ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
KHOA HÓA

TRẦN NGUYỄN XUÂN TRINH

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH
PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC DỊCH
CHIẾT ETHYL ACETATE LÁ ĐU ĐỦ ĐỰC (CARICA
PAPAYA L.) THU HÁI TẠI QUẢNG NAM-ĐÀ NẴNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN HÓA HỌC

Đà Nẵng- Năm 2018


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
KHOA HÓA

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH
PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC DỊCH
CHIẾT ETHYL ACETATE LÁ ĐU ĐỦ ĐỰC (CARICA
PAPAYA L.) THU HÁI TẠI QUẢNG NAM-ĐÀ NẴNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN KHOA HỌC

Sinh viên thực hiện
Lớp
Giáo viên hướng dẫn


1.3. NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ NGOÀI
NƢỚC ............................................................................................................................. 5
1.4. NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ ... 8
1.5. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO . 13
1.5.1. Phương pháp MTT ...........................................................................................................13
1.5.2. Phương pháp SRB ............................................................................................................14
CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 15
2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU ............................ 15
2.1.1. Nguyên liệu ........................................................................................................................15
2.1.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu ....................................................................................15
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................................... 16
2.2.1. Xác định một số chỉ tiêu hóa lí .....................................................................................16
2.2.1.1. Độ ẩm ....................................................................................................... 16
2.2.1.2. Hàm lượng tro .......................................................................................... 16
2.2.1.3. Xác định hàm lượng kim loại ................................................................... 17
2.2.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết hợp chất hóa học trong lá
Đu đủ đực .......................................................................................................................................17
2.2.2.1. Phương pháp chiết mẫu thực vật ............................................................. 17
2.2.2.2. Phương pháp định danh thành phần hóa học các hợp chất .................... 18
2.2.3. Định tính một số hợp chất trong lá Đu đủ đực .........................................................18
2.2.3.1. Alcaloid .................................................................................................... 18
2.2.3.2. Flavonoid ................................................................................................. 19
2.2.3.3. Coumarin ................................................................................................ 19
2.2.3.4. Saponin .................................................................................................... 20
2.2.3.5. Đường khử ............................................................................................... 20
2.2.3.6. Polyphenol ............................................................................................... 21
2.2.3.7. Steroid ...................................................................................................... 21
2.2.3.8. Axit hữu cơ ............................................................................................... 21
2.2.3.9. Chất béo ................................................................................................... 22
2.2.3.10. Carotene ................................................................................................. 22

3.5. THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC DỊCH CHIẾT ETHYL
ACETATE TỪ LÁ ĐU ĐỦ ĐỰC ............................................................................... 38
3.6. KẾT QUẢ KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC DỊCH CHIẾT
ETHYL ACETATE LÁ ĐU ĐỦ ĐỰC BẰNG PHƢƠNG PHÁP GC-MS ............. 39
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 43
1. KẾT LUẬN .............................................................................................................. 43
2. KIẾN NGHỊ ............................................................................................................. 43
O........................................................................................... 44



DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
S

:

Singlet (NMR)

ppm

:

Parts per million

δ

:

Độ chuyển dịch hóa học (NMR)


:

Methanol

Me

:

Methyl

NMR

:

Nuclear magnetic resonance

SRB

:

Sulforhodamine B


DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Số hiệu
bảng
1.1

1.2


28

3.3

Kết quả khảo sát hàm lượng một số kim loại trong lá Đu đủ
đực

28

3.4

Kết quả khảo sát thời gian chiết ngâm dầm trong dung môi
etylacetat

29

3.5

Kết quả khảo sát tỉ lệ Rắn/Lỏng chiết ngâm dầm trong dung
môi ethyl acetate

31

3.6
3.7
3.8

Kết quả khảo sát thời gian chiết soxhlet tối ưu bằng dung
môi ethyl acetate
Kết quả khảo sát thời gian chiết siêu âm tối ưu bằng dung


