NGHIÊN CứU PHƯƠNG PHáP Cố ĐịNH KHáNG THể
ứNG DụNG TRONG PHÂN TíCH NồNG Độ HCG BETA ở NG-ời
BằNG PHƯƠNG PHáP HUỳNH QUANG


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
AFP

: Alpha foeto protein

ADN

: Axit deoxiribonucleic

BSA

: Bovine serum albumin

DTBS

: Dị tật bẩm sinh

DTTA

: Dietilentriamintetraaxetic axit

ELISA : Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
ECL

: Electrode Chemi Luminescence



RNA

: Axít ribonucleic

STV

: Streptavidin

TNT

: Trinitrotoluen

TMB

: 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine

TMBDI : 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine diimine
TPA

: Tripropylamin


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU.......................................................................................................... 1
I. LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI .................................................................................... 1
II. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU ........................................................................... 2
III. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU........................................................................ 2
IV. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................. 3
V. NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU........................................................................... 3

Luminescence) .................................................................................... 22
I.4.2.3. Phương pháp huỳnh quang. ................................................... 23
CHƢƠNG II: TIẾN TRÌNH THỰC NGHIỆM......................................... 28
II.1. CÁCH LẤY MẪU HUYẾT THANH CHO XÉT NGHIỆM. ............................... 28

II.1.1. Chuẩn bị dụng cụ ............................................................................. 28
II.1.2. Các bước tiến hành .......................................................................... 28
II.2. CỐ ĐỊNH KHÁNG THỂ HCG TRÊN BỀ MẶT GIẾNG POLYSTYREN ................... 30

II.2.1. Chuẩn bị. .......................................................................................... 30
II.2.1.1. Chuẩn bị dung dịch đệm photphat 0,01M pH = 4,9 (PBS 1X) .. 30
II.2.1.2. Chuẩn bị dung dịch BSA 1% (Pha 14mL vào ống dung
tích 15mL) .......................................................................................... 31
II.2.1.3. Chuẩn bị dung dịch NaN3 5%............................................... 31
II.2.1.4. Chuẩn bị dung dịch kháng thể HCG..................................... 31
II.2.1.5. Quy trình cố định kháng thể HCG lên bề mặt giếng polystyren. .. 31
II.3. QUY TRÌNH PHÂN TÍCH KHÁNG NGUYÊN HCG. ...................................... 32
II.4. KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA NỒNG ĐỘ KHÁNG THỂ CỐ ĐỊNH HCG TRÊN
BỀ MẶT GIẾNG. ......................................................................................... 34
II.5. KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA THỜI GIAN CỐ ĐỊNH KHÁNG THỂ HCG
TRÊN BỀ MẶT GIẾNG. ............................................................................... 35
II.6. KHẢO SÁT ĐỘ LẶP CỦA PHÉP PHÂN TÍCH VÀ ĐỘ BỀN CỦA KHÁNG
THỂ HCG. .................................................................................................. 35
II.7. XÁC ĐỊNH GIỚI HẠN PHÁT HIỆN (LOD) VÀ GIỚI HẠN ĐỊNH LƢỢNG (LOQ). . 35
II.8. KHẢO SÁT ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA PHÉP PHÂN TÍCH VỚI CÁC KHÁNG
NGUYÊN PAPP-A, AFP, FREE B-HCG. ........................................................ 36
II.9. XÂY DỰNG ĐƢỜNG CHUẨN. .................................................................... 36
II.10. ĐO MẪU THẬT. ....................................................................................... 36



