TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN

NGUYỄN TÚ HƯƠNG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC
DICLOFENAC NATRI CỦA VẬT LIỆU
CELLULOSE TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER
XYLINUS
NUÔI CẤY TRONG MÔI TRƯỜNG CHUẨN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

Hà Nội, 20 tháng 5 năm 2019


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN

NGUYỄN TÚ HƯƠNG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC
DICLOFENAC NATRI CỦA VẬT LIỆU
CELLULOSE TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER
XYLINUS
NUÔI CẤY TRONG MÔI TRƯỜNG CHUẨN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật
Người hướng dẫn:



Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2019
Sinh viên

Nguyễn Tú Hương


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
BC

: Cellulose vi khuẩn

cs

: Cộng sự

MTC

: Môi trường chuẩn

PC

: Plant cellulose

OD

: Optical density

VLC


3.1.4. Đánh giá độ tinh khiết của màng BC ............................................................ 15
3.1.5. Xây dựng phương trình đường chuẩn của thuốc Diclofenac........................ 17
3.1.6. Khảo sát khả năng hấp thụ màng BC ........................................................... 17
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................. 23
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu ......................................................... 7
Bảng 2.2. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ...................................................... 8
Bảng 2.3. Thành phần thuốc và khối lượng tương ứng ............................................. 9
Bảng 3.1. Giá trị OD hấp thụ thuốc của màng BC (n=3) (OD – 283 nm) .............. 19
Bảng 3.2. Lượng thuốc hấp thụ vào các màng BC tại thời điểm 2 giờ.................... 20
Bảng 3.3. Hiệu suất hấp thụ thuốc các loại màng BC trong 2 giờ.......................... 21


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của thuốc Diclofenac.................................................. 3
Hình 3.1. Màng BC đang hình thành ...................................................................... 14
Hình 3.2. Rửa màng dưới vòi nước.......................................................................... 15
Hình 3.3. Màng BC tinh chế..................................................................................... 16
Hình 3.4. Màng BC được chia vào các bình tam giác............................................. 16
Hình 3.5. Phương trình đường chuẩn của diclofenac.............................................. 17
Hình 3.6. Chuẩn bị dịch đo quang phổ .................................................................... 18
Hình 3.7. Lượng thuốc hấp thụ vào các màng BC có sự khác biệt.......................... 20
Hình 3.8. Hiệu suất hấp thụ thuốc của các loại màng BC....................................... 21


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài


2


2. Mục đích của nghiên cứu
- Mục đích nghiên cứu:
Thiết kế được hệ thống màng BC lên men từ môi trường chuẩn được nạp
thuốc diclofenac natri.
Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc tạo màng BC hấp thụ thuốc nhiều nhất.
- Nhiệm vụ nghiên cứu:
Chế tạo ra vật liệu BC, xử lý vật liệu BC trước khi hấp thụ thuốc
diclofenac natri, xác định lượng BC tạo thành, đánh giá độ tinh khiết vật liệu BC.
Khảo sát tối ưu hóa khả năng hấp thụ thuốc diclofenac natri vào vật liệu
BC. Khảo sát đặc tính thuốc diclofenac natri trước và sau khi được hấp thụ
thuốc.
3. Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc Diclofenac natri của vật liệu Cellulose
tạo ra từ Gluconacetobacter xilinus nuôi cấy trong môi trường chuẩn.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
- Ý nghĩa khoa học:
Xây dựng được quy trình tạo màng BC lên men trong môi trường chuẩn.
- Ý nghĩa thực tiễn:
Từ kết quả nghiên cứu chọn ra được trường hợp hấp thụ thuốc tốt nhất.
Từ kết quả nghiên cứu trên có thể áp dụng vào thực tiễn đời sống.
5. Tính mới của đề tài
- Nâng cao khả năng hấp thụ thuốc diclofenac natri trong điều trị giảm
đau, chống viêm.
- Khắc phục nhược điểm của thuốc từ chính kết quả nghiên cứu áp dụng
vào điều trị bệnh.
3

