ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
   NGUYỄN THỊ THƯƠNG HUYỀN NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN QUY TRÌNH ĐÔNG LẠNH
TẾ BÀO TRỨNG BÒ NHẰM NÂNG CAO HIỆU QUẢ
TẠO PHÔI TRONG ỐNG NGHIỆM
Chuyên ngành: Sinh lý học Người và Động vật
Mã số chuyên ngành: 62 42 30 01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – 2014

Công trình này được hoàn thành tại: Phòng thí nghiệm Tế bào gốc, Trường Đại học khoa
học Tự Nhiên TP. HCM. Người hướng dẫn khoa học: TS. Hoàng Nghĩa Sơn
TS. Nguyễn Quốc Đạt


1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiệu quả thụ tinh trong ống nghiệm (In Vitro Fertilization - IVF) từ nguồn tế
bào trứng (TBT) động vật có vú nói chung và TBT nói riêng cho kết quả còn rất
thấp hơn so với TBT tươi. Vì vậy, việc cải tiến quy trình đông lạnh và giải đông
nhằm nâng cao hiệu quả IVF từ TBT bò đông lạnh là một yêu cầu cấp thiết hiện nay.
Nghiên cứu IVF từ TBT bò đông lạnh ở Việt Nam mới chỉ có một số ít tác giả
thực hiện gần đây, tỉ lệ thụ tinh khá thấp (11,67%, 3,72% phát triển lên phôi nang),
tỉ lệ TBT sống sau đông lạnh mới đạt 14% và tỉ lệ tạo phôi dâu, phôi nang từ TBT
đông lạnh chỉ đạt 2,5%. Những công trình nghiên cứu theo hướng này ở nước ta còn
rất ít, cũng như tỉ lệ thành công còn thấp hơn nhiều so với các nghiên cứu trên thế
giới. Để nâng cao tỉ lệ TBT sống sau đông lạnh, giải đông và góp phần nâng cao tỉ lệ
tạo phôi trong ống nghiệm từ TBT đông lạnh, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên
cứu cải tiến quy trình đông lạnh tế bào trứng bò nhằm nâng cao hiệu quả tạo
phôi trong ống nghiệm”
2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
Cải tiến được quy trình đông lạnh TBT bò bằng phương pháp thủy tinh hóa
phù hợp với điều kiện Việt Nam, góp phần nâng cao hiệu quả thụ tinh trong ống
nghiệm từ TBT bò đông lạnh.
3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
1/. Nuôi chín TBT tươi trong ống nghiệm
2/. Đông lạnh, giải đông TBT chín (TBT MII)
3/. Thụ tinh trong ống nghiệm từ các TBT MII đông lạnh
4/. Thử nghiệm cấy truyền phôi tạo ra từ các TBT MII đông lạnh
5/. Đông lạnh, giải đông TBT giai đoạn túi mầm (TBT GV)
6/. Nuôi chín TBT GV sau khi được bảo quản lạnh
7/. Thụ tinh trong ống nghiệm từ các TBT GV đông lạnh được nuôi chín in vitro
4. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
 Nâng cao được tỉ lệ sống của TBT bò sau đông lạnh, giải đông góp phần nâng
cao hiệu quả tạo phôi trong ống nghiệm từ TBT bò đông lạnh;
 Góp phần trong việc thành lập ngân hàng tế bào sinh sản gia súc, từ đó làm cơ