40


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Số hiệu
hình

Tên hình

1.1

Trang
5

1.2

Công thiức cấu tạo cảu hợp chất trong cây Đu đủ

7

2.1

Lá Đu đủ đực và Bột lá Đu đủ đực

15

2.2

Sơ đồ điều chế các cao chiết

1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Ngày nay cùng với sự phát triển không ngừng về mọi mặt của xã hội, con người
đang phải đối mặt với nguy cơ xuất hiện bệnh tật ngày càng nhiều hơn. Một trong
những giải pháp hiện nay là xu hướng quay về với thiên nhiên, dùng những sản phẩm
có nguồn gốc tự nhiên hơn là tổng hợp bằng con đường nhân tạo, nhất là hợp chất
thiên nhiên từ các thực vật xung quanh chúng ta.
Cây Đu đủ (Carica papaya Linn) là một loại cây ăn quả có nguồn gốc từ vùng
nhiệt đới châu Mỹ. Hiện nay, Đu đủ được trồng ở các nước vùng nhiệt đới. Sản lượng
Đu đủ trên thế giới khoảng trên 5 triệu tấn quả/năm [11].
Ở Việt Nam, cây Đu đủ được trồng hầu hết ở các tỉnh miền Bắc và miền Nam.
Diện tích trồng Đu đủ của cả nước ước khoảng 10000-17000 hecta với sản lượng
khoảng 200-350 nghìn tấn quả [11]. Cây Đu đủ có lợi thế là loại cây dễ trồng, ra quả
sớm, năng suất cao đồng thời toàn bộ thân, lá, quả đều được sử dụng với nhiều mục
đích chữa bệnh khác nhau.
Trong dân gian lá cây Đu đủ được sử dụng để sát khuẩn, kháng nấm, kháng
viêm, chữa sốt rét, trừ giun sán,... Đã có nhiều công trình nghiên cứu về hoạt tính sinh
học của lá Đu đủ. Lá Đu đủ được chứng minh là có khả năng chống oxy hóa rất mạnh
[29, 30]. Lá Đu đủ có hoạt tính kháng khuẩn tốt, có khả năng kháng nhiều loại vi
khuẩn gram âm, gram dương, các loại nấm [1, 16]. Ngoài ra, lá Đu đủ còn có khả năng
kháng viêm, giảm đau [21, 47].
Đặc biệt, người dân Việt Nam đã dùng lá Đu đủ chữa bệnh ung thư. Ở nước ta,
cao chiết với cồn từ lá Đu đủ được nghiên cứu trong một số mô hình ung thư thực
nghiệm và được chứng minh có tác dụng ức chế sự phát triển của khối u gây ra bởi tế
bào ung thư Sarcoma TG-180 ở chuột nhắt trắng [7]. Đầu năm 2010, một nhóm nghiên
cứu Nhật Bản và Mỹ đã thông báo dịch chiết nước lá cây Đu đủ có tác dụng ức chế
một số dòng tế bào ung thư người như ung thư dạ dày, ung thư phổi, ung thư máu,...
Chính bởi công dụng chữa bệnh củ
ều đề tài nghiên

- Nghiên cứu trên mạng Internet, tham khảo các công trình nghiên cứu trên thế
giới về loài cây này.
- Tổng quan các tài liệu về đặc điểm hình thái thực vật, thành phần hoá học, ứng
dụng của các bộ phận của cây Đu đủ.
4.2. Phƣơng pháp nghiên cứu thực nghiệm
- Các phương pháp lựa chọn và xử lý mẫu thực nghiệm;
- Các phương pháp chiết mẫu gồm ngâm dầm cổ điển, chiết soxhlet và chiết siêu
âm;
- Các phương pháp định danh thành phần hóa học;
-

gây độc tế bào;

- Các phương pháp xử lý số liệu bằng toán học.


3
5. Bố cục của luận văn
Khóa luận gồm 46 trang, 15 bảng, 10 hình ảnh, 36 tài liệu tham khảo. Với:
Phần mở đầu ( 3 trang)
Chương 1- Tổng quan ( 11 trang)
Chương 2 – Những nghiên cứu thực nghiệm ( 12 trang)
Chương 3 – Kết quả và thảo luận ( 13 trang)
Kết luận và kiến nghị ( 1 trang)
Tài liệu tham khảo (1 trang)


4
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÂY ĐU ĐỦ


C: hoa đực


5

D: trái của cây cái

E: trái lưỡng tính

F: cây đực

Đu
1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ
TRONG NƢỚC
Năm 1983, Nguyễn Tường Vân và cộng sự đã chiết xuất và xác định được
alcaloid carpaine trong lá Đu đủ [12].
Năm 2007, Hà Thị Bích Ngọc và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật HPLC phân tích
các chất carotenoid trong lá Đu đủ. Kết quả cho thấy β-carotene, luteine chiếm tỷ lệ
tương ứng là 57,050% và 11,864% so với tổng các chất carotenoid, tuy nhiên không
xác định được lycopene [8].
Năm 2012, Trần Thanh Hà và Trịnh Thị Điệp đã phân lập được 4 chất từ phân
đoạn chiết n-hexanee của lá Đu đủ. Bao gồm, β-sitosterol, daucosterol, cycloart-23ene-3β,25-diol (sterculin A) và cycloart-25-ene-3β,24(R/S)-diol. Trong đó, sterculin A
và cycloart-25-ene-3β,24(R/S)-diol là 2 triterpene lần đầu tiên phân lập từ lá Đu đủ
[5].
Theo nghiên cứu Nguyễn Văn Rư, Vũ Quang Thái đã tách chiết chymopapain từ
nhựa quả Đu đủ xanh và chế thử thành dạng bột pha tiêm [9].
bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần (n-hexanee, CH2Cl2, EtOAc, buthanol).
Từ cặn chiết CH2Cl2 phân lập được 6 hợp chất: danielone, carpainone, acid pluchoic,
ap

