Hiện nay, định tính và định lƣợng levofloxacin chủ yếu theo tiêu chuẩn
cơ sở, nhƣng chƣa thuận tiện vì hông định tính và định lƣợng đƣợc đồng
thời, ph i chiết tách lấy lƣợng ho t chất lớn đối với thuốc nhỏ mắt để xác
định về mặt định tính, còn định lƣợng thì tiến hành một phép phân tích
riêng.

9


Nhằm góp phần xây dựng một phƣơng pháp định tính và định lƣợng
đồng thời đồng phân levofloxacin một cách nhanh chóng, chính xác và
hiệu qu , chúng tôi tiến hành đề tài “Xây dựng phương pháp phân tích
đồng phân đối quang của ofloxacin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao” với
hai mục tiêu sau:
+ Xây dựng phƣơng pháp tách các đồng phân đối quang của ofloxacin
nhằ

định tính, định lƣợng d ng đồng phân S-ofloxacin (levofloxacin).

+ Đánh giá chất lƣợng một số thuốc đang lƣu hành tr n thị trƣờng có
chứa đơn đồng phân levofloxacin.

10


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. VÀI NÉT VỀ OFLOXACIN VÀ LEVOFLOXACIN
1.1.1. Công thức cấu tạo và tính chất của ofloxacin



- Trọng lƣợng phân tử: 370,38 g/mol
Tính chất vật lý [19].
- Bột kết tinh hoặc tinh thể hình kim màu t trắng đến hơi vàng.
- Nhiệt độ nóng ch y: 225 – 2270C.
- Góc quay cực riêng

= -76,90 (C = 0,368 trong NaOH 0,5N)

- Độ tan: Lev fl xacin tan tr ng nƣớc. Ở kho ng pH t 0,6 đến 5,8 độ tan
của lev fl xacin tƣơng đối hằng định (kho ng 100mg/ml). T pH 5,8 độ
tan của lev fl xacin tăng l n nhanh ch ng và đ t cực đ i ở pH 6,7 (kho ng
272mg/ml). Tuy nhiên nếu tiếp tục tăng pH thì độ tan của levofloxacin l i
gi m xuống và ch còn 50mg/ml ở pH 6,9 [21].
Tính chất hóa học [3],[23]:
- Tƣơng tự nhƣ fl xacin
1.1.3. Tác dụng dƣợc lý của ofloxacin [6]:
1.1.3.1. Phổ tác dụng
- Ofloxacin là thuốc kháng khuẩn nhóm fluoroquinolon, có phổ kháng khuẩn
rộng tƣơng tự ciprofloxacin, trên phần lớn các vi khuẩn gra

â , gra

dƣơng

và một số vi khuẩn kị khí.
Ofloxacin có phổ kháng khuẩn bao gồm: Enterobacteriaceae, Pseudomonas
aeruginosa, Haemophilus influenzae, Neisseria spp., Staphylococcus,
Streptococcus, Streptococcus pneumoniae và một vài vi khuẩn gra

bài tiết ua nƣớc tiểu dƣới d ng không chuyển hóa trong 24-48 giờ làm nồng
độ thuốc ca tr ng nƣớc tiểu Dƣới 5% thuốc đƣợc bài tiết dƣới d ng chuyển
h a tr ng nƣớc tiểu; 4-8% thuốc bài tiết qua phân. Ch một lƣợng nhỏ
fl xacin đƣợc th i bằng thẩm phân máu.
1.1.3.3. Chỉ định, liều dùng
Ofloxacin được dùng trong các bệnh:
- Viêm phế qu n nặng do vi khuẩn, viêm phổi.
- Nhiễm khuẩn Chlamydia t i cổ tử cung hoặc niệu đ o có hoặc không kèm
lậu, lậu không biến chứng, viêm tuyến tiền liệt, vi
- Nhiễm khuẩn da và mô mềm,

13

đƣờng tiết niệu,


- Vi

đ i tràng do nhiễm khuẩn.