cân bằng và dung dịch thủy tinh hóa, tỉ lệ TBT có thoi vô sắc bình thường theo
phương pháp nhuộm DAPI sau đông lạnh giải đông đạt 50,00% (TBT bò) và 57,7%
(TBT bê), P < 0,05. Tỉ lệ thụ tinh được cải thiện đáng kể khi xử lí với Taxol trước
khi thủy tinh hóa: 33,7% so với 23,5% (TBT bê); 41,9% so với 34,00% (TBT bò).
Chỉ riêng nhóm được xử lí trước với Taxol có phôi phát triển đến giai đoạn phôi
nang (3,2%), còn nhóm không xử lí với Taxol chưa ghi nhận được phôi nào đạt đến
giai đoạn phôi nang. Một công bố khác của nhóm này về đông lạnh TBT MII khi
được xử lí trước với Taxol cho thấy Taxol đã có vai trò tích cực trong việc cải thiện
tỉ lệ bình thường của thoi vô sắc, tỉ lệ thụ tinh và tỉ lệ phát triển phôi nang đối với
TBT bò MII khi được thủy tinh hóa: 45,8% so với 29,9%; 42,8% so với 16,2% và
2,3% so với 0,00% (P < 0,05) [104].
Năm 2010, nhóm nghiên cứu do Zhou và cs. tiến hành bảo quản lạnh TBT bò
MII, tỉ lệ sống sau đông lạnh giải đông đạt 93,00% (chưa loại bỏ cumulus) so với
91,8% (đã loại bỏ một phần cumulus); tỉ lệ thụ tinh và phát triển đến giai đoạn phôi
nang ở nhóm để nguyên cumulus so với nhóm được loại bỏ một phần cumulus lần
lượt là 35,2% so với 36,8%; 5,00% so với 4,4%. Cũng trong năm này, Prentice
(Canada) thu được tỉ lệ thụ tinh và phát triển phôi nang khi tiến hành IVF từ nguồn
TBT bò MII được thủy tinh hóa lần lượt là 42% và 0,4% so với lô đối chứng là 93%
và 31% [117].
1.1.1.2. Đông lạnh tế bào trứng túi mầm (GV)
Năm 2006, Cetin Yunus và Ayhan Bastan bảo quản TBT bò GV bằng phương
pháp đông lạnh cực nhanh với các chất bảo vệ khác nhau, tỉ lệ chín trên 20,7% so
với nhóm đối chứng là 79,6% [39]. Gupta và cs. thử nghiệm quy trình thủy tinh hóa
bằng cách sử dụng kết hợp EG và DMSO đối với TBT heo GV, chỉ 3,4% phát triển đến
phôi nang so với lô TBT tươi là 20,1% [62]. Yamada và cs. bảo quản lạnh TBT bò - 3 -
GV bằng phương pháp thủy tinh hóa, tỉ lệ chín khi nuôi các TBT GV sau khi đông
lạnh và giải đông đạt 11,7% (lô 1) và 29,2% (lô 2).

Năm 2010, Viện chăn nuôi quốc gia Hà Nội đã tiến hành giải đông TBT bò
bằng phương pháp thủy tinh hóa trong vi giọt, tỉ lệ sống sau giải đông là 14%, đã tạo
được phôi từ TBT bò sau đông lạnh giải đông, tỉ lệ phôi nang từ TBT đông lạnh đạt
2,5%.
Hiện nay các nhà khoa học vẫn đang tiếp tục nghiên cứu về việc bảo quản TBT
ở động vật có vú, nhằm mục đích tạo ngân hàng bảo quản giao tử cái (TBT) để phục
vụ cho các nghiên cứu sâu hơn: IVF, ICSI, cloning, chuyển gen, thu nhận tế bào gốc
phôi… - 4 -
1.2. CƠ SỞ KHOA HỌC ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO TRỨNG BÒ
1.2.1. Những biến đổi trong quá trình đông lạnh
Sự hình thành tinh thể đá
Sự hình thành tinh thể nước đá trong và ngoài tế bào là yếu tố ảnh hưởng rất lớn
đến sức sống của tế bào sau đông lạnh. Tốc độ làm lạnh chính là yếu tố quyết định
dạng tinh thể nước đá hình thành. Khi làm lạnh với tốc độ thích hợp thì tinh thể
nước đá hình thành có dạng sáu cạnh. Khi tốc độ làm lạnh được đẩy lên thì hình dạng
của nó sẽ là hình cây thông không đồng dạng và hình cầu [12, 102, 111]. Khi tốc độ làm
lạnh đạt đến 20000
o
C/giây, nước nguyên chất tạo băng vô định hình mà không có
dạng tinh thể. Tuy nhiên, quá trình làm ấm trong giải đông sẽ xảy ra quá trình tái tạo
tinh thể nước đá từ nhỏ đến lớn. Vì vậy, tốc độ nâng nhiệt chậm trong quá trình giải
đông sẽ gây bất lợi cho tế bào [12, 102, 111].
Sự khử nước
Một khi tế bào không được khử nước thì cấu trúc đá nội bào sẽ hình thành nếu
nhiệt độ xuống dưới 0
o
C. Tốc độ khử nước của tế bào phụ thuộc vào tính thấm nước

