ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG
----------

PHẠM THỊ XUÂN DIỆU

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO
CÂY MẬT NHÂN (EURYCOMA
LONGIFOLIA JACK)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

1


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Hiện nay, nhu cầu của con người về nguồn dược liệu ngày càng tăng. Cây
dược liệu là nguồn cung cấp thuốc chữa bệnh quan trọng nhất cho phần lớn dân số
trên thế giới [34]. Theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế giới có đến 80% người dân
vẫn dựa chủ yếu vào các phương pháp chữa bệnh truyền thống bằng các cây thảo
dược [34]. Tuy nhiên, các loài cây dược liệu trong tự nhiên đang bị giảm về số
lượng và chất lượng bởi sự khai thác quá mức; các điều kiện ngày càng bất lợi của
môi trường tự nhiên,… dẫn đến nhiều loài cây dược liệu quý hiếm bị tuyệt chủng,
ảnh hưởng đến nguồn cung cấp dược liệu bền vững cho con người [11].
Cây mật nhân (Eurycoma longifolia Jack) là một trong số các loài cây dược
liệu được biết đến nhiều ở Đông Nam Á do đặc tính tăng cường sức khoẻ tình dục
và có hiệu quả như gây độc tế bào, chống sốt rét, chống lở loét, chống thúc đẩy các
khối u và là tác nhân chống ký sinh trùng [21]. Tại Việt Nam, nó được gọi là “cây
bá bệnh” hay “cây mật nhân” có mặt trong vườn quốc gia Bái Tử Long, một số rừng

nhân.
 Khảo sát ảnh hưởng của KIN đến khả năng tái sinh chồi in vitro cây mật
nhân.
 Khảo sát ảnh hưởng của KIN và IBA đến khả năng tạo rễ in vitro cây mật
nhân.

3


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Nhân giống in vitro ở thực vật
Thuật ngữ nhân giống in vitro hay còn gọi là vi nhân giống được sử dụng đặc
biệt cho việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, bắt đầu
bằng nhiều bộ phận khác nhau của thực vật có kích thước nhỏ, sinh trưởng ở điều
kiện vô trùng trong các ống nghiệm hoặc trong các loại bình nuôi cấy [7].
Kỹ thuật nhân giống in vitro nhằm mục đích sau:
- Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý, hiếm nhằm tạo vật liệu cho công
tác tạo giống.
- Nhân nhanh với hiệu quả kinh tế cao các loài hoa, cây cảnh, cây ăn quả
không trồng bằng hạt.
- Nhân nhanh các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các loại rau, cây
cảnh và cây trồng khác.
- Nhân nhanh và kinh tế các kiểu gen quý của cây lấy gỗ, cây làm thuốc, cây
ăn quả, rau xanh.
- Nhân nhanh trong điều kiện vô trùng, cách ly tái nhiễm kết hợp với làm
sạch bệnh virus.
- Bảo quản các tập đoàn giống vô tính và các loài cây giao phấn trong ngân
hàng gen
1.1.1. Các giai đoạn chính trong quá trình nhân giống in vitro
 Giai đoạn chuẩn bị

phương pháp nhân giống khác có hệ số nhân cao. Vì vậy, có thể coi đây là giai đoạn
then chốt của toàn bộ quá trình nhân giống. Hệ số nhân ở giai đoạn này biến động
từ 5-50 lần tuỳ thuộc vào loài cây, môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp.
Trong giai đoạn này vai trò của các chất điều hoà sinh trưởng (Auxin, Cytokinin) là
cực kỳ quan trọng để sản sinh ra lượng cây con tối đa mà vẫn đảm bảo sức sống và
bản chất di truyền của cây. Theo nguyên tắc chung thì môi trường có nhiều
Cytokinin sẽ kích thích tạo chồi. Chế độ nuôi thường là 25-270C và 10-16h/ngày,
cường độ chiếu sáng 1000 lux. Yêu cầu của giai đoạn này là tạo ra số lượng cây con
tối đa trong thời gian ngắn nhưng vẫn đảm bảo sức sống và bản chất di truyền của
cây.
 Tạo cây hoàn chỉnh (ra rễ)
Đây là giai đoạn chuẩn bị cho cây con chuyển ra ngoài hệ thống vô trùng
khi đã đạt được kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ giai đoạn 3 sang môi
trường tạo rễ. Thường sau 2-3 tuần ở các chồi này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây
hoàn chỉnh. Môi trường tạo rễ thường giảm lượng Cytokinin và tăng lượng Auxine

