BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

MẠC THỊ THANH HUYỀN
MSV: 1101228

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH
THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA THÂN RỄ
TAM THẤT HOANG
(PANAX STIPULEANATUS TSAI & FENG)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI 2016


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

MẠC THỊ THANH HUYỀN
MSV: 1101228

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH
THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA THÂN RỄ
TAM THẤT HOANG
(PANAX STIPULEANATUS TSAI & FENG)

Người hướng dẫn:
1. TS. Đỗ Thị Hà
2. TS. Hà Vân Oanh
Nơi thực hiện:

Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 12 tháng 5 năm 2016
Sinh viên
Mạc Thị Thanh Huyền


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ.............................................................................................................1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN .......................................................................................2
1.1. Vài nét về chi Panax L. ....................................................................................2
1.1.1. Vị trí phân loại và phân bố của chi Panax L. ............................................2
1.1.2. Đặc điểm thực vật của chi Panax L. ..........................................................3
1.1.3. Thành phần hóa học chính của các loài thuộc chi Panax L. .....................3
1.1.4. Tác dụng dược lý một số loài trong chi Panax L. ......................................9
1.2. Tam thất hoang (TTH) ....................................................................................10
1.2.1. Thực vật học .............................................................................................10
1.2.2. Thành phần hóa học .................................................................................11
1.2.3. Tác dụng dược lý và công dụng ...............................................................13
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................15
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu .....................................................................................15
2.2. Hoá chất và trang thiết bị ...............................................................................15
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................17
2.3.1. Giám định tên khoa học............................................................................17
2.3.2. Nghiên cứu về hoá học .............................................................................17
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN .................................19
3.1. Giám định tên khoa học tam thất hoang .........................................................19
3.2. Định tính các nhóm chất hữu cơ thƣờng gặp bằng phản ứng hóa học ...........19

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu

Giải nghĩa

13

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân carbon 13

1

C-NMR

H- NMR

Phổ cộng hƣởng từ proton

DCM

Dicloromethan

Glu

Glucose
Heteronuclear mutiple bond connectivity (phổ

HMBC

tƣơng tác giữa carbon và hydro xa nhau)
Heteronuclear single quantum coherence (phổ


TT

Thuốc thử

TTH

Tam thất hoang

UV254

Ánh sáng tử ngoại bƣớc sóng 254 nm

UV365

Ánh sáng tử ngoại bƣớc sóng 365 nm

Xyl

Xylose


DANH MỤC CÁC BẢNG
STT
Bảng 1.1
Bảng 1.2

Tên bảng
Phân bố của các loài thuộc chi Panax L.
Saponin dẫn chất 20(S)-protopanaxadiol và 20(S)protopanaxatriol

thất hoang

8

12

Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ thƣờng
Bảng 3.1

gặp trong thân rễ tam thất hoang bằng phản ứng

25

hóa học
Bảng 3.2

Phổ 1H,
(9) [44]

13

C-NMR của PS04 và chất tham khảo

33


DANH MỤC CÁC HÌNH
STT

Tên hình

dicloromethan (D) và n-hexan (n-H) của TTH sau

27

khi nhúng TT H2SO4 10%/ EtOH và hơ nóng
Hình 3.3

Sắc ký đồ phân đoạn n-BuOH

28

Hình 3.4

Sơ đồ phân lập chất PS04 từ tam thất hoang

30

Hình 3.5

Sắc ký đồ của cao n-BuOH, phân đoạn Pđ B và
chất PS04

31

Hình 3.6

Cấu trúc hóa học của hợp chất PS04

35


3. Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hóa học của hợp chất phân lập
đƣợc.


2

CHƢƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. Vài nét về chi Panax L.
1.1.1. Vị trí phân loại và phân bố của chi Panax L.
Vị trí của chi Panax L. trong hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan
(1987) [1]:
Giới Thực vật (Planta)
Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta)
Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida)
Phân lớp Hoa hồng (Rosidae)
Bộ Hoa tán (Apiales)
Họ Ngũ gia bì (Nhân sâm) (Araliaceae)
Chi Panax L.
Theo trang The Plant list [74] có 12 loài và 1 thứ dƣới loài thuộc chi
Panax L. đƣợc chấp nhận. Phân bố của 12 loài nhƣ trong bảng sau:
Bảng 1.1. Phân bố của các loài thuộc chi Panax L. [74]
STT

Loài

Phân bố
Từ dãy Himalaya đến miền trung

1



6

Panax quinquefolius L.