bào (permeable CPA), có khả năng hòa tan do hình thành những liên kết hydro với
các phân tử nước và có độc tính thấp đối với tế bào. Ethylene glycol (EG) là chất
bảo vệ phổ biến nhất và đã được sử dụng trong quy trình thủy tinh hóa. Chất này ít
ảnh hưởng bởi nhiệt trong cơ chế vận chuyển qua màng, độc tính của nó sẽ xuất hiện - 5 -
vào khoảng 38
o
C. Dimethyl sulfoxide (DMSO) có khả năng hòa tan nhiều loại chất
hữu cơ khác nhau: carbohydrate, polymer, peptid, các muối vô cơ và khí. DMSO
được sử dụng khá rộng rãi để bảo vệ các bào quan, mô và tế bào.
Một số chất bảo vệ lạnh khác: Các đại phân tử (polyvinylpirrolidone,
Polyethylene glycol, hydroxyethyl starch (HES), Ficoll, Bovine Serum Albumin
(BSA), Fetal Bovine Serum (FBS)); Taxol ổn định các vi ống nhờ các liên kết bền
vững giữa các dimer α-tubulin và ß-tubulin. Với liều lượng thấp hơn, Taxol ổn định
sự vận động của các vi ống ở thoi vô sắc.
1.2.5. Những khó khăn khi bảo quản lạnh tế bào trứng so với các tế bào khác
TBT dễ bị tổn thương do thay đổi môi trường hơn so với phôi trước khi cấy -
chứa nhiều tế bào [86]. TBT là một tế bào đặc biệt, có màng trong suốt bao quanh,
nên tính thấm nước và chất bảo vệ lạnh của nó giảm. Tỉ lệ diện tích bề mặt trên thể
tích của TBT thấp hơn so với các loại tế bào khác, gây khó khăn cho sự vận chuyển
nước và chất bảo vệ qua màng nguyên sinh chất, tăng nguy cơ hình thành tinh thể đá
ngoại bào trong quá trình đông lạnh. TBT phải duy trì tính nguyên vẹn của vài cấu trúc
đặc thù của nó cần cho sự thụ tinh và phát triển sau đó [70, 117].
CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU
TBT bò thu nhận từ buồng trứng bò cái tại lò giết mổ gia súc thuộc công ty Kỹ
nghệ Vissan và cơ sở giết mổ gia súc Thành Vinh. Tinh trùng sử dụng trong thí
nghiệm là tinh trùng đông lạnh trong cọng rạ, giống Holstein Friesian (Mỹ) và giống

theo quy trình 2, quy trình 3 và các TBT GV đông lạnh, quy trình giải đông qua 3
bước: với môi trường rã đông 1 (TCM–199 + 10% FBS + 5% FCS + 0,25M
Sucrose), môi trường rã đông 2 (TCM–199 + 10% FBS + 5% FCS + 0,15M Sucrose)
và môi trường rã đông 3 (TCM–199 + 10% FBS + 5% FCS). Các TBT sau khi được rã
đông sẽ được đánh giá theo quan sát hình thái dựa trên 3 chỉ tiêu: tỉ lệ thu hồi; tỉ lệ
TBT sống trên tổng số TBT đem đông lạnh; tỉ lệ TBT sống trên tổng số TBT thu
hồi. Riêng TN2 và TN3 của TBT MII đông lạnh, ngoài 3 chỉ tiêu trên còn khảo sát
thêm chỉ tiêu 4 - tỉ lệ TBT có nhiễm sắc thể không bị tổn thương trên các TBT được
đánh giá sống theo hình thái theo nhuộm PI; TBT GV đông lạnh khảo sát thêm chỉ
tiêu đánh giá theo phương pháp nhuộm AO/PI.
2.2.5. Phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm
Thụ tinh trong ống nghiệm được thực hiện theo phương pháp của các nhà khoa học
Nhật Bản (Japan Livestock Technology Association [74], có cải biến.
Dùng môi trường BO để hoạt hóa và pha loãng tinh trùng (dùng tinh đông
lạnh), điều chỉnh mật độ đạt 5-6x10
6
tinh trùng/ml (Otoi, 1998). Dịch huyền phù này
dùng để tạo vi giọt thụ tinh trong đĩa 4 giếng (100 µl/giọt), phủ dầu khoáng một
phần vi giọt thụ tinh, giữ trong tủ ấm 38,5
o
C, 5% CO
2
. Chuyển 15-20 TBT thí
nghiệm vào vi giọt thụ tinh, đặt vào tủ nuôi ở 38,5
o
C; 5% CO
2
trong 5-6 giờ. Sau đó,
quan sát đánh giá kết quả thụ tinh.
2.2.6. Phương pháp nuôi phôi