5


để tạo điều kiện cho sự ra rễ của chồi cây. Người ta thường dùng các chất NAA
(Acid α- naphty axetic), IBA (Acid β - indol butyric), IAA (Acid β - indol acetic) ở
nồng độ 1mg/L - 5mg/L để tạo rễ cho hầu hết các loại cây trồng bằng phương pháp
nuôi cấy mô. Giai đoạn này thường kéo dài từ 2-4 tuần lễ, sau đó được chuyển sang
môi trường Auxin để rễ phát triển.
Ở giai đoạn này cây con rất nhạy cảm với ẩm độ và bệnh tật do hoạt động
của rễ và lá mới phát sinh rất yếu, cây chưa chuyển sang giai đoạn tự dưỡng.
 Đưa cây ra môi trường tự nhiên
Đây là giai đoạn chuyển dần cây con in vitro ra nhà kính rồi ra ngoài trời.
Cây mô được chuyển từ môi trường dị dưỡng sang môi trường tự dưỡng, nên phải
tập cho cây quen dần với môi trường tự nhiên, tránh sự thay đổi đột ngột làm cây có

giai đoạn của hệ mô trong nuôi cấy mô rất quan trọng, số lượng và các loại hoá chất
phải cần độ chính xác cao và phù hợp cho từng giai đoạn, đối tượng cụ thể.
+ Nguồn các bon: trong nuôi cấy mô, các tế bào chưa có khả năng quang hợp
để tổng hợp nên chất hữu cơ do vậy người ta phải đưa vào môi trường một lượng
hợp chất các bon nhất định để cung cấp năng nượng cho tế bào và mô (Debengh,
1991). Nguồn cácbon ở đây là các loại đường khoảng 20-30 mg/L có tác dụng giúp
mô tế bào thực vật tổng hợp các hợp chất hữu cơ, giúp tế bào tăng sinh khối, ngoài
ra nó đóng vai trò là chất thẩm thấu chính của môi trường. Người ta thường sử dụng
2 loại đường đó là saccarose và glucose.
+ Nguồn Nitơ: tỷ lệ nguồn nitơ tuỳ thuộc vào loài cây và trạng thái phát triển
mô. Thông thường, nguồn nitơ được đưa vào môi trường ở hai dạng là HN4+ và NO3
(nitrat). Trong đó, việc hấp thụ NO3 của các tế bào thực vật tỏ ra có hiệu quả hơn so
với NH4. Nhưng đôi khi NO3 gây ra hiện tượng “kiềm hóa” môi trường vì vậy giải
pháp sử dụng phối hợp cả 2 nguồn nitrơ với tỷ lệ hợp lý được sử dụng rộng rãi nhất.
 Các chất kích thích sinh trưởng
Các Phytohormon là những chất có tác dụng điều hoà sinh trưởng và phát
triển của thực vật. Chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và
phát triển của thực vật như: phân chia, biệt hoá tế bào… ngoài ra còn có ảnh hưởng
đến quá trình lão hoá mô và nhiều quá trình khác. Các phytohormon có thể chia
thành 5 nhóm: Auxine, Cytokinin, Giberillin, Ethylen, Abscisic acid. Chúng là yếu
tố quan trọng nhất trong môi trường quyết định đến sự thành công của kết quả nuôi
cấy.
+ Auxin: Nhóm này gồm có các chất chính là: IBA (3-Indol butyric acid),
IAA (Indol acetic acid), NAA (Nathyl acetic acid),… trong nuôi cấy mô thực vật

7


Auxin thường được sử dụng để kích thích sự phân chia tế bào, biệt hoá rễ, hình
thành callus, kìm hãm sự phát triển chồi và tạo ra các rễ phụ [14].


