BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
TRẦN THẾ MAI NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO
MỘT SỐ GIỐNG LAN THUỐC THUỘC CHI HOÀNG THẢO
(DENDROBIUM) LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Mã số: 60.42.80
Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. NGUYỄN THỊ LÝ ANH
HÀ NỘI – 2012
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
i
tôi về kiến thức và chuyên môn trong suốt 2 năm học tập và làm luận văn.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới gia ñình,
người thân và bạn bè ñã cổ vũ, ñộng viên, giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian thực
hiện ñề tài.
Một lần nữa tôi xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, tháng 9 năm 2012
Tác giả luận văn
Trần Thế Mai
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
iii
MỤC LỤC
Lời cam ñoan i
Lời cảm ơn ii
Mục lục iii
Danh mục các chữ viết tắt vi
Danh mục bảng vii
Danh mục hình ix
1 MỞ ðẦU 1
1.1 ðặt vấn ñề 1
1.2 Mục ñích và yêu cầu 1
1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2
2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
2.1 Giới thiệu về chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium 4
2.1.1 Vị trí phân bố và phân loại lan chi Hoàng Thảo (Dendrobium) 4
Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng. 43
4.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của pH dung dịch nuôi cấy trên hệ thống
Bioreactor Plantima ñến khả năng nhân protocorm và cụm chồi cây
lan Hoàng Thảo Thạch Hộc và Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng. 49
4.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nghỉ phun ñến khả ngăng nhân
protocorm và cụm chồi. 50
4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của các chế ñộ chiếu sáng ñến khả năng sinh
trưởng của cây in vitro. 52
4.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại ánh sáng ñến sinh trưởng của cây. 52
4.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của cường ñộ ánh sáng ñến sinh trưởng của cây 57
4.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của quang chu kỳ ñến sinh trưởng của cây 61
4.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của các kỹ thuật trồng và chăm sóc ñến khả
năng thích ứng của cây lan in vitro ngoài vườn ươm. 62
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
v
4.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của các phương thức nuôi trồng khác nhau
ñến khả năng sinh trưởng của cây ở vườn ươm 63
4.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của các thời vụ trồng ñến khả năng thích
ứng của cây ở vườn ươm. 66
4.3.3 Ảnh hưởng của các dung dịch dinh dưỡng khác nhau ñến sinh
trưởng và phát triển cây lan. 68
4.3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của pH dung dịch ñến sự sinh trưởng của
cây trên hệ thống khí canh 70
4.3.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của ñộ dẫn ñiện (Electrical Conductivity :
EC) trong dung dịch trên hệ thống khí canh lên sinh trưởng cây lan. 72
4.3.6 Nghiên cứu ảnh hưởng của chu kỳ phun ñến sinh trưởng của cây. 73
4.3.7 Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại thuốc bảo vệ thực vật và các
chế phẩm vi sinh ñến khả năng phòng bệnh của cây. 75
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
vii
DANH MỤC BẢNG
STT Tên bảng Trang
4.1 Ảnh hưởng của các PTNC ñến hệ số nhân (HSN) protocorm, cụm
chồi cây lan Hoàng Thảo Thạch Hộc và Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng 44
4.2 Ảnh hưởng của pH dung dịch ñến hệ số nhân protocorm và cụm
chồi cây Hoàng Thảo Thạch Hộc và Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng
trên hệ thống BP sau 1 tháng 50
4.3 Ảnh hưởng của thời gian nghỉ phun ñến khả năng nhân protocorm
và cụm chồi cây Hoàng Thảo Thạch Hộc và Hoàng Thảo Ngọc Vạn
Vàngtrên hệ thống BP sau 1 tháng 51
4.4 Ảnh hưởng của loại ánh sáng ñến một số chỉ tiêu sinh lý của Hoàng