chín
IVM 1 10 2557
82,42 ± 0,73
a

(2085)
IVM 2 10 980
82,24 ± 1,22
a

(806)
IVM 3 6 2756
83,09 ± 0,71
a
(2290)
a: không có sự khác biệt theo chiều dọc ở độ tin cậy 95%
Tỉ lệ chín của TBT ở các môi trường IVM1 đạt 82,42 ± 0,73% (2085/2557);
IVM2 đạt 82,24 ± 1,22% (806/980); IVM3 đạt 83,09 ± 0,71% (2290/2756). Nhìn
chung tỉ lệ chín đạt từ 82-83% và tương đối ổn định ở những lần thí nghiệm của cả
3 môi trường khảo sát. Tỉ lệ chín của TBT khi nuôi ở 3 môi trường là tương đương
nhau và chưa thấy ảnh hưởng của FCS và hCG lên kết quả nuôi chín TBT tươi (P >
0,05). Có 154/190 TBT ở môi trường IVM1 có thể cực, đạt tỉ lệ 81,05 ± 2,84%. Tỉ lệ
chín theo thể cực không có sự khác biệt so với tỉ lệ chín theo độ giãn nở cumulus (P
> 0,05). Như vậy, kết quả của chúng tôi đánh giá tỉ lệ chín của TBT bò theo độ giãn
nở cumulus và theo sự xuất hiện thể cực thứ nhất là tương đương, và tỉ lệ chín như
vậy tương đối cao (> 80%). Kết quả này đã khẳng định sự thành công trong việc
nuôi trưởng thành TBT bò trong ống nghiệm.
3.2. K
ẾT QUẢ ĐÔNG LẠNH, GIẢI ĐÔNG TẾ BÀO TRỨNG MII (ND2)
Bảng 3.2. Kết quả đông lạnh TBT MII

88,33 ± 0,90
(1135 TBT)
64,51 ± 1,33
ac
(829 TBT)
73,04 ± 1,32
c
a, b, c: khác nhau theo cột, có ý nghĩa về mặt thống kê
CT1-Tỉ lệ thu hồi TBT sau khi giải đông; CT2 – Tỉ lệ TBT sống sau giải đông
trên tổng số TBT đem đông lạnh; CT3- Tỉ lệ TBT sống sau giải đông trên
tổng số TBT thu hồi
Kết quả thu hồi TBT sau khi giải đông nhìn chung đạt trên 80% (P < 0,001). - 8 -
Tỉ lệ TBT sống sau giải đông trên tổng số TBT đem đông lạnh trung bình ở
quy trình 1 đạt 62,89 ± 1,29%; ở quy trình 2 đạt 59,63 ± 1,34% và ở quy trình 3 đạt
64,51 ± 1,33 (P < 0,05). Kết quả này không khác nhau giữa quy trình 1 và quy trình
2, quy trình 1 và quy trình 3 (P > 0,05); nhưng ở quy trình 3 có tỉ lệ TBT sống trên
tổng số TBT đem đông lạnh cao hơn quy trình 2 là 4,88% (P < 0,01).
Tỉ lệ TBT sống sau giải đông trên tổng số TBT thu hồi được ở quy trình 1 đạt
76,85 ± 1,24%; ở quy trình 2 đạt 67,88 ± 1,36% và ở quy trình 3 đạt 73,04 ± 1,32%
(P < 0,01). Kết quả so sánh riêng từng cặp về chỉ tiêu này (CT3) ở cả 3 cặp đều có
sự khác biệt: ở quy trình 1 và quy trình 2 (P < 0,001); ở quy trình 1 và quy trình 3 (P
< 0,05); ở quy trình 2 và quy trình 3 (P < 0,01). Qua phân tích trên cho thấy, tỉ lệ sống
của TBT MII sau khi bảo quản lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa ở quy trình 3
cao nhất, kế đến là quy trình 1 và cuối cùng là quy trình 2. Đây chỉ là kết quả đánh
giá tỉ lệ sống của TBT sau giải đông theo quan sát hình thái.
Kết quả theo đánh giá nhuộm PI được thể hiện trong Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Chất lượng TBT MII sau đông lạnh theo phương pháp


- 9 -
3.3. KẾT QUẢ THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM TỪ CÁC TẾ BÀO
TRỨNG MII ĐÔNG LẠNH
3.3.1. Thụ tinh trong ống nghiệm từ tế bào trứng MII đông lạnh theo quy trình 1
Bảng 3.4. Kết quả IVF từ TBT MII đông lạnh theo quy trình 1
Lô
Số
TBT
đem
thụ
tinh
Tỉ lệ các giai đoạn phát triển của phôi (%)
Phôi 2 TB
Phôi 8-16
TB
Phôi dâu Phôi nang
TN 781
12,93 ± 1,2
a
(101)
11,01 ±
1,12
a

(86)
5,76 ± 0,83
a

(45)

46,84 ± 2,81%; 5,76 ± 0,83% so với 35,44 ± 2,69% và 3,71 ± 0,68% so với 26,27 ±
2,48%, sự khác biệt này đều có ý nghĩa về mặt thống kê (P < 0,001).
Xét sự chuyển tiếp của phôi từ giai đoạn phôi 8-16 tế bào lên phôi dâu và từ
phôi dâu lên phôi nang ở từng lô, kết quả thể hiện ở Bảng 3.5.