8


cứu của Vonanorld (1982) thì nếu nhiệt độ ngày/đêm là 200 C/150C hoặc 200C/180C
tỷ lệ ra rễ đạt được khoảng 33%, thậm chí còn thấp hơn. Ở nhiệt độ trung bình thì
hoạt động trao đổi chất tốt hơn. Còn ở nhiệt độ cao lại kích thích ra nhiều tế bào
không có tổ chức. Trong nuôi cấy mô, nhiệt độ thường được duy trì ổn định, ban
ngày từ 25 - 300C và ban đêm từ 17 - 200C.
1.1.3. Các nghiên cứu nhân giống in vitro cây dược liệu
 Trên thế giới
Nuôi cấy mô tế bào thực vật được hình thành và phát triển từ những năm 80
của thế kỉ XX và được ứng dụng chủ yếu trong các lĩnh vực: Nhân giống vô tính in
vitro, nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng để tạo cây sạch bệnh, bảo quản
nguồn gen in vitro, tạo phôi vô tính và hạt nhân tạo… [2].
Kỹ thuật nuôi cấy mô đã được trên 600 công ty lớn trên thế giới áp dụng và
đã nhân được khoảng 500 triệu cây giống trong 1 năm ở các công ty giống cây trồng
khác nhau. Dự kiến trên thị trường cây giống, kỹ thuật nuôi cấy mô thu được
khoảng 15 tỉ USD/năm và tốc độ tăng trưởng của thị trường này hàng năm vào
khoảng 15% [2].
Trong những năm gần đây, quy trình nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy in
vitro được nhiều cơ sở khoa học nghiên cứu và hoàn thiện trên các đối tượng khác
nhau như: cây rừng, cây lương thực, thực phẩm, cây ăn quả, hoa, cây cảnh, cây
dược liệu… Gần đây, việc ứng dụng các thành tựu công nghệ sinh học trong nhân
giống, tạo dược liệu in vitro ở các loài cây thuốc quý đang được quan tâm và đã đạt
một số thành tựu, chẳng hạn như:
G. Rout và cs (2007) nghiên cứu nhân nhanh cây Lài tàu (Nyctanthes
arbortristis) - họ cỏ roi ngựa (Verbenaceae) từ chồi nách. Tỷ lệ vi chồi/mẫu cấy lớn
nhất (6,65 chồi/mẫu) ở môi trường MS có bổ sung 1,5 mg/L BA, 50 mg/L Ads và
0,1 mg/L IAA sau 4 tuần nuôi cấy. Tỷ lệ ra rễ lớn nhất trên môi trường MS bổ sung

nồng độ 3 mg/L BA và tỉ lệ chồi/mẫu cao (7,6 chồi/mẫu) [28].
Năm 2008, Khalafalla M. M. và Daffalla H. M. đã nhân giống thành công
cây Keo (Acacia Senegal (L.) Wild) thuộc họ Trinh nữ, vỏ chứa tanin dùng để trị
các vết thương, vết loét. Sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường MS, có bổ sung 1,0
mg/L BA cho tỉ lệ bật chồi cao nhất (5,3 chồi /mẫu) và tỉ lệ ra rễ chỉ đạt 25% ở môi
trường có 1,0 mg/L IBA [22].
U. Salma và cs (2008) đã nghiên cứu tại Bangladesh về nhân giống cây Ba
gạc Ấn Độ (Rawolfia serpentien L. Benth) có chứa 28 alkaloid khác nhau có tác
dụng hạ huyết áp, an thần, gây ngủ…. trên tổ hợp BA và NAA. Sau thời gian nuôi
cấy đã thu được một số chồi/mẫu cao nhất ở tổ hợp 1,5 mg/L BA và 0,2 mg/L