Thảo Thạch Hộc và Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng sau 2 tháng 55
4.5 Ảnh hưởng của cường ñộ ánh sáng một số chỉ tiêu sinh lý của cây
Hoàng Thảo Thạch Hộc và Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng sau 2 tháng 59
4.6 Ảnh hưởng của quang chu kỳ ñến sinh trưởng của cây lan Hoàng
Thảo Thạch Hộc và Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng sau 2 tháng 61
4.15 Ảnh hưởng của các thuốc bảo vệ thực vật và chế phẩm vi sinh vật
ñến khả năng phòng bệnh của cây trồng trên giá thể sau 2 tháng 78
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
ix
DANH MỤC HÌNH
STT Tên hình Trang
3.1 ðồ thị quang phổ ánh sáng của các hệ thống chiếu sáng nghiên cứu 34
3.2 Sơ ñồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của cường ñộ ánh sáng ñến sinh
trưởng của 02 loài lan Hoàng Thảo Thạch Hộc và Hoàng Thảo
Ngọc Vạn Vàng 35
3.3 Sơ ñồ hệ thống khí canh- Viện Sinh học Nông nghiệp – ðHNN HN 37
4.1 Prtocorm (a), cụm chồi (b) cây lan Hoàng Thảo Thạch Hộc và cụm
chồi (c) cây lan Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng sau 2 tháng trên các
hệ thống bình nuôi cấy trao ñổi khí không hoàn toàn (ðC), không
trao ñổi khí (CT2) và trao ñổi khí hoàn toàn CT3). 46
4.2 Prtocorm(a), cụm chồi(b) cây lan Hoàng Thảo Thạch Hộc và cụm
chồi(b) cây lan Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng sau 2 tháng trên các
hệ thống bình thoáng khí hoàn toàn nuôi cấy có nền môi trường ñặc
(CT3), lỏng tĩnh (CT4) và lỏng lắc (CT5). 47
4.15 Cây lan Hoàng Thảo Thạch Hộc(A) và Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng
(B) khí canh trồng với các loại dung dịch dinh dưỡng khác nhau 70
4.16 Ảnh hưởng của pH ñến một số chỉ tiêu sinh lý cây lan Hoàng Thảo
Thạch Hộc và Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng khí canh với các ñộ pH
sau 3 tháng 71
4.17 Rễ cây lan Hoàng Thảo Thạch Hộc (A) và cây lan Hoàng Thảo
Ngọc Vạn Vàng (B) trên hệ thống khí canh có thời gian nghỉ phun
tốt nhất ở 4 h/ lần và phun 2 phút/ lần sau 3 tháng 75
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
1
1. MỞ ðẦU
1.1. ðặt vấn ñề
Lan từ lâu ñã ñược biết ñến như là loại hoa cao cấp có vẻ ñẹp quyến rũ và có
giá trị thẩm mĩ cao cho mọi người yêu và chơi hoa. Bên cạnh giá trị thẩm mĩ, lan
còn có nhiều công dụng như: Dùng làm thực phẩm (giống orchis), rau xanh (giống
anoetochilus), trà lan (loài jumellea fragrans), hương liệu vanillin (vannila
plannifolia) và ñặc biệt lan còn ñược dùng làm dược liệu.
Tác dụng của các loại thuốc từ lan ñã ñược biết ñến từ rất lâu. Chúng ñã
ñược mô tả trong các sách nói về cây thuốc của Hải Thượng Lãn Ông, cây thuốc
lưu truyền trong dân gian Việt Nam và cả sách cây thuốc trên thế giới. Trong ñó,
chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium) có nhiều loài ñược sử dụng làm dược liệu.
Một số tác dụng của các loài này như: dưỡng âm, dùng nhiều trong trường hợp
nghệ mới nhằm làm giảm chi phí sản xuất và khắc phục sự thụ ñộng trong sản
xuất cây giống hiện nay. Chúng tôi tiến hành thực hiện ñề tài: “Nghiên cứu cải
tiến quy trình nhân giống in vitro một số giống lan thuốc thuộc chi Hoàng
Thảo (Dendrobium)”
1.2. Mục ñích và yêu cầu
1.2.1 Mục ñích
Hoàn thiện ñược quy trình nhân giống in vitro nâng cao hệ số nhân và
chất lượng cây giống cho 02 loài lan dược liệu thuộc chi Hoàng Thảo
1.2.2 Yêu cầu
- Xác ñịnh ñược ảnh hưởng của phương pháp nuôi cấy lỏng lắc ñến khả
năng nhân nhanh protocorm và chồi in vitro
- Xác ñịnh ñược hưởng của phương pháp nuôi cấy thoáng khí ñến khả
năng nhân nhanh protocorm và chồi in vitro
- Xác ñịnh ñược chế ñộ chiếu sáng thích hợp nhất cho sự sinh trưởng của
cây.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
3
- Xác ñịnh ñược kỹ thuật ra cây ñạt hiệu quả cao nhất về tỷ lệ sống và
sinh trưởng của cây in vitro ở vườn ươm
- ðề xuất quy trình nhân giống in vitro ñã ñược cải tiến với hệ số nhân
cao hơn, chất lượng cây giống tốt hơn.