Bảng 3.5. So sánh sự chuyển tiếp của phôi 8-16 TBT lên phôi dâu và
từ phôi dâu lên phôi nang
Lô
Số phôi các giai đoạn
Tỉ lệ chuyển tiếp
của phôi (%)

Phôi 8-
16 TB
Phôi
dâu
Phôi
nang
Phôi 8-16
TBT lên
phôi dâu
Phôi dâu
lên phôi
nang
Chỉ số P
theo
hàng
TN 86 45 29 52,33 64,44 0,092
ĐC 148 112 83 75,68 74,11 0,614
Chỉ số P theo cột 0,00025 0,226

(43)
5,71 ± 0,97
a

(33)
ĐC2 528
14,58 ±
1,54
b
(77)
12,69 ±
1,45
a
(67)
4,92 ± 0,94
a

(26)
3,79 ± 0,83
a

(20)
ĐC2’ 183
55,74 ±
3,67
c
(102)
47,54 ±
3,69
b

dâu
Phôi dâu
lên phôi
nang
TN2
63,43 ± 4,16
(85/134 phôi)
50,59 ± 5,42
(43/85 phôi)
76,74 ± 6,44
(33/43 phôi)
0,0129
ĐC2
87,01 ± 3,83
(67/77 phôi)
38,81 ± 5,95
(26/67 phôi)
76,92 ± 8,26
(20/26 phôi)
3.642e-
09

ĐC2’
85,29 ± 3,51
(87/102 phôi)
74,71 ± 4,66
(65/87 phôi)
75,38 ± 5,34
(49/65 phôi)
0,1403

đông lạnh (47,54%; 35,52% và 26,78%, tương ứng, P < 0,001). Như vậy, Taxol có
xu hướng giúp tăng tỉ lệ thụ tinh, tỉ lệ chuyển tiếp từ phôi 8-16 tế bào lên phôi dâu,
nhưng lại làm giảm tỉ lệ chuyển tiếp từ phôi 2 tế bào lên phôi 8-16 tế bào.
Trong thí nghiệm của chúng tôi, ở quy trình giải đông, sau khi thực hiện qua 3
bước giải đông, chúng tôi có để các TBT này vào môi trường nuôi có bổ sung 10%
dung dịch acid Tyrode trong 20 giây. Đây là một khảo sát thăm dò nồng độ và thời
gian tiếp xúc với dung dịch này nhằm giúp màng trong suốt bớt tính cứng sau khi
bảo quản lạnh. Từ đó giúp tăng tỉ lệ thụ tinh và phát triển về sau của phôi. Kết quả
cho thấy tỉ lệ phát triển đến giai đoạn phôi nang đã cải thiện rõ rệt.
3.3.3. So sánh hiệu quả thụ tinh trong ống nghiệm từ TBT MII đông lạnh
Bảng 3.8. Kết quả IVF từ TBT MII đông lạnh ở hai lô TN
Lô
Số
TBT
đem
thụ
tinh
Tỉ lệ các giai đoạn phát triển của phôi (%)
Phôi 2 TB
Phôi 8-16
TB
Phôi dâu Phôi nang
TN1
781
12,93 ± 1,2
a
(101)
11,01 ±
1,12
a

Tỉ lệ thụ tinh ở lô TN2 cao gấp 1,79 lần so với lô TN1; tỉ lệ phát triển phôi ở
giai đoạn 8-16 tế bào ở lô TN2 cao gấp 1,33 lần so với lô TN1; tỉ lệ phôi dâu ở hai lô
thí nghiệm không khác biệt về mặt thống kê. Riêng tỉ lệ phôi nang ở hai lô thí - 12 -
nghiệm cho thấy không khác biệt về mặt thống kê với α = 0,05 (3,71% so với 5,71%,
P = 0,081), nhưng có sự khác biệt với độ tin cậy 91,9%. Cụ thể, tỉ lệ phôi nang trong
TN2 cao gấp 1,54 lần so với tỉ lệ phôi nang trong TN1 (độ tin cậy 91,9%). Như vậy,
những TBT được xử lí trước với 1µM Taxol kết hợp 5% FCS có xu hướng cho tỉ lệ
thụ tinh và phát triển đến giai đoạn phôi nang cao hơn hẳn so với nhóm chưa được
xử lí với Taxol kết hợp 5% FCS.
3.4. KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM CẤY TRUYỀN PHÔI TẠO RA TỪ CÁC TBT
MII QUA ĐÔNG LẠNH
Bảng 3.9. Các giai đoạn của phôi trước khi đông lạnh
Loại phôi (giai đoạn
phôi)
Số l
ư
ợng Tổng số
Phôi dâu 8
45
Phôi nang 37
Cấy được 32/45 phôi cho 23 bò nhận phôi ở các địa chỉ khác nhau. Kết quả có 2
bê con ra đời, đều là bê cái, khỏe mạnh, có kiểu hình khác với kiểu hình bò mẹ mang
thai.
3.5. KẾT QUẢ ĐÔNG LẠNH, GIẢI ĐÔNG TẾ BÀO TRỨNG GV
Đánh giá theo hình thái
Bảng 3.10. Kết quả đông lạnh TBT GV
Vật