10


NAA. Tỉ lệ mẫu tạo rễ in vitro cao nhất ở ½ MS có bổ sung 1,0 mg/L IAA và 1,0
mg/L IBA [32].
Năm 2009, một nhóm tác giả người Malaysia đã nghiên cứu nhân nhanh cây
Gynura procumbens (Lour.) Merr để chiết xuất hoạt chất sinh học. Cây này thường
nhân giống bằng cách giâm cành, nhưng phương pháp này không thể đáp ứng được
nhu cầu sử dụng chúng. Kết quả thu được cho thấy môi trường bổ sung 0,5 mg/L
NAA + 2,0 mg/L BA có 18 chồi con/mẫu chồi phát sinh. Toàn bộ chồi con tạo rễ
sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS không có chất điều hoà sinh trưởng [18].
Theo kết qủa nghiên cứu của Arumon và RoyChowdhury (2009) đã nghiên
cứu nhân giống cây Lô hội (Aloe Vera sp.). Một loài cây có tác dụng trong cả đông
y và tây y, chữa được các bệnh ở trẻ em, táo bón, tăng cường tiêu hoá và có tác
dụng sát trùng vết thương, thông tiện, thanh nhiệt, nhức đầu…. Sau 5 tuần nuôi cấy
cho thấy tỉ lệ bật chồi cao (78,01%) trên ba môi trường có bổ sung 2 mg/L IBA, 0,1
mg/L BA, tổ hợp 0,5 mg/L KIN và 0,2 mg/L NAA [25].
Theo nghiên cứu của nhóm tác giả người Hàn Quốc: Sang và cs (2009) đã tái
sinh cây Địa hoàng (Rehmannia glutinosa L.) thuộc họ hoa mõm sói

này, quy trình nhân giống cây dược liệu được nhiều tác giả nghiên cứu hoàn thiện
như:
Nhân giống vô tính các dòng Kava (Piper methysticum G. Forster) có hoạt
tính sinh học cao [6].
Nguyễn Thị Kim Uyên, Trần Văn Minh (2007) đã nhân giống cây Thanh hao
(Artemisia annua L.) trên môi trường LV và nhận thấy, môi trường có bổ sung BAP
0,3mg/L chồi phát triển về cả chiều cao và số lượng. Khi bổ sung BAP, NAA và
2,4-D riêng rẽ không kích thích phát sinh phôi soma nhưng khi bổ sung NAA và
2,4-D riêng rẽ lại kích thích tạo rễ. Bổ sung kết hợp BAP 0,5mg/L và NAA
0,5mg/L cho tế bào soma phát sinh đồng đều; cả BAP, NAA và 2,4-D đều có tác
dụng kích thích tăng tế bào soma và môi trường thích hợp nhất cho nuôi cấy tăng
sinh tế bào soma là môi trường LV có bổ sung BAP 0,5mg/L + NAA 0,5mg/L [13].
Năm 2007, Bùi Thị Tường Thu và Trần Văn Minh nghiên cứu nuôi cấy đỉnh
cây Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc). Chồi đỉnh và đốt thân cây Thông đỏ (1-2
năm tuổi) được sử dụng trong nuôi cấy in vitro. Chồi non phát sinh sau 45 ngày
nuôi cấy trên môi trường MS + 5mg/L BA + 1mg/L KIN. Chồi non được nuôi cấy
phát sinh rễ trên môi trường WPM + 1mg/L NAA + 50mg/L Rhizopon say 75 ngày
nuôi cấy. AgNO3 thích hợp cho nuôi cấy ức chế sự hoá nâu mẫu. Chồi đỉnh chiếm
ưu thế trong quá trình phát sinh và sinh trưởng của chồi bên [10].