Hình 1.12. Quy trình phân tích hCG dựa vào phổ huỳnh quang của phức giữa
Eu3+ và NTAA. ............................................................................................... 26
Biểu đồ 3.1. Cƣờng độ huỳnh quang của mẫu chuẩn ở các giếng đƣợc cố định với
nồng độ hCG khác nhau. ................................................................................... 38
Biểu đồ 3.2: Cƣờng độ huỳnh quang của mẫu chuẩn ứng với các thời gian cố
định khác nhau. ............................................................................................... 40
Biểu đồ 3.3: Cƣờng độ huỳnh quang của 10 mẫu chuẩn hCG (nồng độ 1030
ng/mL) . .......................................................................................................... 41
Biểu đồ 3.4. Tín hiệu huỳnh quang lặp mẫu chuẩn hCG nồng độ 1030 ng/mL
trong 4 tuần ..................................................................................................... 43
Hình 3.1. Tín hiệu huỳnh quang của 10 mẫu trắng ........................................ 44
Hình 3.2. Tín hiệu huỳnh quang của 3 chuẩn PAPP-A, AFP, free β-hCG..... 46
Hình 3.3: Tín hiệu huỳnh quang của 6 mẫu chuẩn ......................................... 47
Biểu đồ 3.5. Đƣờng chuẩn của mẫu chuẩn hCG. ........................................... 48
Hình 3.3: Tín hiệu đo huỳnh quang của 19 mẫu huyết thanh......................... 50


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Các phản ứng hóa học sử dụng trong cố định hóa học. ................. 12
Bảng 1.2: Một số chất huỳnh quang hay sử dụng trong cảm biến sinh học ... 25
Bảng 1.3: Phổ huỳnh quang của lantanoit với NTAA .................................... 26
Bảng 3.1. Cƣờng độ huỳnh quang của các mẫu chuẩn phụ thuộc vào nồng độ
kháng thể hCG cố định trên bề mặt giếng. ..................................................... 37
Bảng 3.2. Cƣờng độ huỳnh quang của các mẫu chuẩn phụ thuộc vào thời gian
cố định kháng thể hCG trên bề mặt giếng. ..................................................... 39
Bảng 3.3. Cƣờng độ huỳnh quang của 10 mẫu chuẩn hCG có nồng độ 1030
ng/mL. ............................................................................................................ 41
Bảng 3.4. Kết quả cƣờng độ huỳnh quang của 10 mẫu chuẩn D trong mỗi tuần ... 42
Bảng 3.5. Giá trị cƣờng độ huỳnh quang của 10 mẫu trắng (mẫu A). ........... 45
Bảng 3.6. Kết quả cƣờng độ huỳnh quang của các chuẩn PAPP-A, AFP, free

học liên quan đến lĩnh vực này luôn có số lƣợng lớn nhất. Các nghiên cứu
cũng chỉ ra những tiến bộ vƣợt bậc trong việc nâng cao độ nhạy, độ chính
xác, độ đặc hiệu của phép phân tích từ cấp độ nguyên tử, phân tử, đại phân tử
đến tế bào, cho phép ứng dụng không chỉ trong lĩnh vực y học mà còn có ứng
1


dụng rộng rãi trong các lĩnh vực khác nhƣ hóa học, môi trƣờng hay thực
phẩm. Trong đó, cảm biến sinh học là một hƣớng nghiên cứu mới, có tiềm
năng trong tƣơng lai, giúp các phép phân tích trở nên đơn gian, gọn nhẹ, tiết
kiệm mà vẫn chính xác. Việc chế tạo các cảm biến sinh học phụ thuộc rất
nhiều vào kỹ thuật cố định các đầu thu sinh học lên bề mặt đế (điện cực,
màng hay các giếng polymer), các kỹ thuật này quyết định trực tiếp đến độ
nhạy, độ bền, độ lặp lại của phép phân tích. Trong 3 kỹ thuật cố định phổ biến
hiện nay gồm: 1) liên kết hóa học, 2) tƣơng tác sinh học và 3) hấp phụ vật lý
thì kỹ thuật thứ 3 có các ƣu điểm hơn hai phƣơng pháp kia là đơn giản, không
đòi hỏi quá trình biến tính các đầu thu sinh học. Hơn nữa, việc lựa chọn kỹ
thuật dò trong chế tạo cảm biến sinh học cũng đóng vai trò quan trọng quyết
định đến độ nhạy của cảm biến. Phƣơng pháp đo phổ huỳnh quang đƣợc xem
là phƣơng pháp có độ nhạy và độ chính xác cao, các nghiên cứu gần đây cho
phép việc ứng dụng các phân tử phát huỳnh quang trong đánh dấu các đầu thu
sinh học trở lên dễ dàng và thuận lợi hơn nhiều. Vì vậy việc áp dụng phổ
huỳnh quang trong phân tích sinh hóa ngày càng đƣợc các nhóm nghiên cứu
quan tâm.
Với những lí do trên chúng tôi lựa chon đề tài: “Nghiên cứu phƣơng
pháp cố định kháng thể ứng dụng trong phân tích nồng độ hCG
beta ở ngƣời bằng phƣơng pháp huỳnh quang”.
II. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU
Mục đích của đề tài này bao gồm:
1) Tìm ra điều kiện tối ƣu để cố định kháng thể hCG lên bề mặt giếng