Ở thí nghiệm bảo quản TBT bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ: có
2.288 TBT được bảo quản lạnh qua hai đợt thí nghiệm. Sau khi giải đông đã thu hồi
được 2.186 TBT, đạt tỉ lệ 95,54 ± 0,43%. Có 1515 TBT sống theo hình thái sau giải
đông.
Ở thí nghiệm bảo quản trong vi giọt, đã tiến hành trên 2151 TBT (đợt 1: 8 lần
lặp lại với tổng cộng 723 TBT; đợt 2: có 6 lần lặp lại với tổng cộng 1428 TBT). Sau
khi giải đông đã thu hồi được 2.097 TBT, đạt tỉ lệ 97,49 ± 0,34%. Trong đó có 1.574
TBT sống theo hình thái, đạt tỉ lệ 73,18 ± 0,96% so với tổng số TBT đem đông lạnh
và 75,06 ± 0,94% so với tổng số TBT thu hồi. - 13 -
Đánh giá theo nhuộm
Bảng 3.11. Kết quả đánh giá theo phương pháp nhuộm
AO/PI
Nguồn TBT
từ
Số TBT
đem nhuộm
Số TBT
sống
Tỉ lệ sống
Cọng rạ 186 98 52,69 ± 3,66%
ab
Vi giọt 180 87 48,33 ± 3,72%
a
Đối chứng 182 131 71,98 ± 3,3%
c
a, b, c: khác nhau theo cột có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy
95%

Tiêu chí so sánh
TC1 TC2 TC3 TC4
N1
CR 235
34,47 ±
3,1%
(81/235
TBT)
5,11 ±
0,44%
(12/235
TBT)
14,81 ±
3,95%
(12/81
TBT)
42,86 ±
9,35%
(12/28
TBT)
VG 261
32,95 ±
2,91%
(86/261
TBT)
00,00
(00 TBT)
00,00
(00 TBT)
00,00

(31/114
TBT)
54,39 ±
6,60%
(31/57
TBT)
VG 263
52,47 ±
3,08%
(138/263
TBT)
6,08 ±
1,47%
(16/263
TBT)
11,59 ±
2,73%
(16/138
TBT)
42,11 ±
8,01%
(16/38
TBT)
ĐC2 136
96,31 ±
1,61%
(131/136
TBT)
62,50 ±
4,15%

mang
Số TBT
đem
nuôi
Tỉ lệ sống sau
nuôi (%)
Tỉ lệ TBT chín
trên số TBT
đem nuôi (%)
Tỉ lệ TBT
chín trên số
TBT sống sau
nuôi (%)
Cọng rạ 861
51,80 ± 1,70
a
(446 TBT)
20,79 ± 1,38
a
(179 TBT)
40,13 ± 2,32
a
Vi giọt 868
50,81 ± 1,70
a
(441 TBT)
12,79 ± 1,13
b
(111 TBT)
25,17 ± 2,07

22-24giờ trong thí nghiệm đạt 50-51%. Tỉ lệ này còn thấp hơn rất nhiều so với công
bố của Kim và cs. (2007). Tỉ lệ TBT chín trong thí nghiệm của chúng tôi chỉ đạt ở
mức 20,79% (từ cọng rạ) và 12,79% (từ vi giọt). Tỉ lệ này thấp hơn lô đối chứng rất
nhiều (3,29 lần và 5,34 lần, từ cọng rạ và từ vi giọt, tương ứng). Tuy nhiên tỉ lệ này
có cải thiện hơn so với các thí nghiệm ở đợt 1: 20,79% so với 13,30% (từ cọng rạ, P
< 0,05) và 12,79% so với 6,08% (từ vi giọt, P < 0,001). Kết quả này có phần cao
hơn so với một số tác giả đã công bố.
Tóm lại, cùng nuôi trong môi trường N2 nhưng ở đợt thí nghiệm 2 đã cho tỉ lệ
chín cao hơn so với trong đợt 1. Kết quả này đã phần nào khẳng định được kỹ thuật, - 16 -
thao tác của chúng tôi ngày càng hoàn thiện dần và đây chính là những kết quả khởi
đầu của hướng nghiên cứu này ở nước ta.
3.7. KẾT QUẢ THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM TỪ CÁC TẾ BÀO
TRỨNG GV ĐÔNG LẠNH ĐƯỢC NUÔI CHÍN IN VITRO
Tiến hành IVF từ các TBT GV được đông lạnh bằng cọng rạ (CR), đông lạnh bằng
vi giọt (VG); từ nguồn TBT tươi làm đối chứng (ĐC). Kết quả thể hiện ở Bảng 3.19.
Bảng 3.19. Kết quả IVF từ TBT GV đông lạnh được nuôi chín in vitro
Nguồn
TBT từ
Số
TBT
đem
thụ
tinh
Tỉ lệ (%) các giai đoạn phát triển của phôi
Phôi 2 tế
bào
8-16 tế bào Dâu Nang

