TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN

NGUYỄN TÚ HƢƠNG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC
DICLOFENAC NATRI CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE
TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS
NUÔI CẤY TRONG MÔI TRƢỜNG CHUẨN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời và động vật

Hà Nội, 20 tháng 5 năm 2019


TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN

NGUYỄN TÚ HƢƠNG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC
DICLOFENAC NATRI CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE
TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS
NUÔI CẤY TRONG MÔI TRƢỜNG CHUẨN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời và động vật
Ngƣời hƣớng dẫn:

ThS. HÀ THỊ MINH TÂM


Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2019
Sinh viên

Nguyễn Tú Hƣơng


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
BC

: Cellulose vi khuẩn

cs

: Cộng sự

MTC

: Môi trƣờng chuẩn

PC

: Plant cellulose

OD

: Optical density

VLC

: Vật liệu cellulose

3.1.5. Xây dựng phương trình đường chuẩn của thuốc Diclofenac ........................ 17
3.1.6. Khảo sát khả năng hấp thụ màng BC ........................................................... 17
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................. 23
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu ......................................................... 7
Bảng 2.2. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ...................................................... 8
Bảng 2.3. Thành phần thuốc và khối lượng tương ứng ............................................. 9
Bảng 3.1. Giá trị OD hấp thụ thuốc của màng BC (n=3) (OD – 283 nm) .............. 19
Bảng 3.2. Lượng thuốc hấp thụ vào các màng BC tại thời điểm 2 giờ.................... 20
Bảng 3.3. Hiệu suất hấp thụ thuốc các loại màng BC trong 2 giờ .......................... 21


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của thuốc Diclofenac .................................................. 3
Hình 3.1. Màng BC đang hình thành ...................................................................... 14
Hình 3.2. Rửa màng dưới vòi nước .......................................................................... 15
Hình 3.3. Màng BC tinh chế..................................................................................... 16
Hình 3.4. Màng BC được chia vào các bình tam giác ............................................. 16
Hình 3.5. Phương trình đường chuẩn của diclofenac.............................................. 17
Hình 3.6. Chuẩn bị dịch đo quang phổ .................................................................... 18
Hình 3.7. Lượng thuốc hấp thụ vào các màng BC có sự khác biệt.......................... 20
Hình 3.8. Hiệu suất hấp thụ thuốc của các loại màng BC....................................... 21


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Diclofenac đƣợc biết là loại thuốc chống viêm không steroid. Thuốc

Thiết kế đƣợc hệ thống màng BC lên men từ môi trƣờng chuẩn đƣợc nạp
thuốc diclofenac natri.
Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc tạo màng BC hấp thụ thuốc nhiều nhất.
- Nhiệm vụ nghiên cứu:
Chế tạo ra vật liệu BC, xử lý vật liệu BC trƣớc khi hấp thụ thuốc diclofenac
natri, xác định lƣợng BC tạo thành, đánh giá độ tinh khiết vật liệu BC.
Khảo sát tối ƣu hóa khả năng hấp thụ thuốc diclofenac natri vào vật liệu BC.
Khảo sát đặc tính thuốc diclofenac natri trƣớc và sau khi đƣợc hấp thụ thuốc.
3. Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc Diclofenac natri của vật liệu Cellulose
tạo ra từ Gluconacetobacter xilinus nuôi cấy trong môi trƣờng chuẩn.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
- Ý nghĩa khoa học:
Xây dựng đƣợc quy trình tạo màng BC lên men trong môi trƣờng chuẩn.
- Ý nghĩa thực tiễn:
Từ kết quả nghiên cứu chọn ra đƣợc trƣờng hợp hấp thụ thuốc tốt nhất.
Từ kết quả nghiên cứu trên có thể áp dụng vào thực tiễn đời sống.
5. Tính mới của đề tài
- Nâng cao khả năng hấp thụ thuốc diclofenac natri trong điều trị giảm
đau, chống viêm.
- Khắc phục nhƣợc điểm của thuốc từ chính kết quả nghiên cứu áp dụng
vào điều trị bệnh.