Theo Hiệp hội quốc tế về hóa học ứng dụng (IUPAC), cảm biến sinh
học là một thiết bị phân tích có khả năng cung cấp thông tin phân tích định
lƣợng hoặc bán định lƣợng, bao gồm phần tử nhận biết sinh học (bioreceptor)
kết hợp trực tiếp với một phần tử chuyển đổi (transducer).[3,29]
Cảm biến sinh học là thiết bị sử dụng các tác nhân sinh học nhƣ enzym,
các kháng thể, protein, tế bào... để phát hiện, đo đạc hoặc phân tích hoá chất .
Do vậy cấu tạo của cảm biến sinh học bao gồm 3 thành phần cơ bản: thành
phần hoá học, thành phần sinh học và thành phần vật lý.
Năm 1956 giáo sƣ Leyland D.Clark công bố bài báo đầu tiên về điện
cực oxy hoá ứng dụng trong phân tích glucose trong máu, đây đƣợc xem là thí
nghiệm đầu tiên có liên quan đến cảm biến sinh học.[17,33] Trong những
năm tiếp theo ông tiếp tục thực hiện rất nhiều thí nghiệm nhằm cố gắng mở
rộng khả năng hoạt động của cảm biến nhƣ phát hiện đƣợc thêm nhiều tác
nhân, nâng cao độ chính xác của cảm biến. Năm 1962, ông đã thuyết trình
một bài về cảm biến sinh học tại hội nghị Khoa học Hàn lâm New York và
đƣa ra mô hình đầu tiên về cảm biến sinh học. [7,25]
Theo mô hình này thì cảm biến sinh học bao gồm điện cực oxy hóa,
trên đó có màng giữ enzyme glucosidase. Phản ứng oxi hóa - khử giữa
enzyme glucosidase với glucose trong môi trƣờng phản ứng làm cho cƣờng
độ dòng đi qua điện cực tăng lên. Khi mật độ glucose trong môi trƣờng phản
ứng giảm thì mật độ chất oxi hóa trên bề mặt điện cực cũng giảm một cách
tƣơng ứng. Từ sự thay đổi đó, Clark đã phát hiện ra sự thay đổi của nồng độ
glucose trong môi trƣờng cần kiểm tra.[25]
4


Hình 1.1. Mô hình cảm biến sinh học đầu tiên.
Dựa trên những nghiên cứu ban đầu của Clark, nhiều nhóm nhà khoa
học đã có những công bố chi tiết và chế tạo thành công các loại cảm biến sinh
học dùng để đo nồng độ ure, CO2, O2, C2H5OH .v.v… trong những năm tiếp