Canada, Mỹ.

4


3

7

8
9
10
11
12

Panax sokpayensis Shiva

Vùng Sikkim - Ấn Độ.

K.Sharma & Pandit
Panax stipuleanatus Tsai

&

Feng

thuộc chi Panax L.. Các nhà khoa học đã chiết tách và xác định cấu trúc gần
300 saponin từ các loài thuộc chi này [67], gồm các saponin dẫn chất của 20


4

(S)-protopanaxadiol và 20 (S)-protopanaxatriol, saponin khung dammaran
khác, saponin dẫn chất ocotillol, saponin dẫn chất của acid oleanolic. Các loại
saponin đƣợc trình bày trong các bảng dƣới đây.
Bảng 1.2 Saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxadiol và 20(S)protopanaxatriol
STT
1

2

3

Tên
Ginsenosid Rb1

Ginsenosid Rb2
Notoginsenosid

Kiểu
(A)

(A)

(A)


G1C2-G1C

G1C6-G1C

G1C2-G1C

Glc6-Ara(p)

2

G1C -G1C
Glc2-Glc2-

G1C6-G1C6Xyl

P. ginseng [27];
P. notoginseng [64]
P. ginseng [34];
P. notoginseng [23]
P. notoginseng [69]

Glc6- Glc

P. notoginseng [69]

Glc

Glc

P. ginseng [67]

R1O

B

HO
OR1

R1=R2=H: 20(S)-protopanaxadiol

R1=R2=H: 20(S)-protopanaxatriol


5

Bảng 1.3 Saponin khung dammaran khác
STT
1

Tên
Majonosid F4

2

Chikusetsusaponin

Loại
(A)

R1
Glc

OH

Glc

H

P. vietnamensis
[24]

(B)

H

OH

H

Glc

P. vietnamensis
[24]

(C)

Glc

-

-


OR3

B

C

R1O

R1O
R2

O

R4O


6

Bảng 1.4. Saponin dẫn chất ocotillol
Kiểu

STT

Tên

1

Pseudoginsenosid
F11



(B)

Glc2-Xyl

P. japonicus [66]
P. japonicus [66]

Ghi chú:
OH

OH

B

A
O

O

OH

HO

OH

HO
OR

OR


Glc A3- Glc
Stipuleanosid R1
\
4
-Ara(f)

H

P. stipuleanatus [52]

3

Glc A3- Glc
Stipuleanosid R2
\
4
-Ara(f)

Glc

P. stipuleanatus [52]

1.1.3.2. Hợp chất polyacetylen
Polyacetylen thƣờng là các hydrocarbon mạch thẳng 17 và 18 carbon
với những nhóm chất liên kết. Đó là đặc điểm của đa số hợp chất có chứa một
đầu là nhóm 3-hydroxyl (hoặc 3-oxo) heptadeca-1-en-4,6-diyn, đầu còn lại
của hợp chất là chuỗi C7H15 [21], [43], [46].



- Heptadeca-l-en-9,10-epoxy-4,6-diyn-3,8-diol
- 3-oxo-9,10-epoxy-heptadeca-1 -en-4,6-diyn
- 6,7-epoxy-13-tetradecen-1,3-diyn
- 1,2,9,10-diepoxy-4,6-heptadecadiyn-3-on

3

P. notoginseng

- 8-acetoxy-9,10-epoxy-l-heptadecen-4,6-diyn-3-ol
10-metoxyheptadeca-1 -en-4,6-diyn-3,9-diol
- Panaxatriol

4

P. vietnamensis

- Panaxynol
- 10-acetoxy-hetadeca-8 (E) -en-4,6-diyn-3-ol
- Heptadeca-1,8 (E)-dien-4,6-diyn-3,10-diol
- Heptadeca-1,8(Z)-dien-4,6-diyn-3,10-diol
- Heptadeca-1,8(E), 10 (Z)-trien-4,6-diyn-3,12-diol


9

1.1.4. Tác dụng dược lý một số loài trong chi Panax L.
Trong chi Panax L., có một số loài đã đƣợc nghiên cứu nhiều về tác
dụng dƣợc lý nhƣ: nhân sâm (Panax ginseng), tam thất (Panax notoginseng),
sâm Mỹ (Panax quinquefolius), sâm Việt Nam (Panax vietnamensis).