12


Quách Diễm Phương và cs (2007) công bố công trình nghiên cứu nhân giống
in vitro cây Bắt ruồi (Drosera burmanni Vahl.) để thu hợp chất quinone. Hạt sau
khi khử trùng nuôi cấy trên môi trường ½ MS. Cây con sau khi nảy mầm được cắt
đốt và nuôi cấy trong ½ MS lỏng lắc. Kết quả cho thấy khi nuôi cấy trên môi trường
lỏng, 100% mẫu cấy sống, lá tăng trưởng xanh tốt và tạo nhiều chồi [9].
Ứng dụng kỹ thuật nhân giống in vitro để bảo tồn và nhân nhanh cây dược
liệu điển hình nhất ở Việt Nam là nghiên cứu nhân giống bảo tồn cây Thuỷ tùng

KTST (5,67 rễ/chồi). Cây in vitro đạt tiêu chuẩn được chuyển ra đất sau 4 tuần nuôi
cấy. Cây con được trồng trên giá thể đất thịt và cát (1:1) cho tỷ lệ sống sót cao nhất
đạt 77,5% [12].
Nguyễn Thị Ngọc Hương và Võ Thị Bạch Mai (2010) nghiên cứu sự phát
sinh hình thái chồi trong nuôi cấy in vitro cây nhàu (Morinda citrifolia L.) là cây
dược liệu quý được dùng để chữa nhiều loại bệnh như mất ngủ, đau lưng, huyết áp
cao…nhằm phục vụ cho mục đích nhân giống loài cây này trong tương lai. Kết quả
cho thấy sự phát sinh hình thái chồi ở cây nhàu trải qua 3 giai đoạn. Trong quá trình
này Zeatin 1mg/L kích thích sự hình thành sơ khởi chồi trong tối (sau 2 tuần) nhanh
hơn BA ở cùng nồng độ. Khi phối hợp NAA 0,1 mg/L và zeatin 1 mg/L sẽ làm chồi
chậm xuất hiện (sau 5 tuần). Kết quả đo hô hấp và hoạt tính chất điều hoà tăng
trưởng thực vật cũng được thảo luận để làm rõ những thay đổi sinh lý trong hình
thành chồi [4].
1.2. Vài nét về cây mật nhân
1.2.1. Đặc điểm hình thái
Mật nhân là loài cây gỗ nhỏ, cao từ 2 – 8m, cá biệt có cây cao hơn. Thân
nhỏ, ít phân cành, lá kép lông chim một lần lẻ, mọc so le. Mỗi lá kép gồm từ 21 –
41 lá chét, mọc đối, hình bầu dục, cuống lá rất ngắn, gốc lá thuôn, đầu nhọn, mặt
trên bóng, mặt dưới có lông màu xám. Hoa chùm kép mọc ở thân hoặc đầu cành,
cuống có lông màu rỉ sắt. Hoa màu vàng hoặc đỏ nâu mọc thành chùm, đơn tính
khác gốc nên mỗi cây chỉ trổ hoa đực hoặc hoa cái. Hoa nở vào tháng 3-4. Đài hoa
có 5 -6 lá đài nhỏ hình tam giác, có tuyến ở lưng. Tràng hoa 5, cũng có tuyến. Bầu
có 5 noãn, hơi dính ở gốc. Quả hạch, hình trứng dài 1 – 2cm, rộng 0,5 – 1cm, vỏ
nhẵn có rãnh dọc, khi chín quả màu đỏ sẫm chứa 1 hạt.
1.2.2. Phân bố
Mật nhân là loài cây mọc hoang ở vùng núi, trong các rừng thưa, dưới tán
các cây gỗ lớn. Phân bố rộng rãi tại Đông Nam Á ở các nước như Malaysia, Ấn Độ,
Trung Quốc, Indonesia, Philipin và Thái Lan [17].