cơ, thuốc bảo vệ thực vật, chất bảo quản thực phẩm, amino axit, các dƣợc chất
(paracetamol, aspirin, penicillin…), TNT, các tác nhân thần kinh khác, các hợp
chất gây nghiện hoặc ngay cả các kim loại nặng …[7,25]
Các vi khuẩn: các vi khuẩn thƣờng đƣợc phát hiện bởi các cảm biến
sinh học là vi khuẩn Ecoli, vi khuẩn Candida, vi khuẩn bệnh than …[7,25]
Các phân tử sinh học có kích thƣớc lớn: những phân tử này có thể là
các phân tử ADN, RNA, protein, enzyme, các hoóc-môn,… giúp cho quá
trình chẩn đoán bệnh ở các bệnh viện.[7,25]
I.1.4. Đầu thu sinh học
Đầu thu sinh học là những phân tử sinh học có phản ứng trực tiếp với
tác nhân cần phân tích. Các phản ứng này có ý nghĩa đặc biệt quan trọng,
quyết định đến độ nhạy và độ chọn lọc của phép phân tích. Thông thƣờng,
đây là các phản ứng sinh hóa dựa trên cơ chế “khóa – chìa” có độ đặc hiệu
cao, có nghĩa là đầu thu sinh học chỉ tác dụng với tác nhân cần phân tích mà
không phản ứng với bất kỳ các tác nhân nào khác có mặt trong hỗn hợp mẫu
phân tích, vì vậy phép phân tích sẽ cho độ chọn lọc và độ nhạy cao[8,9]. Việc
phân loại các đầu thu sinh học thƣờng dựa vào loại phân tử sinh học đƣợc sử
dụng trong cảm biến sinh học, bao gồm:
a. Đầu thu làm từ enzyme: là dạng đầu thu đƣợc sử dụng sớm và phổ
biến nhất trong giai đoạn đầu phát triển của cảm biến sinh học. Các đầu thu
này thƣờng làm từ các enzyme urease, glucosidase,...[19,30]

7


b. Đầu thu làm từ các kháng thể/kháng nguyên: Các đầu thu dạng
này có đặc điểm là tính chọn lọc rất cao, các liên kết đƣợc tạo thành khá
mạnh.[15,35]
c. Đầu thu làm từ protein: Rất nhiều cảm biến có đầu thu sinh học làm
từ các protein nhƣ cảm biến phát hiện hoóc-môn, xác định các chất kích thích


Covalent
Immobilization
Liên kết
hóa học

Active

Active

Bio-affinity
Immobilization
Tương tác
sinh học

Hình 1.3. Các phƣơng pháp cơ bản cố định đầu thu sinh học.
8


Việc sử dụng các loại tác nhân khác nhau trong cố định các đầu thu
sinh học sẽ ảnh hƣởng đến hoạt tính của chính các đầu thu sinh học này trên
bề mặt đế, quyết định đến độ nhạy và độ lặp lại của phép phân tích. Ƣu và
nhƣợc điểm của các tác nhân cố định sẽ đƣợc phân tích kỹ hơn trong mục I.2.
I.1.6. Bộ phận chuyển đổi tín hiệu
Bộ phận chuyển đổi tín hiệu giúp chuyển tín hiệu tạo ra từ đầu thu sinh
học hoặc chất cần phân tích khi có tƣơng tác giữa hai bộ phận này tới bộ phận
đọc và xử lý dữ liệu. Các dạng chuyển đổi tín hiệu bao gồm: điện hoá, quang,
tinh thể áp điện hoặc các hệ vi cơ. Độ nhạy của phép phân tích sẽ phụ thuộc
vào độ nhạy của quá trình chuyển đổi tín hiệu. Tùy thuộc vào đối tƣợng phân
tích và mục đích phân tích mà ngƣời ta lựa chọn các dạng chuyển đổi khác

ô nhiễm của môi trƣờng nhƣ cảm biến xác định nồng độ khí độc (CO2, H2S),
xác định dƣ lƣợng thuốc trừ sâu, xác định nồng độ của các kim loại nặng,
...[26,27]
c. Ứng dụng trong các tƣơng tác Ngƣời – Máy: Đây cũng là một lĩnh
vực mới mẻ có nhiều nghiên cứu, ứng dụng. Các cảm biến dạng này tập trung
trong nhận dạng các đặc trƣng sinh học của con ngƣời. Đây cũng là lĩnh vực
hứa hẹn có nhiều nghiên cứu, ứng dụng mới.[21]
d. Ứng dụng trong công nghệ sinh học: Ngày nay, khi công nghệ sinh
học phát triển, đồng thời với việc các chế phẩm sinh học đƣợc sản xuất rộng
rãi trên qui mô công nghiệp, cũng nhƣ tham gia ngày càng nhiều vào các quá
trình sản xuất khác thì một nhu cầu tất yếu nảy sinh, đó là việc theo dõi, quản
lý, điều khiển các quá trình sinh học nhƣ điều chỉnh lƣợng glucose trong quá
trình nuôi vi khuẩn..v.v.... Các cảm biến sinh học đã tỏ ra có nhiều ƣu điểm so