lá Đu đủ. Kết quả cho thấy có sự xuất hiện của các hợp chất alcaloid, flavonoid,
saponin, tannin và glycoside bằng các thuốc thử đặc trưng [15].
Năm 2015,
Đu đủ ở Nigeria. Cho kết quả trong hoa chứa saponin (0.07%), alkaloid (0.05%),
tannin (0.002%) và flavonoid (2.8%). Ngoài ra còn chứa các nguyên tố vô cơ Na, Ca,
Mg, P và các vitamin như B1, B2, B3, C [19].
Năm 2017, Sunday Ahamefula Ezekwe và cộng sự đã xác định các hợp chất hóa
học trong quả Đu đủ xanh bằng phương pháp sắc ký khí ghép nối khối phổ GC-MS
bao gồm: octadecanoic acid (23,84%), hexadecenoic acid (19,17%) và hexadecanoic
acid, methyl ester (18,25%) [20].
Dưới đây là công thức cấu tạo các hợp chất hóa học trong cây Đu đủ:


7

β-sitosterol

Daucosterol

Sterculin A

Cycloart-25-ene-3β,24(R/S)-diol

Carpaine

Pseudocarpaine

Dehydrocarpaine I

Dehydrocarpaine II


Sterculin A và Cycloart-25-ene-3β,24(R/S)-diol

Acid hữu cơ

Acid malic, Acid quinic; dẫn xuất của Acid malic: caffeoyl malate, ρcoumaroyl malate (isomer 1), ρ-coumaroyl malate (isomer 2),
feruloyl malate (isomer 1), feruloyl malate (isomer 2)

Như vậy, thành phần hóa học các bộ phận của cây Đu đủ cái đã được nghiên
cứu. Các công trình nghiên cứu chủ yếu là lá, quả và các bộ phận khác như rễ, thân,
hạt,… cây Đu đủ cái. Tuy nhiên nghiên cứu về các bộ phận như hoa và lá cây Đu đủ
đực lại rất ít.
1.4. NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ
Các phương pháp nghiên cứu về hoạt tính sinh học, dược lý của thực vật được
các nhà khoa học đặc biệt quan tâm [3, 39, 49]. Hoạt tính sinh học các bộ phận của cây
Đu đủ như lá, quả được các nhà khoa học trong nước và trên thế giới công bố khá
phong phú.


có
tác dụng kháng khuẩn đối với Typhimurium mentagrophytes, T.rubrum và
Staphylococcus aureus [1].
Năm 2012, Moses Alo và cộng sự đã chứng minh dịch chiết lá đu đủ bằng nước
lạnh và ethanol đều có hoạt tính ức chế vi khuẩn Salmonella typhi [17].
Năm 2015, K. Kayalvizhi và cộng sự đã công bố hoạt tính kháng khuẩn của lá
Đu đủ cái thu hái ở Ấn Độ đối với các vi khuẩn gram dương và gram âm. Kết quả cho


9
thấy dịch chiết ethanol lá Đu đủ cái ức chế các vi khuẩn gram dương: Staphylococcus

vú MCF-7 (IC50 từ 1,13 đến 3,49 µg/mL) [6].
Các nghiên cứu ở điều kiện in vitro về việc dùng Đu đủ để ức chế, tiêu diệt tế
bào ung thư được tóm tắt trong Bảng 1.2:


10
Bảng 1.2. Tác dụng của chất chiết từ Đu đủ lên các dòng tế bào ung thƣ khác
nhau trong điều kiện in vitro
Dòng tế bào ung thƣ
Tế bào ung thư vú T47D

Phƣơng pháp
xử lý

Kết quả

Phân
mảnh - Các phân mảnh protein gây độc
protein RIPS tế bào (IC50 = 2,8 µg/mL)
phân lập từ lá
- Kích thích quá trình tự chết với
biểu hiện của p53 (tăng 59,4%) và
BCl-2 (giảm 63%)

- Tế bào ung thư dạ dày
- Ung thư tuyến tụy
- Ung thư buồng trứng

Dịch
chiết

- Ung thư biểu mô H2452
- Ung thư vú MCF-7
- Ung thư phổi LU-1
- Ung thư vú MCF-7
- Ung thư biểu mô KB