2


NỘI DUNG
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu tổng quan đối tƣợng và lĩnh vực nghiên cứu
1.1.1. Giới thiệu về Diclofenac

- Cellulose vi khuẩn là sản phẩm trao đổi chất sơ cấp và tạo màng bảo vệ.
- BC là sản phẩm của chủng G.xylinum. Màng sinh học BC có cấu trúc,
đặc tính giống cellulose thực vật, tuy nhiên, chúng khác nhau về cấu trúc đại thể
[1]. Theo AJ. Brown (1886), BC gồm nhiều sợi siêu nhỏ có bản chất là
hemicellulose, có đƣờng kính là 1,5 nm, kết hợp với nhau tạo thành bó, các bó
hợp thành dãy, mỗi dãy khoảng 100 nm, rộng khoảng 3-8 nm.
- Tính chất độc đáo màng BC: độ tinh khiết cao, độ bền dai cơ học lớn,
khả năng thấm hút nƣớc cao, bị thủy phân bởi enzym,…
Chính vì vậy, BC ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực công nghiệp nhƣ:
màng BC làm môi trƣờng phân tách cho quá trình xử lý nƣớc, làm chất màng đặc
biệt cho pin và năng lƣợng tế bào, làm môi trƣờng cơ chất trong sinh học, công
nghiệp dệt, mỹ phẩm, công nghệ giấy … Đối với y học, màng BC đƣợc ứng
dụng làm da thay thế da trong điều trị bỏng, làm mạch máu nhân tạo, điều trị
bệnh tim mạch, làm mặt nạ dƣỡng da cho con ngƣời. Trƣờng Đại học Y dƣợc
thành phố Hồ Chí Minh đã nghiên cứu màng BC có tấm dầu mù u tạo màng trị
4


bỏng thực nghiệm ở thỏ. Kết quả là màng BC giúp mau lành vết thƣơng và ngăn
nhiễm trùng. Ngoài ra, các sợi cellulose có cấu trúc màng BC tạo hệ thống vận
chuyển, phân phối thuốc giúp tăng sinh khả năng của thuốc và giúp thuốc không
bị phá hủy khi ở môi trƣờng acid [1].
1.1.3. Đặc điểm phân loại của Gluconacetobacter xylinum
- G.xylinus thuộc nhóm vi khuẩn Acetic, chi Acetobacter, họ
Pseudomnadaceae, hiếu khí bắt buộc, có chu mao và có khả năng sản xuất
cellulose ngoại bào [2].
Theo khóa phân loại của Bergey, A.xylinum thuộc:
Lớp: Schizomycetes
Bộ: Pseudomonadales
Bộ phụ: Pseudomonadieae

ếch, màng ối màng chitosan. Các thuốc trong tự nhiên có nhiều đặc tính tốt chữa
lành các vết thƣơng, vết loét nghiêm trọng
- Điều trị bỏng bằng thuốc tự nhiên sẽ đƣợc sử dụng rộng rãi ở các nƣớc.
Điều trị bỏng tự nhiên sẽ ít gây ra phản ứng phụ và lành tính.[5]

6


CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
- Khả năng hấp thụ thuốc Diclofenac của màng cellulose vi khuẩn lên men
từ môi trƣờng chuẩn.
2.2. Phạm vi nghiên cứu
- Nghiên cứu ở quy mô Viện nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng, Trƣờng
ĐHSP Hà Nội 2.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Vật liệu nghiên cứu
2.3.1.1. Chủng vi khuẩn
Chủng vi khuẩn G.xylinus dùng lên men thu nhận BC đƣợc nhập từ Nhật
Bản, dự trữ bởi Phòng sạch Vi sinh – Động vật, Viện nghiên cứu Khoa học và
Ứng dụng, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2.
2.3.1.2. Hóa chất nghiên cứu
Bảng 2.1. Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

STT

Tên nguyên liệu

1


7


9

Natri hidroxit

10

Nƣớc cất 2 lần

11

Methanol

12

Kali dihidrophotphat

2.3.1.3. Thiết bị và dụng cụ
Bảng 2.2. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Thiết bị

Nƣớc sản xuất

Máy đo quang phổ UV- Vis 2450

Shimadru- Nhật Bản


cồn và một số dụng cụ hóa sinh khác.

8


2.3.2. Phương pháp chế tạo vật liệu BC
2.3.2.1. Môi trường lên men thu vật liệu BC
Vật liệu BC đƣợc tạo lên môt trƣờng chuẩn (MTC)
Bƣớc 1: Sấy các bình đựng và dụng cụ, sau khi sấy xong lấy ra và để nguội
Bƣớc 2: Chuẩn bị môi trƣờng theo bảng:
Bảng 2.3. Thành phần thuốc và khối lượng tương ứng