10


với các phƣơng pháp truyền thống nhƣ tính chọn lọc cao, đáp ứng nhanh, đơn
giản và chính xác.[21]
I.2. TỔNG QUAN VỀ PHƢƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH PROTEIN
Cố định protein (hay kháng thể, antibody) là quá trình gắn các phân tử
protein lên một bề mặt đế sử dụng làm các đầu thu sinh học. Trong một số
trƣờng hợp nhất định, việc cố định có thể làm mất một phần hoặc toàn bộ hoạt
tính của protein vì khuynh hƣớng gắn ngẫu nhiên và dễ bị biến dạng cấu trúc.
Vì vậy, để quá trình cố định các kháng thể không làm mất hoạt tính sinh học
của protein thì việc lựa chọn bề mặt và phƣơng pháp cố định đóng vai trò
quyết định. Bề mặt đế cũng nhƣ quá trình cố định phải không làm ảnh hƣởng
đến cấu tạo và chức năng của các protein sau khi đƣợc cố định.[8,9]
Nhiều kĩ thuật cố định đã đƣợc phát triển trong những năm qua, chủ
yếu dựa trên ba cơ chế là: hấp phụ vật lý, liên kết hóa học và tƣơng tác sinh

12


phƣơng pháp này có trật tự sắp xếp cao, tƣơng tác tƣơng đối bền nên cảm
biến sinh học dạng này sẽ có độ nhạy và độ lặp cao. Tuy nhiên, việc cố định
protein theo phƣơng pháp này cũng có các hạn chế nhất định nhƣ: 1) cũng
giống nhƣ phƣơng pháp cố định hóa học, các protein cố định cũng cần đƣợc
gắn thêm các phân tử sinh học khác có tƣơng tác với bề mặt đế. Việc dùng
các phản ứng hóa học để gắn các phân tử sinh học sẽ làm bề mặt protein thay
đổi, giảm một phần hoạt tính. 2) Việc bảo quản và lƣu giữ các protein đã biến
tính cũng trở nên khó khăn hơn, thời hạn sử dụng ngắn hơn. 3) Việc biến tính
cũng làm tăng giá thành của sản phẩm. Và, 4) Quá trình phân tích sẽ phải
thực hiên qua nhiều bƣớc, tốn thời gian phân tích hơn các phƣơng pháp khác.
Một trong các tƣơng tác hay sử dụng trong cố định sinh học là tƣơng
tác giữa streptavidin và biotin. Hình 1.4 mô tả quá trình cố định Lectin-FITC
thông qua tƣơng tác của biotin-streptavidin-biotin.
Lectin-FITC

Lectin-FITC

HO HO HO HO
O O
O O

HO HO HO HO
O O
O O

STV


Bề mặt giếng cố
định kháng thể hCG

Hình 1.5. Cố định vật lý
Ƣu điểm của phƣơng pháp cố định vật lý là nó đơn giản, dễ thực hiện,
và nổi trội hơn cả so với hai phƣơng pháp đã nêu trên đó là phƣơng pháp này
dựa trên cơ chế hấp phụ nên tính chất, chức năng của protein không bị biến
tính trong quá trình cố định. [9]
Tuy nhiên, nhƣợc điểm của cơ chế hấp phụ là định hƣớng ngẫu nhiên,
sử dụng các tƣơng tác yếu, độ bền chắc của tƣơng tác lại bị phụ thuộc nhiều
vào tính chất bề mặt đế, pH, thời gian hấp phụ và nồng độ chất phân tích
(protein), các nhƣợc điểm này làm cho protein dễ bị rửa trôi bởi một số bộ
đệm hoặc chất tẩy rửa khi thực hiện phân tích các chất. Ngoài ra, các vấn đề
liên quan đến hiệu ứng phát tín hiệu tập trung và tín hiệu nền cao phát ra từ
tƣơng tác không đặc hiệu có thể dẫn đến tính toán sai số nồng độ chất phân
tích. Nhƣ vậy, cần phải tìm ra một loại giếng có thể đảm bảo đƣợc tính định
hƣớng, hiệu suất gắn kết kháng thể trên bề mặt cao, khó bị mất trong quá trình
sử dụng chất tẩy rửa và kháng thể sau khi cố định cũng có tính ổn định.