Liều dùng:
- Viêm phế qu n đợt bệnh nặng do nhiễm khuẩn hoặc viêm phổi: Uống
400mg, cách 12 giờ/lần, trong 10 ngày.
- Nhiễm Chlamydia (trong cổ tử cung và niệu qu n): Uống 300 mg, cách 12
giờ/lần, trong 7 ngày.
- Lậu không biến chứng: Uống 400 mg, liều duy nhất.
- Viêm tuyến tiền liệt: Uống 300 mg, cách 12 giờ/lần, trong 6 tuần.
- Nhiễm khuẩn da và mô mềm: Uống 400 mg, cách 12 giờ/lần, trong 10 ngày.
- Viêm bàng quang do E. coli hoặc K.pneumoniae: Uống 200 mg, cách nhau
12 giờ/lần, trong 3 ngày.

- Viên nén: 200mg, 300mg, 400mg
- Dung dịch tiêm: 4mg/ml, 5mg/ml, 20mg/ml, 40mg/ml
- Thuốc nhỏ mắt: 3mg/ml
1.1.4. Tác dụng dƣợc lý của levofloxacin
1.1.4.1. Dược động học [19], [22]
- Levofloxacin hấp thu tốt the đƣờng uống, nồng độ tối đa tr ng huyết
tƣơng đ t đƣợc sau 1-2h uống thuốc.
- Thuốc phân bố rộng khắp các

ô, đặc biệt là dịch phế qu n, phổi;

thuốc ít vào dịch não tủy.
- Trong máu thuốc ở d ng liên kết với protein huyết tƣơng kho ng 3040%.
- Thuốc th i tr qua nƣớc tiểu, phần lớn dƣới d ng có ho t tính và ít hơn
5% dƣới d ng đã chuyển hóa. Thời gian bán th i là 6h-8h và é dài hơn ở
bệnh nhân suy thận. Thuốc không bị lo i bỏ bằng ch y thận nhân t o và thẩm
tách phúc m c.
1.1.4.2. Phổ tác dụng
- Là kháng sinh phổ rộng, tác dụng trên c vi khuẩn gram dƣơng, gram
âm và vi khuẩn kị khí [12],[27]. Trên vi khuẩn gram dƣơng, tác dụng trên
Streptococcus pneumoniae kể c

chủng vi khuẩn kháng penicillin;

Staphylococcus spp; Corynebacterium spp… Trên vi khuẩn gram âm, tác
dụng trên Heamophilus influenzae; Enterbacter; Moraxella catarrhlis;
Klebsiella pneumoniae…. [23]

15


ch:

Nhiễm khuẩn đường hô hấp:
Đợt cấp của viêm phế qu n mãn tính: 500mg, 1 lần/ngày trong 7 ngày
Viêm phổi mắc ph i t i cộng đồng: 500mg, 1-2 lần/ngày trong 7-14 ngày
Viêm xoang hàm trên cấp tính: 500mg, 1 lần/ngày trong 10-14 ngày
Nhiễm trùng da và tổ chức dưới da
Có biến chứng: 750mg, 1-2 lần/ngày trong 7 ngày
Không có biến chứng: 500mg, 1 lần/ngày trong 7-10 ngày
Nhiễm khuẩn đường tiết niệu
Có biến chứng: 250mg, 1lần/ngày trong 10 ngày
Không có biến chứng: 250mg, 1 lần/ngày trong 3 ngày

16


Viêm thận – bể thận cấp: 250mg, 1 lần/ngày trong 10 ngày
Bệnh than
Điều trị dự phòng sau hi phơi nhiễm với trực khuẩn than: ngày uống 1 lần,
500 mg, dùng trong 8 tuần.
Điều trị bệnh than: Truyền tĩnh

ch, sau đ uống khi tình tr ng ngƣời bệnh

cho phép, liều 500mg, 1 lần/ngày trong 8 tuần.
Viêm tuyến tiền liệt: 500mg/24 giờ, truyền tĩnh

ch, sau vài ngày có thể

chuyển sang uống.