14

1.2.4. Các nghiên cứu về cây mật nhân

15


Nghiên cứu của Chan LK và cs (2002) chỉ ra rằng những hạt giống với vỏ
quả trong cứng gieo trong hỗn hợp đất và cát theo tỉ lệ 1:1 chỉ bắt đầu nảy mầm sau
43 ngày sau khi gieo và tiếp tục nảy mầm trong khoảng thời gian 99 ngày. Hỗn hợp
đất và cát (1:1) là tương đương như sự kết hợp đất cát tự nhiên đã được tối ưu cho
sự nảy mầm của hạt mật nhân. Tuy nhiên, khi vỏ quả trong của hạt giống bị loại bỏ,
các hạt giống nảy mầm trong hai tuần qua nuôi cấy trên môi trường cơ bản MS.
Những hạt giống còn xanh được loại bỏ các vỏ quả trong dường như nảy mầm
nhanh hơn những hạt chín khi được nuôi cấy trên môi trường cơ bản MS. Tất cả các
cây con nảy mầm in vitro có cùng một mô hình tăng trưởng về chiều cao cây giống,
số lá và đường kính thân cây không phân biệt so với các phương pháp nảy mầm
trong tự nhiên trong khoảng thời gian 120 ngày [16].
Năm 2010, nhóm nghiên cứu của Chan LK và cs đã đánh giá hiệu quả từ
sinh khối tế bào cây mật nhân và sản xuất các hợp chất alkaloids, 9-hydroxycanthin6-one và 9-methoxycanthin-6-one. Đồng thời để xác định công thức phù hợp có thể
làm tăng sinh khối tế bào và sản xuất các hợp chất alkaloids thông qua nuôi cấy
huyền phù cũng đã được thực hiện [17].
Việc nuôi cấy huyền phù đã được chuẩn bị bằng cách cấy 0,5g FW (trọng
lượng tươi) của tế bào thu được từ mẻ đầu tiên của nuôi cấy huyền phù được chuẩn
bị từ nuôi cấy callus trong môi trường lỏng MSB . Nồng độ khác nhau của chitosan,
NaH2PO4, Na2CO3 và polyvinylpyrrolidone (PVP) đã được thêm vào để tối ưu hóa
sinh khối tế bào và sản xuất alkaloid. Môi trường MSB trung bình bổ sung với
100mg/L chitosan có ý nghĩa quan trọng trong tăng trọng sinh khối tế bào mặc dù
lượng cao 150mg/L chitosan cho sản lượng cao nhất 9-hydroxycanthin-6-one
(0,44%) nhưng lại làm giảm sinh khối tế bào. Việc bổ sung 2 mg/L và 20 mg/L
NaH2PO4 tạo ra sản lượng cao nhất trong sinh khối tế bào và sản xuất alkaloid
tương ứng. Tuy nhiên, việc bổ sung Na2CO3 nồng độ khác nhau và

Hiện nay, ngoài các nghiên cứu về nuôi cấy tế bào và thu hoạt chất sinh
học từ đối tượng này, người ta đang chú trọng nghiên cứu các phương pháp nhân
giống nhanh cây mật nhân nhằm bảo tồn và phát triển nguồn gen cây thuốc quý này.
Nghiên cứu của Sobri và cs (2005) cho thấy tỷ lệ tái sinh cao nhất (90%) và
nhiều chồi hình thành thu được với môi trường cơ bản MS bổ sung 5,0 mg/l KIN.
Rễ hình thành sau 14 ngày ngày nuôi cấy trong môi trường MS cơ bản có bổ sung

17


0,5 mg/l IBA. Cây con tái sinh từ nuôi cấy mô thực vật có khả năng sống sót tốt và
không có sự khác biệt về hình thái học từ các cây mẹ [21].
Nghiên cứu của Maziah và cs (2010) nhằm xác định và tối ưu hóa auxin để
kích thích tạo callus từ nuôi cấy các bộ phận lá, cuống lá, thân, rễ, rễ sợi, lá mầm và
đoạn phôi của cây mật nhân đã đạt được thành công bằng sử dụng các auxin khác
nhau như 2,4-D, IAA, NAA, picloram và dicamba. Các mô nuôi cấy được quan sát
trong một tháng. Các kết quả tổng thể từ các thí nghiệm cho thấy 2,4-D là auxin
thích hợp nhất [24].
Năm 2011, Monica và cs đã nghiên cứu và phân tích đặc điểm hình thái mô
của hạt giống mật nhân bằng kính hiển vi cho thấy cấu trúc hạt giống của cây thuốc
quan trọng này ở các giai đoạn phát triển khác nhau. Các cấu trúc hạt giống mật
nhân bao gồm lớp biểu bì, lớp hạ bì, lớp nhu mô dự trữ và lớp tiền tượng tầng. Lá
mầm phát triển thành một hệ thống mạch phức tạp và chia thành mặt lưới. Các giai
đoạn phát triển hạt giống và phát triển của hệ thống mạch trong quá trình nảy mầm
cung cấp các thông tin thực tế và chính xác về giai đoạn phát triển lá mầm của cây
mật nhân [20].
Ở Việt Nam cho đến nay vẫn chưa có một công trình nghiên cứu nào về sản
xuất hợp các chất sinh học cũng như nhân giống in vitro cây mật nhân bằng kỹ thuật
nuôi cấy mô tế bào thực vật.


phút. Hạt được khử trùng bằng cồn 70% trong 3 phút, tiếp đến khử trùng (lần 1)
bằng dung dịch HgCl2 0,1% trong 15 phút hoặc dung dịch NaClO 5,25% trong 20
phút. Tách vỏ hạt và khử trùng (lần 2) bằng dung dịch HgCl2 0,1% từ 2-3 phút hoặc
dung dịch NaClO 5,25% từ 7-10 phút. Cuối cùng, rửa lại 3 lần bằng nước cất vô
trùng. Hạt sau khi vô trùng, dùng dao nhọn tách bỏ lớp vỏ lụa trong cùng và cấy
trên môi trường MS để đánh giá hiệu quả khử trùng hạt.
2.2.2. Nảy mầm của hạt
Mẫu hạt vô trùng được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung KIN (1,0-5,0
mg/L) và BA (1,0-5,0 mg/L) riêng lẻ để khảo sát khả năng nảy mầm in vitro qua các
chỉ tiêu tỉ lệ phần trăm nảy mầm và thời gian nảy mầm của hạt.
2.2.3. Tạo chồi in vitro
Các chồi in vitro (dài khoảng 0,5 cm) nảy mầm từ hạt trên môi trường MS
được cấy trên môi trường MS bổ sung KIN (1,0-5,0 mg/L) để tạo chồi in vitro. Sau
4 tuần nuôi cấy, đánh giá khả năng tái sinh chồi thông qua các chỉ tiêu: số chồi/mẫu
cấy, chiều cao của chồi, số lá/chồi.
2.2.4. Tạo rễ in vitro
Chồi in vitro có 2 mắt lá (dài khoảng 2cm) được cấy trên môi trường MS bổ
sung IBA (0,1-0,5mg/L) và KIN (1,0-5,0 mg/L) để tạo rễ in vitro. Sau 6 tuần nuôi
cấy, đánh giá khả năng hình thành rễ thông qua các chỉ tiêu: số rễ/chồi, chiều dài rễ.
Tất cả các môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH = 5,8 trước khi khử trùng
trong nồi hấp vô trùng ở 121oC trong 15 phút. Mẫu sau khi cấy được nuôi trong
điều kiện: nhiệt độ 25±2oC, cường độ chiếu sáng 2000 Lux, thời gian chiếu sáng 10
giờ/ ngày.
2.2.5. Xử lý thống kê
Mỗi thí nghiệm được bố trí lặp lại 3 lần. Số liệu thực nghiệm được xử lí
thống kê theo phương pháp Ducan’s test (p

(phút)

mẫu

mẫu

sống vô

nhiễm

chết

trùng

(%)

(%)

(%)

(phút)

Lần 1

Lần 2

Lần 1

Lần 2


7,50

3

-

-

20

7

6,00

65,00

29,00

3

-

-

20

10

0

cs (2002) đã khử trùng bề mặt hạt mật nhân bằng dung dịch NaClO 5,25% với thời
gian khử trùng lần 2 trong 10 phút. Kết quả thu được là 30% hạt nảy mầm trên môi
trường cơ bản MS [16]. Kết quả mà chúng tôi thu được tương tự như kết quả nghiên
cứu của Chan LK và cs về hiệu quả khử trùng hạt bằng dung dịch NaClO (5,25%).
Như vậy, trong hai phương pháp khử trùng ở trên, phương pháp khử trùng
bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 2 phút ở lần 2 cho hiệu quả khử trùng hạt tốt nhất.
3.2. Ảnh hưởng của KIN và BA đến khả năng nảy mầm của hạt
Hạt sau khi khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% trong thời gian 2 phút ở
lần 2 được cấy trên môi trường MS có bổ sung KIN (1,0-5,0 mg/L) và BA (nồng độ
1,0-5,0 mg/L) riêng lẻ để khảo sát khả năng nảy mầm của hạt. Kết quả được trình
bày trong bảng 2.

22


Bảng 2. Ảnh hưởng của KIN và BA đến khả năng nảy mầm của hạt mật nhân.
Chất KTST
(mg/L)

Khả năng nảy mầm của hạt
Thời gian nảy mầm

Tỷ lệ nảy mầm

(ngày)

(%)

KIN


21

23,33

4,0

-

16

33,30

5,0

-

20

29,00

-

1,0

0

0,0

-


Kết quả bảng 2 cho thấy, tỷ lệ hạt nảy mầm tốt nhất thu được trên môi trường
MS đạt 46,60% sau 15 ngày. Các chất KTST KIN và BA ở nồng độ từ 1,0 - 5,0
mg/L ảnh hưởng khác nhau đến khả năng nảy mầm của hạt. Môi trường bổ sung BA
gây ức chế sự nảy mầm của hạt, lá mầm có hiện tượng hoá nâu và phôi không phát
triển. Đối với môi trường bổ sung 4,0 mg/L KIN cho tỷ lệ nảy mầm đạt 33,30%,
thời gian nảy mầm sau 16 ngày. Tuy nhiên khi tăng nồng độ KIN lên 5,0 mg/L thì
gây ức chế sự nảy mầm hạt (chỉ đạt 29%) và thời gian nảy mầm kéo dài đến sau 20
ngày. Ở các nồng độ KIN thấp hơn thì tỷ lệ nảy mầm của hạt giảm dần và thời gian
nảy mầm kéo dài hơn.
Ngoài ra, kết quả còn cho thấy ở các môi trường khác nhau thì hình thái mầm
của hạt cũng khác nhau. Hạt nảy mầm trên môi trường MS thì rễ mọc dài, chồi mầm
sinh trưởng nhanh và ít lá (Hình 3a).Trong khi đó, trên môi trường có bổ sung KIN
thì rễ có xu hướng phát sinh mạnh hơn so với chồi, rễ to và ngắn, chồi mầm tạo lá
sớm (Hình 3b). Theo nghiên cứu của Danial và cs (2011) cho thấy sự hiện diện của
chất KTST nội sinh trong hạt mật nhân ảnh hưởng đến khả năng nảy mầm của hạt
làm cho hình thái chồi mầm của hạt cũng thay đổi [20].
23


a

b

Hình 3: (a): Hình thái của hạt nảy mầm trên môi trường MS; (b): Hình thái của hạt
nảy mầm trên môi trường bổ sung 5,0 mg/L KIN
Như vậy dựa vào tỉ lệ nảy mầm, thời gian nảy mầm và hình thái chồi mầm
chúng tôi chọn môi trường MS là môi trường thích hợp nhất cho khả năng nảy mầm
của hạt mật nhân. Chan LK và cs (2002) khi nghiên cứu sự nảy mầm in vitrro của
hạt mật nhân ở Malaysia cũng nhận thấy hạt nảy mầm tốt trên môi trường MS
không bổ sung chất KTST [16].


1,00b

2,0

1,50b

0,75b

1,00b

3,0

1,00b

1,00ab

1,00b

4,0

2,00b

1,40ab

2,20b

5,0

3,60a

sau 4 tuần nuôi cấy.

3.4. Ảnh hưởng của KIN và IBA đến khả năng tạo rễ in vitro
Chồi in vitro có 2 mắt lá (dài khoảng 2cm) được cấy trên môi trường MS bổ
sung IBA (0,1-0,5mg/L) và KIN (1,0-5,0 mg/L) để tạo rễ in vitro. Sau 6 tuần nuôi
cấy, kết quả được trình bày ở bảng 4.

25