4,51
b
(63)
36,59 ±
4,34
b
(45)
25,20 ±
3,91
b
(31)
18,70 ±
3,52
b
(23)
a, b, c thể hiện sự khác biệt theo cột, có ý nghĩa về mặt thống kê
Tỉ lệ thụ tinh ở lô cọng rạ cao hơn lô vi giọt (15,64% so với 12,61%), sự khác
biệt này không có ý nghĩa thống kê P > 0,05), nhưng cả 2 lô đều thấp hơn rất nhiều
so với lô ĐC từ 3- 4 lần (P < 0,001). Tỉ lệ thụ tinh trong thí nghiệm của chúng tôi
thấp hơn rất nhiều so với kết quả của Vieira và cs. (2002; 49%), Abe và cs. (2005;
37,7%), Kim và cs. (2007; 55,7%), Prentice (2010; 42% ở nhóm không cân bằng và
59% ở nhóm cân bằng). Tuy nhiên, kết quả của chúng tôi cao hơn so kết quả của
Mastumoto và cs. khi dùng vật mang là lưới nylon (2001; 7%).
Sự phát triển của phôi: Ở lô cọng rạ chỉ có 1,12% (2 phôi) phát triển đến giai
đoạn phôi nang. Ở lô vi giọt chưa có phôi nào phát triển đến giai đoạn phôi nang.
Tóm lại, kết quả đã cho thấy nhóm nghiên cứu của chúng tôi đã bước đầu
thành công trong việc bảo quản TBT bò giai đoạn GV bằng phương pháp thủy tinh
hóa trong cọng rạ và trong vi giọt. Các TBT sau khi bảo quản lạnh có thể sống sót,
nuôi chín in vitro và tiến hành thụ tinh trong ống nghiệm, phát triển đến phôi nang.
Đây là kết quả đầu tiên trong nước cho tới thời điểm này. Tuy nhiên cần có nhiều

(883 TBT)
76,85 ± 1,24
a
2 1285
88,33 ± 0,90
b
(1135 TBT)
64,51 ± 1,33
ab
(829 TBT)
73,04 ± 1,32
b
3 2288
95,54 ± 0,85
c
(2186 TBT)
66,22 ± 1,94
b
(1515 TBT)
69,30 ± 1,93
c
a, b, c: thể hiện sự khác nhau theo cột ở độ tin cậy 95%
Tỉ lệ thu hồi ở 3 nghiệm thức khác biệt nhau, cụ thể: tỉ lệ thu hồi khi đông lạnh
TBT GV cao nhất, đạt 95,54%; kế đến là khi đông lạnh TBT MII được xử lí trước
với Taxol (88,33%) và sau cùng là khi đông lạnh TBT MII theo quy trình cơ bản, sự
khác biệt này rất có ý nghĩa thống kê (P < 0,001). Tỉ lệ sống sau đông lạnh, giải
đông trên tổng số TBT đem đông lạnh không khác biệt theo từng cặp (nghiệm thức
1-2; nghiệm thức 2-3), P > 0,05; chỉ có cặp nghiệm thức 1-3 là khác biệt có ý nghĩa
thống kê (P < 0,05). Tỉ lệ sống sau đông lạnh, giải đông trên tổng số TBT thu hồi có
sự khác biệt nhau ở cả 3 nghiệm thức (P < 0,05). Như vậy, xét tổng thể cho thấy bảo