nhức răng, đau nhức cơ bắp, đau sau khi sinh và đau sau khi phẫu thuật.
-Tác dụng phụ: nhức đầu, đau thượng vị, buồn nôn, chướng bụng, ù tai,
chán ăn, khó tiêu.
-Liều lượng thuốc tùy thuộc vào tình trạng sức khỏe, đáp ứng theo điều trị
với các loại thuốc phù hợp. Không sử dụng quá số lượng thuốc được chỉ định.[5]
1.1.2. Tổng quan về Bacterial cellulose
- Cellulose vi khuẩn là sản phẩm trao đổi chất sơ cấp và tạo màng bảo vệ.
- BC là sản phẩm của chủng G.xylinum. Màng sinh học BC có cấu trúc,
đặc tính giống cellulose thực vật, tuy nhiên, chúng khác nhau về cấu trúc đại thể
[1]. Theo AJ. Brown (1886), BC gồm nhiều sợi siêu nhỏ có bản chất là
hemicellulose, có đường kính là 1,5 nm, kết hợp với nhau tạo thành bó, các bó
hợp thành dãy, mỗi dãy khoảng 100 nm, rộng khoảng 3-8 nm.
- Tính chất độc đáo màng BC: độ tinh khiết cao, độ bền dai cơ học lớn,
khả năng thấm hút nước cao, bị thủy phân bởi enzym,…
Chính vì vậy, BC ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực công nghiệp như:
màng BC làm môi trường phân tách cho quá trình xử lý nước, làm chất màng đặc
biệt cho pin và năng lượng tế bào, làm môi trường cơ chất trong sinh học, công
nghiệp dệt, mỹ phẩm, công nghệ giấy … Đối với y học, màng BC được ứng
dụng làm da thay thế da trong điều trị bỏng, làm mạch máu nhân tạo, điều trị
bệnh tim mạch, làm mặt nạ dưỡng da cho con người. Trường Đại học Y dược
thành phố Hồ Chí Minh đã nghiên cứu màng BC có tấm dầu mù u tạo màng trị
5


bỏng thực nghiệm ở thỏ. Kết quả là màng BC giúp mau lành vết thương và ngăn
nhiễm trùng. Ngoài ra, các sợi cellulose có cấu trúc màng BC tạo hệ thống vận
chuyển, phân phối thuốc giúp tăng sinh khả năng của thuốc và giúp thuốc không
bị phá hủy khi ở môi trường acid [1].
1.1.3. Đặc điểm phân loại của Gluconacetobacter
xylinum

- Trên thế giới, đã có 18 công trình nghiên cứu ứng dụng BC trong hệ
thống vận tải và phân phối thuốc (năm 2014) đã được báo cáo [7].
- Nghiên cứu của Wei B. và cs (2011) màng BC thu được sau khi ngâm
trong benzalkonium chloride có khả năng giải phóng thuốc trên mỗi đơn vị diện
2

tích bề mặt đã được tìm thấy là 0.116 kg/cm . Tác dụng của thuốc kéo dài ít nhất
24 giờ chống lại hoạt động của S. Aureus và B. Subtilis.
1.2.2. Ở Việt Nam
- Các kết quả nghiên cứu BC mới dừng lại ở bước đầu thí nghiệm nghiên
cứu.
- Gần đây nhóm nghiên cứu của Đinh Thị Kim Nhung đã đưa ra hướng
nghiên cứu điều trị ở thỏ [3], công tác gồm việc phẫu thuật, cấy ghép, tạo màng
trị bỏng… sử dụng các chất có nguồn gốc từ tự nhiên để điều trị bỏng như da
ếch, màng ối màng chitosan. Các thuốc trong tự nhiên có nhiều đặc tính tốt chữa
lành các vết thương, vết loét nghiêm trọng
- Điều trị bỏng bằng thuốc tự nhiên sẽ được sử dụng rộng rãi ở các nước.
Điều trị bỏng tự nhiên sẽ ít gây ra phản ứng phụ và lành tính.[5]

7


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
- Khả năng hấp thụ thuốc Diclofenac của màng cellulose vi khuẩn lên men
từ môi trường chuẩn.
2.2. Phạm vi nghiên cứu
- Nghiên cứu ở quy mô Viện nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng, Trường
ĐHSP Hà Nội 2.
2.3. Phương pháp nghiên cứu

Disodium phosphate

6

Axit citric

7

Cao nấm men

8

Pepton

8


9

Natri hidroxit

10

Nước cất 2 lần

11

Methanol

12


Khuấy từ gia nhiệt

IKA- Đức

Máy lắc tròn tốc độ chậm

Orbital Shakergallenkup Anh

Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu
Bể rung siêu âm S60/H
* Dụng cụ: Bình tam giác chia vạch, ống nghiệm, cốc đong thủy tinh chia
vạch, bình thủy tinh 500 ml, micropipet 20-200µl, pipet (1ml, 2ml, 5ml, 10ml,
25ml), kẹp gỗ, thước, giấy lọc, giấy thấm, giấy bạc, khăn xô, kéo, bật lửa, đèn
cồn và một số dụng cụ hóa sinh khác.

9


2.3.2. Phương pháp chế tạo vật liệu BC
2.3.2.1. Môi trường lên men thu vật liệu BC
Vật liệu BC được tạo lên môt trường chuẩn (MTC)
Bước 1: Sấy các bình đựng và dụng cụ, sau khi sấy xong lấy ra và để nguội
Bước 2: Chuẩn bị môi trường theo bảng:
Bảng 2.3. Thành phần thuốc và khối lượng tương ứng

Thành phần

Môi trường MTC


10%

Lưu ý: pH của môi trường được đo và hiệu chỉnh bằng HCl hoặc NaOH;
pH của môi trường được đo và hiệu chỉnh = 4-6, pH thấp sẽ tránh bị nhiễm
những vi khuẩn khác.
0

Bước 3: Hấp khử trùng các môi trường ở 121 C trong 15 phút (phải bọc
các bình bằng giấy bạc).
Bước 4: Lấy các môi trường ra khử trùng bằng tia UV trong 15 phút rồi để
nguội môi trường.