1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
1.3.1. Ý nghĩa khoa học
- ðề tài cung cấp những dẫn liệu khoa học mới về khả năng nhân giống in
vitro và khả năng nuôi cây con trong vườn ươm của một số loài lan dược
liệu thuộc chi Hoàng Thảo (Dendrobium)
- Các kết quả thu ñược sẽ làm cơ sở cho việc nghiên cứu và giảng dạy ñối
với cây lan dược liệu Hoàng Thảo (Dendrobium)
Lindl. (Thế giới có 40 loài, Việt Nam có 12 loài); Oxystophyllum (Blume) Miq.
(Thế giới có 25 loài, Việt Nam có 1 loài)
2.1.2. ðặc ñiểm hình thái của chi lan Hoàng Thảo
Thân: Chi lan Hoàng Thảo thuộc nhóm ña thân (sympodial) với nhiều giả
hành. ðây là nhóm bao gồm các cây tăng trưởng liên tục nhưng có chu kỳ nghỉ
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
5
sau những mùa sinh trưởng. Cấu tạo giả hành gồm nhiều mô mềm chứa ñầy dịch
nhầy, phía ngoài có lớp biểu bì với vách tế bào dày, nhẵn bóng bảo vệ ñể tránh
sự mất nước do sức nóng của mặt trời. ða số các củ giả hành có màu xanh nên
nó ñã cùng với lá làm nhiệm vụ quang hợp (Trần Hợp, 2000).
Thân của các ñại diện chi Hoàng Thảo ñều phân ñốt, hình trụ, hình con suốt,
hình chùy, hình trứng…có chiều dài thay ñổi từ 2-3cm ñến 120 cm hoặc ñôi khi
hơn, kích thước phổ biến là 20-50cm. Lát cắt ngang thân có thể là hình tròn, bầu
dục, ñôi khi hình 4 cạnh nhưng ñược gọi chung theo kích thước ngang này là
chiều dày, thay ñổi từ 0,3-1,5cm nhưng ña số hay gặp là khoảng 0,5-1cm. Thân có
thể mảnh, ñôi khi dẹp bên hoặc là dày mập lên (Dương ðức Huyến, 2007)
Rễ: Sự ña dạng về hình thái và cấu trúc rễ ñã làm cho chi lan Hoàng Thảo
phù hợp với ñiều kiện sống như khi sống trong ñất thì rễ mập, thân rễ bò dài
(Trần Hợp, 2000). Rễ của các ñại diện chi Hoàng Thảo là rễ khí sinh, mảnh,
hình trụ, màu xanh và chuyển thành nâu khi già, chúng thường ôm lấy giá thể
hoặc buông thõng xuống.
Lá: ða số lá có dạng lưng-bụng bình thường, ñôi khi gặp vài ñại diện có
lá hình trụ. Lá nguyên, mép nhẵn, màu xanh có các gân hình cung. Lá thường
hình mác, bầu dục, ñôi khi hình kiếm, hình thuôn hoặc ít khi lá hình thoi dài,
hình nêm. ðỉnh lá nhọn hoặc tù, rất nhiều trường hợp lá xẻ 2 thùy nhọn, tù hoặc
là tròn lệch nhau. Chiều dài của lá thay ñổi từ 1-19 cm và chiều rộng từ 0,3-
3,5cm. Lá hình trụ thường có bề dày (từ 0,2-0,4cm) (Dương ðức Huyến, 2007)
và ảnh hưởng lớn ñến sự ra hoa của cây.