(29)
2 578
23,18 ±
1,76
b
(134)
14,71 ± 1,47
b

(85)
7,44 ± 1,09
a

(43)
5,71 ± 0,97
a

(33)
3 179
15,64 ±
2,72
a
(28)
9,50 ± 2,19
ab
(17)
3,35 ± 1,35
a
(6)
1,12 ± 0,79

Như vậy có thể thấy, kết quả nghiệm thức 2 là tối ưu trong cả 3 nghiệm thức.
Điều này có nghĩa là khi bảo quản TBT MII bằng phương pháp thủy tinh hóa có bổ
sung Taxol cho hiệu quả tốt hơn so với không bổ sung Taxol. Ở nghiệm thức 3, do
những lần thí nghiệm đầu không có phôi phát triển đến giai đoạn phôi nang nên tỉ lệ
trung bình về phôi nang thấp, chỉ đạt 1,12%. Tuy nhiên với kết quả đạt được cũng
phần nào khẳng định được sự thành công bước đầu trong việc tạo phôi từ các TBT
MII và GV được bảo quản lạnh. Cần có những nghiên mở rộng hơn, sâu hơn nhằm
tìm ra quy trình tối ưu cho việc thủy tinh hóa TBT bò ở các giai đoạn.
Tóm lại, trong quá trình thí nghiệm cho thấy, việc bảo quản lạnh TBT bò MII
bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ cho kết quả tốt hơn so với giai đoạn
GV. Đồng thời, trước khi bảo quản nên xử lí với 1µM Taxol và sau khi giải đông
nên xử lí nhanh với dung dịch acid Tyrode 10% trong 20 giây, cho kết quả tốt hơn
so với nhóm không được xử lí với Taxol.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
Từ kết quả nghiên cứu trên đây, đề tài đã đạt được mục tiêu đề ra, trong đó kết quả
thứ nhất và thứ hai là nổi bật nhất.
1. Đã cải tiến được quy trình đông lạnh tế bào trứng bò giai đoạn MII bằng phương
pháp thủy tinh hóa phù hợp với điều kiện Việt Nam: Bổ sung 1µM Taxol vào môi
trường cân bằng, môi trường thủy tinh hóa và bổ sung 10% dung dịch acid Tyrode - 19 -
vào môi trường sau khi giải đông bước 3 đã nâng cao tỉ lệ sống, tỉ lệ thụ tinh cũng
như phát triển của phôi sau khi thụ tinh trong ống nghiệm (64,51 ± 1,33%; 23,18 ±
1,76%; 5,71 ± 0,97%, tương ứng);
2. TBT bò ở giai đoạn GV sau khi bảo quản lạnh bằng cọng rạ hoặc vi giọt có thể
nuôi chín in vitro trong môi trường cải tiến (N2 = TCM-199 + 10% FBS + 5%
FCS + 10ng/ml EGF + 10IU/ml hCG + 0,2mM Natri pyruvate + 50µg/ml
Gentamycin bổ sung 10% dịch nang trứng), tỉ lệ chín đạt 20,79 ± 1,38% và 12,79

IVF trứng tươi và trứng đông lạnh với tinh trùng đông lạnh”. Tạp chí Công nghệ
Sinh học, ISSN 1811-4989, Tập 7 số 4 năm 2009, trang 435-441.
4. Nguyen Thi Thuong Huyen
, Pham Van Phuc, Le Thanh Long, Duong Thi Thu,
Chung To Nhi, Phan Kim Ngoc (2009) “Experiment on frozen in vitro bovine
embryo transfer after sexing by LAMP method”. The 6
th
annual conference of the
Asian Reproductive Biotechnology Society, Siem Reap, Cambodia, November 16-
20, 2009, P 108. - 20 -
5. Võ Thị Tuyết Nga
*
, Nguyễn Thị Thương Huyền
*
, Bùi Thị Thu Trang, Nguyễn
Quốc Đạt, Nguyễn Thị Thoa, Phan Kim Ngọc (2010) “Nghiên cứu cải thiện môi
trường nuôi chín trứng từ nguồn trứng bò đông lạnh ở giai đoạn túi mầm”, Tạp
chí Khoa học Kỹ thuật Chăn nuôi, ISSN 0868-3417, tháng 03/2010, trang 10-16.
6. Nguyễn Thị Thương Huyền, Nguyễn Thành Trung, Nguyễn Vũ Hoàng Linh, Lê
Thành Long, Hoàng Nghĩa Sơn, Phan Kim Ngọc (2012), “Những tác động của
Taxol lên việc bảo quản lạnh tế bào trứng bò bằng phương pháp thủy tinh hóa”,
Tạp chí Sinh học, ISSN 0866-7160, tập 34 - số 3SE, trang 299-305.
7. Nguyen Thi Thuong Huyen, Le Thanh Long, Nguyen Quoc Dat, Hoang Nghia
Son (2013), Effects of Taxol in cryopreservation of mature bovine oocytes by
vitrification. The 10
th
annual conference of the Asian Reproductive Biotechnology