1,5%; Quixin 0,5%; ...
1.1.5. Một số phƣơng pháp kiểm nghiệm ofloxacin
- Định tính [26] :
+ Phổ hấp thụ hồng ngo i.
+ Phổ hấp thụ tử ngo i:
+ Phƣơng pháp sắc ký:
 Sắc ký lớp mỏng.
 Sắc ký lỏng hiệu năng ca
- Định lƣợng [1][26]:
+ Phƣơng pháp

ôi trƣờng khan: Định lƣợng bằng acid percloric trong

ôi trƣờng acid acetic khan
+ Phƣơng pháp uang phổ.
+ Phƣơng pháp vi sinh vật.
+ Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng ca
1.1.6. Một số nghiên cứu tách và định lƣợng levofloxacin
Để tách và định lƣợng đƣợc lev fl xacin ngƣời ta cho nó tác dụng với
một tác nhân ho t quang, t o thành các đồng phân quang học hông đối
quang (diastereoisomer), có những tính chất vật lý khác nhau và dễ tách ra
khỏi nhau hơn
Các chất có thể đƣợc dùng làm tác nhân ho t quang là các amino acid,
các hydroxyl acid, các amino alcol và một vài chất khác [9],[18]

18


Tách và định lƣợng levofloxacin trong hỗn hợp racemic có thể tiến hành bằng nhiều phƣơng pháp, nhƣng chủ
yếu là bằng HPLC. B ng 1.1 trình bày một số nghiên cứu tách và định lƣợng levofloxacin bằng HPLC.


1ml/phút

20µl

5mmol/l L-isoleucin.

[24]

[25]

C18 (250×4,6mm; 5µm,
RStech )

C18 (250×4,6mm; 5µm,
RStech )

20%MeOH, 80% pha nƣớc
chứa 0,6mmol/l CuSO4 và 0,5ml/phút

Mẫu thử và
nồng độ
ofloxacin
trong dung
dịch thử
+ Nƣớc th i
+ 1µg/ml

2µl


2,5mmol/l L-isoleucin.

chứa 0,4mmol/l CuSO4 và 0,7ml/phút

Thời

19

22

UV
λ = 293n

UV
λ = 293n


Cơ chế tách đồng phân:
Cơ chế t

phức của fl xacin c thể

ô t nhƣ sau:

Hình 1.1. Cơ chế tạo phức của ofloxacin với các tác nhân.
,Trung tâ

đối uang của floxacin

, Trung tâ

đồng phân

ới đƣợc tách hi sắc ý Khi nồng độ i n

l i Cu2+ tăng, các i n Cu2+ th a sẽ ết hợp với nh

acid car xylic của

amino acid, hi đ c sự dịch chuyển cân ằng tr ng pha động the chiều
thuận của phƣơng trình:
[Cu(ofloxacin)(L-iso)]1+ + Cu2+ ↔ [Cu( fl xacin)]2+ + [Cu(L-iso)]1+
Kết u là phức chứa 3 nhân tố ị phá vỡ, dẫn đến hệ số lƣu giữ và độ
phân gi i của hai đồng phân gi

20


1.2. VÀI NÉT VỀ ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC
- Đồng phân quang học là hiện tƣợng đồng phân c li n uan đến sự
khác nhau về góc quay của mặt phẳng ánh sáng phân cực
- D ng đồng phân quang học đơn gi n nhất xuất hiện tr ng trƣờng hợp
khi hợp chất có thể tồn t i dƣới hai d ng đồng phân lập thể có cấu t o không
thể chồng hít l n nhau đƣợc. Ngoài sự khác biệt trong cấu trúc phân tử theo
kiểu sự khác biệt giữa bàn tay ph i và bàn tay trái, còn tất c các tính chất lý
học thông thƣờng của các đồng phân đ là giống nhau, tr kh năng uay

ặt

phẳng ánh sáng phân cực theo những góc bằng nhau nhƣng ngƣợc chiều [5].
- Hỗn hợp racemic là hỗn hợp có số phân tử bằng nhau của mỗi d ng đối

Ƣu điể

của phƣơng pháp:
+ Độ đặc hiệu ca , thời gian phân tích ngắn

21


+ Lƣợng

ẫu tiêm rất nhỏ (1-50nl) nên ch cần

ột lƣợng

ẫu

nhỏ.
Nhƣợc điể :
+ Lƣợng tiêm nhỏ n n h tăng độ nh y, sai số tƣơng đối của phép
đ lớn
+ Thời gian lƣu phụ thuộc nhiều và thành phần pha đệ , dung
dịch điện ly, n n đòi hỏi tha tác t
Thiết ị này ít phổ iến tr ng các phòng thí nghiệ


ở Việt Na

Sắc ý lỏng hiệu năng ca (High performance liquid chromatography-

HPLC): Là


đồng phân đối uang sẽ hông ằng nhau nếu nguy n liệu ị lẫn t p
1.3. PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
1.3.1.Khái niệm
HPLC là một k thuật tách, tr ng đ các chất phân tích di chuyển qua
cột chứa các h t pha tĩnh Tốc độ di chuyển hác nhau li n uan đến hệ số
phân bố của chúng giữa hai pha, tức là li n uan đến ái lực tƣơng đối của các

22


chất này với pha tĩnh và pha động d đ thứ tự rửa gi i các chất ra khỏi cột vì
vậy phụ thuộc vào các yếu tố này.
Thành phần pha động đƣa các chất phân tích di chuyển qua cột cần đƣợc điều
ch nh để rửa gi i các chất phân tích với thời gian hợp lý.
1.3.2.Nguyên tắc của quá trình sắc ký
Sắc ký là một quá trình phức t p, có sự tƣơng tác giữa ba thành phần:
Chất tan, pha động và pha tĩnh.
Chất tan
F1
Pha tĩnh

F2
F3 Pha động

Chất tan đƣợc phân bố giữa pha tĩnh và pha động. Quá trình tách dựa
trên tính chất vật lý, hóa lý của các chất; dựa trên hai quá trình là hấp phụ và
gi i hấp phụ x y ra liên tục giữa hai pha: Pha tĩnh (chất rắn hoặc chất lỏng) và
pha động (gồm một chất hoặc hỗn hợp nhiều chất). Pha động hòa tan, đẩy
chất phân tích di chuyển. Pha tĩnh giữ chất phân tích. Đối với mỗi chất, sự lƣu

Đ ở vùng 190-900n

để phát hiện các chất hấp thụ quang. Detector UV-VIS

lo i hiện đ i có dãy diod (Diode array detector - DAD) có kh năng uét
chồng phổ để định tính theo phổ hấp thụ của các chất. Đây là l i detector
phổ biến nhất, đƣợc trang bị cho các đơn vị kiểm nghiệm ở Việt Nam.
- Detector huỳnh uang: Để phát hiện các chất phát huỳnh uang Đây là
lo i detector c độ chọn lọc cao.
Ngoài ra còn có một số detector khác: tán x

ay hơi, điện h a, đ ch số khúc

x , đ độ dẫn điện, khối phổ…
1.3.4. Các thông số đặc trƣng của quá trình sắc ký [3]
 Thời gian lƣu (Retention time-tR): Thời gian lƣu của một chất tan là
kho ng thời gian t lúc tiêm mẫu thử vào cột đến hi pic đến detector.

24


Thời gian lƣu của chất không bị lƣu giữ đƣợc gọi là thời gian chết. Tốc độ di
chuyển của chất không bị lƣu giữ bằng tốc độ di chuyển trung bình của các
phân tử pha động.
Trong cùng một điều kiện sắc ký, mỗi chất có một tR khác nhau nên tR giúp
định tính các chất.


Hệ số dung lƣợng k’(capacity factor): Hệ số ’ là


Hệ số chọn lọc α (relative retention):

Đặc trƣng ch tốc độ di chuyển t đối của 2 chất A và B
α=

=

’: Hệ số dung lƣợng
Qui ƣớc ở đây B là chất ị lƣu giữ

tR: Thời gian lƣu
nh hơn A n n α > 1.

Để tách ri ng hai chất thƣờng chọn 1,05 ≤ α ≤ 2,0

25