Thành phần

Môi trƣờng MTC

Glucose

20g

Pepton

5g

Diamoni photphat

2,7g

Cao nấm men


dung dịch (trong quá trình này phải chú ý để môi trƣờng và dịch giống không bị
nhiễm khuẩn).
Bƣớc 6: Chuyển dịch sang dụng cụ nuôi cấy theo kích thƣớc nghiên cứu,
dùng gạc vô trùng bịt miệng dụng cụ, đặt tĩnh trong khoảng 4-14 ngày ở 280C.
Bƣớc 7: Thu vật liệu BC thô, rửa sạch chúng dƣới vòi nƣớc (xả nƣớc nhẹ).
2.3.2.2. Xử lý vật liệu BC
a. Xử lý màng BC trƣớc khi hấp thụ thuốc
Mục đích:
Cần nuôi cấy tĩnh giúp loại đi các tạp chất trong môi trƣờng nuôi cấy và
độc tố của vi khuẩn.
Phƣơng pháp:
Vật liệu chứa lƣợng lớn vi khuẩn vì vậy hấp vật liệu trong NaOH nóng
3%, nhiệt độ 1130C trong thời gian 15 phút bằng nồi hấp khử trùng để phá vỡ
thành tế bào vi khuẩn và giải phóng nội độc tố của vi khuẩn trong thời gian 1giờ.
Sau khi ngâm NaOH, vớt vật liệu đặt dƣới vòi nƣớc chảy đến khi vật liệu trắng
trong. Thử quỳ tím trên bề mặt vật liệu BC là trung tính, thu đƣợc BC tinh khiết.
b. Đánh giá độ tinh khiết của màng BC
Mục đích: Sau khi xử lý, màng BC loại đi các tạp chất gây độc hại.
Phƣơng pháp:
- Màng BC tinh chế sẽ mang đi cắt nhỏ, cho 50ml nƣớc cất.
- Chia màng BC đã cắt vào các bình tam giác và đổ dung dịch thuốc
Diclofenac natri.
- Lắc máy rung siêu âm 10 phút, chế độ lắc 200 vòng/phút.

10


- Sau đó, sử dụng dung dịch axit triclor acetic 1% để kiểm tra protein trong
dịch chiết màng. Mẫu chứng âm là nƣớc cất, mẫu chứng dƣơng là dung dịch
pepton 1%. Phản ứng dƣơng cho kết tủa đục.

- Mẫu 4: Dùng màng cellulose vi khuẩn với độ dày 1cm, ép loại nƣớc 50%.
Chuẩn bị trƣớc 12 bình tam giác chứa 25mg thuốc diclofenac cùng 100ml
dung dịch Methanol khuấy tan. Cho 12 màng vào 12 bình trên, rồi cho vào máy
lắc 150 vòng/ phút. Sau các quãng thời gian 30 phút, 1giờ, 1,5 giờ, 2 giờ rút mẫu
đo quang phổ bằng máy UV – 2450.
Thu đƣợc giá trị OD thay vào phƣơng trình đƣờng chuẩn ta nhận đƣợc
nồng độ diclofenac (C%) có trong dung dịch.
(1)
C%: nồng độ phần trăm khối lƣợng, thể tích chỉ số mg chất tan có trong
100ml dung dịch.
mct: khối lƣợng chất tan trong dung dịch (mg).
mdd hay Vdd: thể tích của dung dịch (ml).
Khối lƣợng diclofenac hấp thụ là:
mht = mtr - ms

(2)

mht : khối lƣợng diclofenac đƣợc hấp thụ vào màng BC (mg).
mtr: khối lƣợng diclofenac trong dung dịch ban đầu (mg).
ms: khối lƣợng diclofenac còn lại trong 100ml dung dịch diclofenac 25% (mg)
Tỷ lệ % diclofenac hấp thụ vào màng cellulose vi khuẩn:
(3)
12


EE: phần trăm thuốc hấp thụ vào màng.
Qt: lƣợng thuốc lý thuyết (mg).
Qd: lƣợng thuốc còn lại (mg).
2.3.3. Phương pháp xử lý thống kê
Xử lý các dữ liệu qua phần mềm excel 2016 và phần mềm JMP phiên


3.1.4. Đánh giá độ tinh khiết của màng BC
- Màng BC tinh khiết loại 0,5cm và 1cm lần lƣợt đƣợc cắt nhỏ cho vào
bình và thêm 50ml nƣớc cất.

15


Hình 3.3. Màng BC tinh chế

Hình 3.4. Màng BC được chia vào các bình tam giác

- Chia màng BC đã cắt vào các bình tam giác và đổ dung dịch thuốc
Diclofenac natri.
- Lắc máy rung siêu âm 10 phút, chế độ lắc 200 vòng/phút.

16


3.1.5. Xây dựng phương trình đường chuẩn của thuốc Diclofenac
- Dùng phần mền Excel 2010, dựng đồ thị biểu diễn và lập phƣơng trình
đƣờng chuẩn diclofenac, hình 3.4.1.

Hình 3.5. Phương trình đường chuẩn của diclofenac

Phƣơng trình đƣờng chuẩn:
y=0,2432x – 0,1655 (R2 = 0,996)
Trong đó,
x: Nồng độ diclofenac mg/ml.
y: Giá trị OD tƣơng ứng với nồng độ x.