Tam thất hoang còn gọi là dã tam thất. Tên khoa học: Panax
stipuleanatus Tsai & Feng, thuộc họ Ngũ gia bì (Nhân sâm) Araliaceae.
Tam thất hoang thuộc cây thảo, sống lâu năm, cao 25 – 75 cm; thân rễ
mập nằm ngang, có nhiều vết lõm do vết thân để lại, ít phân nhánh. Mỗi khóm
thƣờng có 1 thân mang lá, ít khi 2-3. Lá kép chân vịt, gồm 1-3 cái, mọc vòng
ở ngọn; cuống dài 5-10 cm. Lá chét 5, có cuống ngắn, hình thuôn hay mác
thuôn, dài 5-13 cm, rộng 2-4 cm, nhọn hai đầu, mép cuống hoa dài 1-1,5 cm.
Hoa màu vàng xanh với 5 lá đài nhỏ, 5 cánh hoa, 5 nhị và bầu 2 ô. Quả mọng,
gần hình cầu dẹp, đƣờng kính 0,6-1,2 cm, khi chín màu đỏ. Quả gồm 1 hoặc 2
hạt màu xám trắng. Ra hoa tháng 4-5, có quả tháng 5-9 [16].

Hình 1.1. Tam thất hoang


11

Loài Panax stipuleanatus Tsai & Feng đƣợc hai nhà khoa học ngƣời
Trung Quốc công bố năm 1975. Loài này đƣợc tìm thấy đầu tiên tại khu rừng
Mã Quan, Trung Quốc (phía bắc Việt Nam) ở độ cao 1100-1700 m so với mặt
nƣớc biển [62]. Cho đến nay, trên toàn thế giới, loài này mới chỉ tìm thấy ở
tỉnh Vân Nam (Trung Quốc) và một vài điểm ở Vƣờn Quốc gia Hoàng Liên
Sơn thuộc tỉnh Lào Cai, Việt Nam [5].
1.2.2. Thành phần hóa học
Các kết quả nghiên cứu thành phần hóa học trƣớc đây của tam thất
hoang chỉ ra rằng phần thân rễ TTH chứa nhiều saponin khung oleanan (hầu
hết đều là saponin dẫn chất acid oleanolic) với hàm lƣợng tƣơng đối cao cùng
một số saponin khung dammaran với hàm lƣợng thấp. Năm 1985, nhóm các
nhà nghiên cứu ở Trung Quốc phân lập 2 saponin dẫn chất acid oleanolic,
stipuleanosid R1 và R2, từ dịch chiết methanol của thân rễ TTH [52].



2

Stipuleanosid R2 (2)

[52]

3

Aralosid A methyl este (3)

[44]

4

Chikusetsusaponin IVa (4)

[44]

5

Pseudoginsenosid Rp1 methyl este (5)

[44]

6

Pseudoginsenosid Rt1 (6)

[44]


[44]

12

Stipuleanosid R2 methyl este (12)

[44]

13

Ginsenosid Rb1 (13)

[36]

14

Ginsenosid Rb3 (14)

[36]

15

Ginsenosid Rc (15)

[36]

16

Ginsenosid Rd (16)