Trong thực tế sản xuất tại miền Bắc có mùa ñông lạnh và mùa hè nóng thì
cần hạn chế tác ñộng xấu của nhiệt ñộ bằng cách vào mùa ñông thì che phủ
nilon quanh nhà trồng lan hoặc thắp ñiện còn mùa hè che lưới phản quang, có
hệ thống phun tưới thích hợp và tạo ñiều kiện thông thoáng trong nhà lan sẽ ñem
lại hiệu quả rõ rệt (Nguyễn Thị Kim Lý. 2009)
Ẩm ñộ: ðộ ẩm thích hợp giúp cho cây ñược phát triển nhanh hơn hoa
tươi và lâu tàn. Dendrobium cũng như ña số các giống lan khác chỉ phát triển tốt
trong ñiều kiện không khí ẩm nhưng thoáng khí, vào ban ngày cây cần ñộ ẩm
khoảng từ 40-60%, vào ban ñêm ñộ ẩm thích hợp từ 60-90% thì cây sẽ phát triển
tốt hơn. Loại giá thể quá ẩm và úng sẽ là ñiều kiện bất lợi cho sự sinh trưởng của
giống Dendrobium vì có thể bị thối toàn bộ rễ và biểu hiện là các cây con mọc
từ phần ngọn của thân (Bùi Thị Thu Hiền, 2009).
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
7
Ánh sáng: Dendrobium là giống ưa sáng, có thể trồng trong ñiều kiện ánh
sáng trực tiếp hay khuếch tán. Ánh sáng hữu hiệu cho giống Dendrobium là
70%, vì thế giàn che với ñộ che sáng 30% dưới ñất và 40% ở trên cao với cường
ñộ ánh sáng từ 15.000-30.000 lux rất thích hợp cho sự phát triển của
Dendrobium.
Mùa hè của miền Bắc cường ñộ ánh sáng mạnh, nhu cầu ánh sáng của lan
Hoàng Thảo khoảng 70-80% ánh sáng trực tiếp. Trong ñiều kiện râm mát cây
thường yếu, mọng nước, rất dễ nhiễm bệnh. Về mùa ñông cường ñộ ánh sáng
yếu và thời gian chiếu sáng ngắn, ñể lan Hoàng Thảo sinh trưởng và phát triển
tốt và ra hoa ñược thì cần bổ sung ánh sáng bằng cách thắp ñiện cho vườn lan
(Bùi Thị Hiền, 2009).
Dinh dưỡng: Lan Hoàng Thảo yêu cầu một lượng dinh dưỡng nhất ñịnh
ñể sinh trưởng và phát triển. Tuy không ñòi hỏi số lượng lớn nhưng phải ñầy ñủ
phấn có nắp. Quả dài, hình thoi. Mùa hoa tháng 3 - 4; mùa quả tháng 5 – 6.
Loài Denñrobium chrysanthum Lindl. Có tên Việt Nam là Hoàng Thảo
Ngọc Vạn Vàng, Thúc hoa thạch. Cây thảo phụ sinh, có thân ñứng cao 20-
145cm, dày 1-1,7cm, có khi thõng xuống, lóng dài 3cm. Lá có phiến thon nhọn,
dài ñến 13-19cm, rộng 3-4,5cm, Hoa 2-6 xuất hiện một lượt với lá, cuống và bầu
dài ñến 5cm; phiến hoa vàng da cam, dài 2,5cm, môi rộng, mép có rìa mịn, có 2
ñốm tía ở họng
Giá trị sử dụng
* Cây ñược dùng làm cảnh vì hoa to, ñẹp.
* Các bộ phận của cây ñược sử dụng làm thuốc:
Theo dược ñiển Trung Quốc 1997 (bản in tiếng Anh) dùng nhiều loài làm
Hoàng Thảo Thạch Hộc như D.Loddigesii Rolfe, D.fimbriatum Hook.,
D.chrysanthum Wall.ex Lind., D.nobile Lindl. Hoàng Thảo Thạch Hộc chứa
alcaloid sesquiterpen, dendrobine (alcaloid chính), nobilin, dendroxin, dendramin,
dendrin, 8-hydroxydendroxin, 3-hydroxy- 2-oxodendrobine, 6-hydroxydendroxin.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
9
Hàm lượng dendrobine ở cây trồng là 0,58% (ở thân) và 0,6% (lá) và ở cây hoang
dại là 3,2% (ở thân), 0,8% (lá), và 0,08% (rễ). (ðỗ Huy Bích và cs, 2004). Ngoài
ra còn có một số alcaloid bậc 4 như N-methyldendrobinium iodid, N-isopentenyl
dendrobinium bromid, dendrobine N-oxyd, N-isopentennyl dendroxinium clorid
và N-isopenyl-6hydroxy dendroxinium clorid. Phần trên mặt ñất của cây chứa 2
dẫn chất pheantren là 4,7-dihydroxy-2- methoxy-9, 10-dihydrophenanthren và
denbinobin. Hai chất này ñộc ñối với tế bào (ðỗ Huy Bích và cs, 2004).