10


Bước 5: Bổ sung 10% dịch giống, lắc đều tay cho giống phân bố đều trong
dung dịch (trong quá trình này phải chú ý để môi trường và dịch giống không bị
nhiễm khuẩn).
Bước 6: Chuyển dịch sang dụng cụ nuôi cấy theo kích thước nghiên cứu,
0

dùng gạc vô trùng bịt miệng dụng cụ, đặt tĩnh trong khoảng 4-14 ngày ở 28 C.
Bước 7: Thu vật liệu BC thô, rửa sạch chúng dưới vòi nước (xả nước nhẹ).
2.3.2.2. Xử lý vật liệu BC
a. Xử lý màng BC trước khi hấp thụ thuốc
Mục đích:
Cần nuôi cấy tĩnh giúp loại đi các tạp chất trong môi trường nuôi cấy và
độc tố của vi khuẩn.
Phương pháp:
Vật liệu chứa lượng lớn vi khuẩn vì vậy hấp vật liệu trong NaOH nóng

đã lựa chọn với mẫu trắng và xây dựng đường chuẩn biểu diễn mối tương quan
giữa độ hấp thụ và nồng độ diclofenac natri.
Bước 3: Dùng máy đo quang phổ từ ngoại UV- 2450 để đo mật độ quang
phổ (OD) của các dung dịch đã pha như trên ở hấp thụ cực đại (λ max).
Tiến hành đo 3 lần, lấy giá trị trung bình quang phổ của thuốc diclofenac
natri để xây dựng đường chuẩn của thuốc. Phương trình tuyến tính biểu diễn mối
quan hệ giữa nồng độ diclofenac natri và độ hấp thụ. Phương trình biểu diễn giữa
nồng độ và độ hấp thụ có dạng:
y= ax + b với R2 là hệ số tương quan
Trong đó: y: độ hấp thụ của dung dịch tại λ max
x: nồng độ của dung dịch
Giá trị mật độ quang (OD) của dung dịch thuốc ở các nồng độ khác nhau.

12


2.3.2.4. Xác định lượng thuốc được hấp thụ vào màng BC, tính hiệu suất
Tiến hành thử nghiệm trên 4 mẫu MTC.
- Mẫu 1: Dùng màng cellulose vi khuẩn với độ dày 0,5cm.
- Mẫu 2: Dùng màng cellulose vi khuẩn với độ dày 0,5cm, ép loại nước
50%.
- Mẫu 3: Dùng màng cellulose vi khuẩn với độ dày 1cm.
- Mẫu 4: Dùng màng cellulose vi khuẩn với độ dày 1cm, ép loại nước 50%.
Chuẩn bị trước 12 bình tam giác chứa 25mg thuốc diclofenac cùng 100ml
dung dịch Methanol khuấy tan. Cho 12 màng vào 12 bình trên, rồi cho vào máy
lắc 150 vòng/ phút. Sau các quãng thời gian 30 phút, 1giờ, 1,5 giờ, 2 giờ rút mẫu
đo quang phổ bằng máy UV – 2450.
Thu được giá trị OD thay vào phương trình đường chuẩn ta nhận được
nồng độ diclofenac (C%) có trong dung dịch.
(1)


15


CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả tạo các loại vật liệu BC
3.1.1. Tạo màng BC từ các môi trường lên men
Sau một tuần, vi khuẩn G. xylinus sử dụng chất dinh dưỡng nhằm tổng
hợp cellulose, màng BC hình thành trên bề mặt môi trường. Độ dày màng tùy
thời gian nuôi cấy.
3.1.2. Thu màng BC thô
- Tùy thời gian nuôi cấy thu màng có độ dày 1cm và 0,5cm
- Màng dẻo, chứa nhiều nước, dễ tách khỏi môi trường.

Hình 3.1. Màng BC đang hình thành

16


3.1.3. Xử lý màng BC trước khi hấp thụ
- Hấp BC thô trong NaOH nóng 3% bằng nồi hấp khử trùng, nhiệt độ
0

113 C trong 10 phút, thu màng có màu vàng nâu.
- Xử lý BC trước hấp thụ để loại bỏ tạp chất trong môi trường nuôi cấy.
- Màng đặt dưới vòi nước, xả nhẹ nước trên bề mặt màng đến khi màng
trắng trong. Thử quỳ tím kiểm tra môi trường là trung tính. Thu đươc BC tinh
khiết.

Hình 3.2. Rửa màng dưới vòi nước