14


I.3. TỔNG QUAN VỀ CÁC KỸ THẬT PHÂN TÍCH DÒ
Bên cạnh phƣơng pháp cố định, các kỹ thuật phân tích cũng đóng vai trò
quan trọng trong việc chế tạo cảm biến sinh học, nó quyết định đến độ nhạy,
độ đặc hiệu và độ lặp của phép phân tích.[25] Các kỹ thuật phân tích thƣờng
đƣợc áp dụng trong cảm biến sinh học bao gồm: điện hóa, trắc quang, tinh thể
áp điện hoặc các hệ vi cơ.[26]
I.3.1.Tổng quan về kỹ thuật phân tích điện hóa.
Kỹ thuật điện hóa: là kỹ thuật chuyển đổi điện hoá dựa trên phản ứng oxi

Nhƣ đã nói ở trên, các ứng dụng môi trƣờng hoặc y sinh học đòi hỏi sự
đơn giản, nhanh chóng và cực nhạy của cảm biến sinh học. Điều này có thể
đạt đƣợc với cố định trên bề mặt vàng, vật liệu dạng carbon, silic, thạch anh,
hoặc thủy tinh.[23,39]
Trong thực tế, sự kết hợp của các hạt nano vàng hoặc chấm lƣợng tử
với việc sử dụng vi sợi cung cấp công nghệ mới cho sự phát triển của
cytochrome P450 cảm biến sinh học enzyme có độ nhạy cao và tiện dụng cho
mục đích nhất định. Mặt khác, cảm biến hóa học sợi quang có rất nhiều ứng
dụng trong các lĩnh vực khác nhau, chẳng hạn nhƣ phát hiện ma túy, cảm ứng
sinh học và y sinh. Gần đây, hydrogel đƣợc sử dụng giống nhƣ một loại cảm
biến dựa trên DNA đang nổi lên cho sử dụng cố định với hóa học sợi quang
16


[23]. So với các vật liệu khác, cố định trong hydrogel xảy ra trong không gian
3D cho phép tải công suất cao của các phân tử cảm ứng. Hydrogel
(polyacrylamide) là polyme ƣa nƣớc liên kết ngang [29] và có thể đƣợc thực
hiện bằng các hình thức khác nhau dao động từ màng mỏng đến các hạt
nano. Hydrogel đƣợc coi nhƣ một chất nền đơn giản cho cố định ADN với
nhiều lợi thế khác nhau, chẳng hạn nhƣ cái bẫy, phát hành kiểm soát, nâng
cao chất phân tích, và bảo vệ DNA. Tính năng độc đáo của hydrogel so với
các vật liệu khác là nó cung cấp cho cố định sinh học phân tử [32]. Hơn nữa,
tính minh bạch quang học tốt của hydrogel là nó cung cấp chiến lƣợc thuận
tiện để phát hiện trực quan. Phƣơng pháp chi tiết cho cố định cảm biến sinh
học DNA [23] trong gel polyacrylamide và vi hạt gel khối thƣờng đƣợc coi là
tiến bộ kỹ thuật trong lĩnh vực công nghệ cảm biến sinh học. Sự phát hiện đơn
phân tử cũng đã đƣợc phát triển dựa trên oxy hóa điện hóa của hydrazine để
phát hiện DNA [31]
I.3.3. Tổng quan về kỹ thuật áp điện (piezoelectric)
Kỹ thuật áp điện (piezoelectric): hoạt động dựa trên việc đo sự thay đổi

các thiết bị phức tạp, và độ chọn lọc của phƣơng pháp không cao.
I.4. TỔNG QUAN VỀ HCG VÀ CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HCG.
I.4.1. Vai trò, ý nghĩa của hCG
Human chorionic gonadotropin (hCG) là một hoóc-môn nội tiết tố đƣợc
sinh ra từ nhau thai của ngƣời mang thai. Hoóc-môn này có vai trò giúp phôi
thai bám vào thành tử cung[2,20]

18