Cây ñược dùng chữa bệnh sốt nóng, khô cổ, ho, ñau rát họng, khát nước
thuộc chứng âm hư,nóng trong, chữa ñau lưng, chân tay nhức mỏi, làm thuốc bổ
ngũ tạng, chữ hư lao, ra mồ hôi trộm, nam giới thiểu năng sinh dục, di tinh ñau
dạ dày ợ chua, sau khi khỏi bệnh bị hư nhược, gầy yếu, kém ăn.
phân chia mạnh mẽ. Quá trình ñó gọi là phản phân hoá tế bào, ngược lại với sự
phân hoá tế bào.
Về bản chất thì sự phân hoá và phản phân hoá là một quá trình hoạt hoá,
phân hóa gen. Tại một thời ñiểm nào ñó trong quá trình phát triển cá thể, có một số
gen ñược hoạt hoá (mà vốn trước nay bị ức chế) ñể cho ra tính trạng mới, còn một
số gen khác lại bị ñình chỉ hoạt ñộng và tính trạng ñó cũng biến mất. Mặt khác một
số gen vẫn tiếp tục hoạt ñộng ñể duy trì các tính trạng ñã có (Hoàng Minh Tấn,
Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Quang Sáng, 2006) ñiều này xảy ra theo một
chương trình ñã ñược mã hoá trong cấu trúc của phân tử ADN của mỗi tế bào khiến
quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn ñược hài hòa.
Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế
bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của
khối mô sẽ tạo ñiều kiện thuận lợi cho sự hoạt hóa các gen của tế bào.
2.2.3. Quy trình nhân giống in vitro
Theo Georger (1993) quá trình nhân giống in vitro bao gồm các bước sau:
* Chọn lọc và chuẩn bi cây mẹ
Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc các cây mẹ. các cây
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
11
này cần phải sạch bệnh, ñặc biệt là bệnh virut. Việc trồng các cây mẹ trong ñiều
kiện thích hợp với chế ñộ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy
mẫu cấy sẽ làm giảm tỷ lệ nhiễm, tăng khae năng sống và sinh trưởng của mẫu cấy.
* Nuôi cấy khởi ñộng:
Là giai ñoạn khử trùng ñưa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai ñoạn này cần
ñảm bảo các yêu cầu sau: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh
trưởng tốt. Khi lấy mẫu cần chọn ñúng loại mô, ñúng giai ñoạn phát triển của
cây. Quan trọng nhất là ñỉnh chồi ngọn, ñỉnh chồi nách và sau ñó là các ñỉnh
chồi hoa và cuối cùng là ñoạn thân, mảnh lá…
dàng những tế bào thực vật hay mô phân sinh sạch bệnh trong môi trường nhân tạo
thích hợp ñể tạo ra những khối tế bào hay những cây hoàn chỉnh trong ống nghiệm.
Trong các kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào ñang áp dụng hiện nay trên thế giới và
Việt nam thì phải kể ñến kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật trên môi trường cứng (có sử
dụng agar) ; Nuôi cấy mô trên môi trường lỏng (lỏng tĩnh, lỏng lắc có sử dụng máy
lắc, bioreactor cso cánh khuấy ) ; Nuôi cấy mô ngập chìm ngắt quãng (thiết bị có bộ
phận phun, sục khí tạo áp suất ñẩy dung dịch dinh dưỡng ñến khoang nuôi mẫu cấy).
ðối với mỗi kỹ thuật này thường có những ñặc tính riêng :
a. Hệ thống nuôi cấy mô môi trường rắn : Là hệ thống nuôi cấy in
vitro sử dụng giá thể chứa chất dinh dưỡng ñể giữ cho cây ñứng vững ñồng thời
cung cấp chất dinh dưỡng cho cây.