Ngoài ra, nhóm nghiên cứu cũng đã phân lập đƣợc một số hợp chất
khác từ TTH gồm 3 polyacetylen (trong đó stipudiol và stipuol là 2 chất mới,
(3R,9R,10R)- panaxytriol là chất đã biết), và các hợp chất khác: spathulenol
(là serquiterpen) và 9-docosenoic acid methyl ester (acid béo) [43].
Ở Việt Nam, nghiên cứu về thành phần hóa học của TTH vẫn còn mới
mẻ. Năm 2002, Trần Công Luận đã phát hiện sự có mặt của hai nhóm chất
chính là polyacetylen và saponin cùng với acid béo, acid amin, tanin bằng
phƣơng pháp thử định tính hóa học và phân tích sơ bộ TLC. Đồng thời bằng
cách thủy phân saponin rồi kết tinh sapogenin toàn phần thu đƣợc acid
oleanolic [12], [13].
1.2.3. Tác dụng dược lý và công dụng
 Tác dụng dược lý
Năm 2002, Trần Công Luận và cộng sự đã khảo sát: Cao thân rễ và rễ
củ TTH thể hiện độc tính cấp đƣờng uống với liều LD50 = 8,8 g/kg. Cao TTH
có tác dụng phục hồi thời gian ngủ bị rút ngắn bởi stress, đƣa về trạng thái
bình thƣờng ở các liều thử nghiệm 44, 88, 176 mg/kg. Cao saponin toàn phần
của TTH có tác dụng chống oxy hóa, ức chế sự hình thành malonyl dialdehyd
ở nồng độ 25, 50, 100 μg/ml [12].
Nhóm nghiên cứu của Chun L. (2010) [44] đã thử tác dụng gây độc tế
bào ung thƣ máu (HL-60) và ruột kết (HCT-116) của hai hợp chất saponin từ
2 đến 12 (theo bảng 1.7), thấy rằng các chất đều có tác dụng gây độc tế bào ở
mức độ khác nhau. Chất 11 với giá trị IC50 là 4,44 và 0,63 µM có tác dụng ức
chế tế bào ung thƣ bạch cầu HL-60 và tế bào ung thƣ ruột kết HCT-116 đáng
kể. Chất 5 có tác dụng gây độc tế bào ở giá trị IC50 là 6,50 µM đối với tế bào
ung thƣ ruột kết, nhƣng lại biểu hiện gây độc tế bào kém hơn ở giá trị IC50 =
41,45 µM. Ngoài ra hai chất đều làm kích thích quá trình chết tự nhiên của
các tế bào này. Chất 4, 8 có tác dụng gây độc tế bào ở giá trị IC50 là 75,94 và



Dƣợc liệu với số hiệu mẫu: 71DV16 (Phụ lục 1).
Xử lý nguyên liệu: sau khi thu hái đƣợc rửa sạch, sấy khô ở 50ºC đến
khi đạt độ ẩm khoảng 5%. Sau đó đƣợc cắt miếng mỏng, xay nhỏ làm mẫu
nghiên cứu và đƣợc bảo quản trong túi kín.

Hình 2.1 : Nguyên liệu Panax stipuleanatus Tsai & Feng tƣơi
2.2. Hoá chất và trang thiết bị
Hoá chất:
-

Dung

môi

n-hexan,

ethyl

acetat,

methanol,

cloroform,

aceton,

dicloromethan… là dung môi công nghiệp đã cất lại; ethanol 96%, nƣớc cất


16


- Máy scan CanoScan LiDe 100 (Canon - Trung Quốc).
- Máy đo phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR): BRUKER AVANCE AM500
FT – NMR của Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam, chất chuẩn nội là tetramethyl silan.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Giám định tên khoa học
Mẫu TTH sau khi đƣợc thu hái đƣợc giám định tên khoa học dựa trên
đặc điểm về thực vật và đối chiếu với các tài liệu chuyên khoa phân loại thực
vật nhƣ: “Danh mục các loài thực vật Việt Nam”, “Flora of China” tại Khoa
Tài nguyên Dƣợc liệu, Viện Dƣợc liệu.
2.3.2. Nghiên cứu về hoá học
2.3.2.1. Phương pháp định tính
Định tính các nhóm chất hữu cơ thƣờng gặp trong dƣợc liệu theo
phƣơng pháp hóa học ghi trong sách Thực tập Dƣợc liệu và Dƣợc liệu học tập
1, trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội [11], [2].
2.3.2.2. Phương pháp tách chiết, phân lập và xác định cấu trúc chất tinh khiết
từ tam thất hoang
Phƣơng pháp chiết xuất
Thân rễ Tam thất hoang đƣợc chiết hồi lƣu 3 lần với ethanol 70 % ở
nhiệt độ 70oC. Tiến hành lọc loại bã dƣợc liệu, gộp dịch lọc, cất thu hồi dung
môi dƣới áp suất giảm tại 50oC thu đƣợc cao khô. Cao khô này đem phân tán
trong nƣớc rồi lắc lần lƣợt với các dung môi có độ phân cực tăng dần (nhexan, dicloromethan và n-butanol), thu đƣợc các phân đoạn tƣơng ứng.
Phƣơng pháp phân lập các chất
- Lựa chọn phân đoạn để tiến hành phân lập.
- Phân lập các hợp chất bằng sắc ký cột.