Phân
đoạn
dichloromethan
từ dịch chiết
methanol lá Đu
đủ

Ức chế đáng kể sự phát triển của tế
bào ung thư phổi (IC50 tương ứng
18,21 µg/mL), tế bào ung thư vú
(IC50 tương ứng 19,16 µg/mL) và
tế bào ung thư biểu mô (IC50 tương
ứng 18,44 µg/mL)


11
- Ung thư biểu mô KB

Chất tinh khiết Carpaine và Pseudocarpaine ức

- Ung thư máu HL-60

Carpaine
và chế đáng kể sự phát triển của tế

- Tăng cường chức năng miễn dịch

Acid Protocatechui: 0,11 mg/g
Acid ρ-coumaric: 0,33 mg/g

- Ức chế enzyme ở pha I và II trong chu
kỳ phân bào

Acid Caffeic: 0,25 mg/g

- Ức chế sự kết dính tế bào và xâm lấn

Kaempferol: 0,03 mg/g

- Cảm ứng quá trình tự chết

Quercetin: 0,04 mg/g

- Ức chế sự truyền tín hiệu
- Ngăn chặn sự hình thành mạch máu
trong khối u.


12

Nhóm chất: Alcaloid
Nghiên cứu in vitro có tác dụng ức chế
các tế bào ung thư:
Carpaine


lá Đu đủ bằng nước làm tăng số lượng tiểu cầu và làm giảm thời gian đông máu ở
chuột.

ca
RFU) phân lập từ lá Đu đủ ở nồng độ thử nghiệm cao nhất (tương ứng 20 và 30
µg/mL) nhưng không mạnh khi so với chất đối chứng là tamoxifen (là 3100 RFU ở
nồng độ thử 20 µg/mL) [6].
1.5. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO
Hoạt tính gây độc tế bào được thử theo phương pháp của Scudiero D.A. và cộng
sự [29]. Đây là phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được viện Ung thư Quốc gia
(NIC) Maryland, Hoa Kỳ xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn, nhằm sàng lọc,
phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều
kiện in vitro.
trong thử nghiệm trên các dòng tế bào ung thư ở mức độ in vitro,
,
phương pháp tetrazolium (MTT) được sử dụng phổ biến.
1.5.1. Phƣơng pháp MTT
Phương pháp này lần đầu tiên được miêu tả bởi Tim Mosmann trên tạp chí
Immunological Methods năm 1983 [11]. Theo tác giả, muối tetrazolium được dùng để
triển khai phép thử so màu, qua đó đánh giá về sự sống sót và khả năng phát triển của
tế bào động vật. Nguyên lý của phép thử là vòng tetrazolium bám chặt vào ti thể của tế
bào hoạt động, dưới tác dụng của enzym dehydrogenase, màu vàng của MTT biến đổi
thành màu tím formazan. Kết quả đọc trên máy quang phổ và có độ chính xác cao.
Phương pháp được dùng để đo độ độc của chất nghiên cứu, khả năng phát triển và hoạt
động của tế bào.

Tetrazolium (màu vàng)

Formaran (màu tím)



Hình 2.1. Lá Đu đủ đực và Bột lá Đu đủ đực
2.1.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu
Dung môi chiết ethyl acetate.
Một số hóa chất khác cũng được sử dụng.
Các thiết bị xác định cấu trúc chất: Phổ khối GC-MS.
Ngoài ra còn dùng một số trang thiết bị khác như máy chất quay chân không,
máy sấy, máy nung, máy siêu âm, cân phân tích, cốc thủy tinh, binh tam giác, các loại
pipet, bình định mức, giấy lọc,…


16
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Xác định một số chỉ tiêu hóa lí
2.2.1.1. Độ ẩm
- Tiến hành :
Chuẩn bị các cốc sứ được rửa sạch, được đánh số thứ tự, và được sấy khô trong
tủ sấy đến khối lương không đổi m0. Sấy xong bỏ vào bình hút ẩm cho đến khi đạt
nhiệt độ phòng thì cân khối lượng các cốc sứ.
Mẫu để xác định độ ẩm là mẫu nguyên liệu lá đu đủ đực, cân lấy khối lượng
chính xác m1 trên cân phân tích, cho vào cốc sứ chuẩn bị sẵn và đem đi sấy ở nhiệt độ
100°C. Cứ sau 2 giờ lấy ra để trong bình hút ẩm cho nguội đến nhiệt độ phòng rồi cân
đến khối lượng mẫu không đổi m2.
- Cách tính độ ẩm:
Độ ẩm của mỗi chén là hiệu số khối lượng giữa khối lượng mẫu trước và sau
khi cân. Suy ra độ ẩm trung bình của 5 mẫu.
Độ ẩm được tính theo công thức sau :

%
Trong đó: