Đồ án tốt nghiệp
QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG
IN VITRO CÂY THÔNG
CARIBAEA (Pinus caribaea) QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG
IN VITRO CÂY THÔNG CARIBAEA (Pinus caribaea)

Kiều Phương Nam, Cao Quốc Liêm, Trần Trung Hiếu, Bùi Văn Lệ

Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Tp. HCM
Kiều Thanh Tịnh


1/2
; Đường sucrose hay glucose với
nồng độ 30g/l; Agar: 7g/l; Than hoạt tính: 1g/l; pH 5,7
0,1; Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ ngày;
Cường độ: 2500 – 3000lux; Nhiệt độ: 25 2
0
C; Độ ẩm trung bình: 70 – 80%.
Khử trùng mẫu cấy
Thí nghiệm được thực hiện để tìm thời gian xử lý citric acid và benzoic acid thích hợp trong
quá trình khử mẫu. Chỉ tiêu theo dõi sau 3 tuần là tỷ lệ mẫu sống khỏe mạnh và không nhiễm. Tiền xử lý: các đoạn chồi non (3–4cm) 3 tuần tuổi mang búp chồi được ngâm trong citric
acid 0,5%, thời gian từ 0–60 phút. Sau đó, các đoạn chồi này được rửa sạch với xà phòng và nước
máy. Tiếp theo các đoạn chồi này được ngâm trong benzoic acid 0,25%, từ 0 – 60 phút. Rửa sạch
mẫu b”ng nước máy. Bước kế tiếp mẫu cấy được khử trùng trong tủ cấy với javel (1 javel: 3 nước),
cồn 70
0
, rửa lại mẫu bằng nước cất vô trùng. Các đoạn chồi được cắt bỏ phần mô chết, cấy vào môi
trường.
Khảo sát sự hình thành cụm chồi từ chồi ngủ
Thí nghiệm được thực hiện với mục tiêu khảo sát sự ảnh hưởng của các yếu tố chất điều hòa
tăng trưởng thực vật (BA, IBA), đường và nước dừa lên sự tạo cụm chồi. Đánh giá dựa trên phần
trăm mẫu cấy tạo cụm chồi, số chồi hình thành mỗi mẫu và chiều cao chồi. Các đoạn chồi ngọn vô
trùng sau 3 tuần khử mẫu được sử dụng cấy vào môi trường SH bổ sung BA (0; 2; 3 và 4mg/l) và
IBA (0; 0,2 và 0,5mg/l). Sau 8 tuần quan sát và ghi nhận kết quả, chọn nghiệm thức tạo cụm chồi
tối ưu để tiếp tục khảo sát sự ảnh hưởng của đường và nước dừa. Sự kết hợp của một trong hai loại
đường glucose (0 và 30g/l) hoặc sucrose (0 và 30g/l) với nước dừa (0 và 10% V/V) (Bảng 1).

Bảng 1. Sự kết hợp giữa các yếu tố: sucrose, glucose và nước dừa

nhiễm. Số lượng mẫu nhiễm tỷ lệ nghịch với thời gian ngâm benzoic acid và ngược lại số mẫu chết li t l thun. Cỏc nghim thc kt hp thờm vic ngõm trong citric acid cng cú vai trũ lm gim
s mu b nhim.

Bng 2. T l phn trm mu sng kho mnh, khụng nhim sau 3 tun

Thi gian ngõm mu
(phỳt)
Nghi
m thc
Citric acid
(0,5%)
Benzoic
acid
(0,25%)
S mu
khụng
nhim
S
mu
nhim
S mu
cht
T l phn
trm mu
sng khụng
nhim
K1 0 0 12 10 8 40,00
Bảng 3. Sự tạo cụm chồi ngủ trên môi trường SH, sau 10 tuần nuôi cấy
Nghiệm
thức
BA
(mg/l)
IBA
(mg/l)
Phần trăm
mẫu tạo chồi
(%)
Số chồi/mẫu Chiều cao
chồi (cm)
C0 0 0 13,33 2,20±0,45 1,24±0,05
C1 2 0 40,00 5,40±0,55 1,34±0,05
C2 2 0,2 50,00 6,80±0,84
1,82±0,04
C3 3 0 56,67 22,00±1,58 0,52±0,04
C4 3 0,2 60,00 37,60±0,81
0,82±0,08
C5 3 0,5 53,33 4,00±0,71
*
0,56±0,09

fructose thông qua enzyme sucrase. Sự kết hợp thêm nước dừa cho hiệu quả tốt hơn vì nước dừa có chứa nhiều amino acid, các chất kích thích tố thực vật, đặc biệt là cytokinin, zeatin, myo-inosytol,
scycle-inosytol. Sau 8–10 tuần nuôi cấy, chồi con ngừng tăng trưởng chiều cao (chỉ đạt 0,5–1cm).
Nguyên nhân có thể là do sự cạn kiệt dinh dưỡng và sự cạnh tranh dinh dưỡng giữa các chồi. Ngoài
ra, trên môi trường 30g/l glucose + 10% nước dừa + 2mg/l BA + 0,5mg/l IBA sau 6 tuần có sự xuất
hiện của nhiều búp chồi ngủ, loại vật liệu cho hệ số nhân chồi cao, chính khả năng tạo được
vật liệu khởi đầu trong diều kiện in vitro sẽ là một yếu tố giúp quy trình nhân giống in vitro
cây thông Caribê thêm hoàn chỉnh.
Khảo sát sự tăng trưởng chồi
Thông qua bảng kết quả (Bảng 5), chúng tôi nhận thấy sự chênh lệch rõ rệch về chiều cao
của chồi thông trong hai dạng môi trường là bán rắn và lỏng. Chồi được nuôi cấy trên môi trường
lỏng tăng trưởng tốt hơn và nhanh hơn (SH1: 4,74 0,05cm) so với môi trường bán rắn (SH1: 2,65

0,14cm). Môi trường thích hợp hơn hết cho sự tăng trưởng chồi là môi trường SH1 dạng lỏng, bổ
sung 0,1 mg/l BA, chiều cao chồi đạt 4,74 0,05cm.
Qua những thí nghiệm trước, chúng tôi nhận thấy sự cạn kiệt dinh dưỡng và nồng độ chất
điều hòa tăng trưởng thực vật cao có thể là nguyên nhân chính gây ức chế tăng trưởng chồi. Do đó,
sự đầy đủ về dinh dưỡng và nồng độ chất điều hòa tăng trưởng thực vật thích hợp sẽ kích thích chồi
tăng trưởng. Môi trường SH3 có nồng độ cytokinin cao (BA: 0,5mg/l) ức chế sự kéo dài thân, nên
chồi có chiều cao thấp hơn so với chồi trên môi trường khác. Đạt được hai yêu cầu thiết yếu về dinh
dưỡng và chất điều hòa tăng trưởng, môi trường SH1 chứng tỏ phù hợp nhất để tăng trưởng chồi.
Trong môi trường SH0, tuy không có chất chất điều hòa tăng trưởng nhưng chồi vẫn tăng trưởng,
nhưng chậm hơn so với môi trường SH1 và SH2, vì môi trường này chỉ đảm bảo về nhu cầu dinh
dưỡng, thiếu hụt hẳn lượng hoormone ngoại sinh.

Bảng 5. Sự tăng trưởng của trên môi trường SH bổ sung các nồng độ BA khác nhau, ở
hai dạng bán rắn và lỏng sau 4 tuần nuôi cấy


Nghiệm
thức
IBA
(mg/l)

Tỉ lệ
mẫu cấy
ra rễ
(%)
Thời gian
xuất hiện
rễ (tuần)
Số rễ/cây Chiều dài
rễ (cm)
Ghi chú
R0 0,0 0 0 0 0
R1 0,2 0 0 0 0
R2 0,5 40 6 5,43±0,53 0,94±0,15 Có 10-12 rễ nhánh
R3 1,0 80 4 1,57±0,53 2,69±0,24 Có 3-4 rễ nhánh
R4 1,5 70 4 5,57±0,53 2,03±0,37 Không rễ nhánh
R5 3,0 30 4 1,93±0,45 1,96±0,21 Không rễ nhánh
R6 5,0 0 0 0 Mẫu chết

Kết quả cho thấy môi trường R3 và R4 có thể sử dụng cho mục đích ra rễ (Bảng 6). Trong
đó R3 là môi trường thích hợp hơn vì sau 8 tuần nuôi cấy đạt 80% chồi thông ra rễ; mỗi cây có 1,57
0,53 rễ và rễ dài 2,69 0,24cm. Ở các môi trường R0, R1 có nồng độ auxin chưa đủ cao để kích
thích sự hình thành rễ sơ khởi từ chồi in vitro. Đối với môi trường R2, nồng độ IBA là 0,5mg/l có
thể kích thích sự hình thành rễ từ chồi nhưng tỷ lệ vẫn còn thấp. Nghiệm thức R5, môi trường có
lượng auxin cao (3mg/l IBA) ức chế sự tạo rễ nên tỷ lệ giảm so với R3 và R4. Môi trường R6, nồng
độ auxin quá cao (5mg/l IBA) làm mẫu chết sau hai tuần ủ tối. Chúng tôi nhận thấy quy trình này có

chồi/ năm.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Trần Trung Hiếu, Nguyễn Xuân Thương, Kiều Phương Nam, Bùi Văn Lệ, 2003. Bước đầu
nhân nhanh giống thông Caribê (Pinus caribaea) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro. Báo
cáo khoa học hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc. NXB Khoa học Kỹ thuật. Trang 880
– 883.
Trần Văn Minh, Hà Thị Loan, 2003. ứng dụng công nghệ tế bào thực vật phát triển cây
nguyên liệu giấy thông Caribê (Pinus caribaea). Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong
khoa học sự sống. Báo cáo hội nghị khoa học toàn quốc lần 2. Nghiên cứu cơ bản trong sinh
học, nông nghiệp, y học. NXB Khoa học Kỹ thuật. Trang 372 – 376.
Bùi Trang Việt, 2000. Sinh lý thực vật đại cương, phần II. Tủ sách trường Đại học Khoa học
Tự nhiên. Trang 78 – 110.
Phạm Thị Kim Thanh, Huỳnh Đức Nhân, 2007. Nhân giống thông Caribê (Pinus Caribaea)
bằng phương pháp nuôi cấy mô, Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn,
Số 12+13. Trang 91-94. ISSN 0866-7020

IN VITRO PROPAGATION OF CARIBEAN PINE (PINUS CARIBAEA)
Kieu Phuong Nam, Cao Quoc Liem, Tran Trung Hieu, Bui Van Le

Department of Biology, University of Science, Ho Chi Minh city
Kieu Thanh Tinh
Centre of South Eastern Forest Science and Production, Forest Science Institute of Vietnam
SUMMARY
Our aim in this study is to reveal the role of three factors that dramatically
affect the efficacy of in vitro propagation process of Pinus caribaea. These
are: 1. the effect of increasing effectiveness of sterilization of benzoic
acid treatment (93.33%); 2. for the initial step of the process, young shoots
carrying bud dormancy are the most suitable material, which can be obtained on
SH medium with 30g/L glucose: 10% coconut water, 2mg/L BA, 0.5mg/L IBA; and