Khái niệm về giá thể. Giá thể là một loại hay một hỗn hợp vật liệu ñược
sử dụng làm vật nâng ñỡ, là chỗ cho rễ bám vào trong suốt quá trình sinh trưởng
và phát triển. Vật liệu làm giá thể phải chắc chắn và ổn ñịnh trong các ñiều kiện
khác nhau, chịu ñược hấp vô trùng mà không bị biến tính, trơ với các chất trong
môi trường nuôi cấy. Ngoài ra, vật làm giá thể phải sạch và không ñược chứa
các chất lạ do thành phần của môi trường dinh dưỡng là xác ñịnh và cần kiểm
soát ñược trong từng trường hợp nuôi cấy. Chất tạo ñông thông dụng nhất là
agar. Agar là một polysaccharide chiết xuất từ rong biển. Agar ñược sử dụng
như một tác nhân tạo ñông trong hầu hết các môi trường nuôi cấy mô in vitro.
Agar là loại giá thể sử dụng phổ biến nhất trong các phòng thí nghiệm.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
13
- Chất tạo gel biến môi trường dinh dưỡng thành một hệ kín, hạn chế khả
năng di chuyển của các thành phần dinh dưỡng, do ñó mẫu cấy chỉ hấp thụ ñược
một phần dinh dưỡng ở vị trí gần nó nhất. Hơn nữa, những chất ñộc do chính
thực vật tiết ra bị tích lũy xung quanh mẫu cấy và ức chế trở lại sự sinh trưởng
và phát triển của thực vật (thường gặp nhất là hiện tượng tích tụ phenol gây chết
lỏng. Việc nghiên cứu nồng ñộ khoáng và các chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật
cũng ñược thực hiện với môi trường lỏng. Tuy nhiên, môi trường lỏng ñược sử
dụng trong thời kỳ này ñơn giản chỉ là môi trường lỏng tĩnh. Hệ thống nuôi cấy
lỏng có nhiều lợi ñiểm không thể phủ nhận:
- Môi trường nuôi cấy lỏng có ñộ ñồng nhất cao do các chất tinh dưỡng
khuếch tán ñều trong dung môi lỏng, tạo ñiều kiện ñể mẫu cấy sử dụng triệt ñể
chất dinh dưỡng sẵn có. Hơn nữa, toàn bộ bề mặt mẫu ñược tiếp xúc trực tiếp
với môi trường nên việc hấp thu chất dinh dưỡng hiệu quả hơn, cây sinh trưởng
tốt hơn, thời gian nuôi cấy có thể ñược rút ngắn.
- Nuôi cấy lỏng cho phép kiểm soát các thông số hóa lý một cách chủ
ñộng, ñây là một ñiều kiện cần có ñể thực hiện tự ñộng hóa. Do vậy, nuôi cấy
lỏng rất phù hợp khi triển khai ra quy mô công nghiệp.
- Chi phí sản xuất và giá thành sản phẩm thấp hơn so với nuôi cấy bán rắn,
tiết kiệm ñược thời gian và lao ñộng. Bên cạnh những mặt mạnh, việc nuôi cấy
lỏng cũng vấp phải nhiều khó khăn, nhất là khả năng thoáng khí kém, hiện
tượng thủy tinh thể và ñòi hỏi nhiều thiết bị phức tạp. Một vấn ñề lớn thường
gặp trong nuôi cấy môi trường lỏng ñó là sự nhiễm vi sinh vật. Nấm mốc, vi
khuẩn và côn trùng là những nguồn gây nhiễm nghiêm trọng. Chúng là nguyên
nhân gây mất nguồn mẫu thực vật chủ yếu trong các phòng thí nghiệm thương
mại. Vì là môi trường lỏng nên sự nhiễm vi sinh vật sẽ là rất nhanh và nghiêm
trọng hơn cả so với các loại môi trường khác. Sự gây nhiễm có thể xuất phát từ
các giai ñoạn thao tác chuẩn bị và ñiều khiển thiết bị. Trong một số phòng thí
nghiệm, ñể hạn chế nguy cơ bị nhiễm, người ta thường tạo một không gian vô
Copyright: Tài liệu đại học ©