TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN
-----goCQos------

BÙI THỊ HUẾ

ẢNH HƯỞNG CỦA (NH4)2S04, KNO3 TỚI
KHẢ NẢNG TẠO MÀNG BC CHO VI
KHUẨN GLUCONACETOBACTER

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
•

••

•

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Ngưòì hướng dẫn khoa học:
TS. PHƯƠNG PHÚ CÔNG

HÀ NỘI, 2015
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới cô PGS. TS. Đinh Thị
Kim Nhung, Giảng viên chính, tố Thực vật - Vi sinh, Trường Đại hoc Sư phạm Hà
Nội 2, và thầy TS. Phương Phú Công, Cục Khảo thí - Bộ Giáo dục và Đào tạo
người đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ em trong thời gian học tập và nghiên cứu đề


LỜI CAM ĐOAN

này.


DANH MỤC TÙ VIÉT TẤT

BC:

Bacterial cellulose

cs:

Cộng sự

MT:

Môi trường

STT:

Số thứ tự

MỤC LỤC


MỞ ĐÀU
1 . Lý do chọn đề tài

Màng

sinh

học

thay thế thực phẩm...
Nhận thấy rằng nitơ là nguồn dinh dưỡng quan trọng ảnh hưởng tới quá trình
sinh trưởng và phát triến của vi sinh vật. Đe tìm hiếu rõ hơn ảnh hưởng của nitơ tới
quá trình tạo màng BC mỏng, dai, có thời gian nuôi cấy ngắn nhất tôi đi đến quyết
định chọn đề tài: "Anh hưởng của (NH^ĩSOặ, KNOĩtởi khả năng tạo màng
BCcho vi khuấnGluconacetobacter".
2 . Mục đích nghiên cứu
Lựa chọn nguồn nitơ thích hợp cho lên men tạo màng BC của chủng vi khuẩn
Gluconacetobacter
3 . Nội dung nghiên cứu

4


3.1. Lên men tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter.
3.2. Ánh hưởng của KN0 3 tới khả năng lên men tạo màng BC của chủng vi
khuầnGluconacetobacter.
3.3. Ánh hưởng của (NH^SCUtới khả năng lên men tạo màng BC của chủng vi
khuẩn Gluconacetobacter.
3.4. Khảo sát khả năng lên men tạo màng của chủng Gluconacetobacter trên
môi trường dinh dưỡng từ nước gạo.
4 . Ý nghĩa của đề tài

4.1.

Ỷ nghĩa khoa học

Tìm được nguồn nitơ thích hợp nhất đối với khả năng tạo màng của chủng
Gluconacetobacter.
4.2.


khoa học Bergey thì

họ

Pseudomonadaceae, bộ

Pseudomonadales, lớp Schizommycetes.Gluconacetobacter thuộc nhóm vi khuẩn

5


acetic, là loài vi khuẩn tạo được nhiều BC nhất trong tự nhiên. Mỗi tế bào
Gluconacetobacter có thể chuyển hóa 108 phân tửglucose thành cellulose trong 1
giờ.
Ngày nay, việc phân loại vi khuẩn acetic nói chung và vi khuẩn
Gluconacetobacter nói riêng còn tồn tại nhiều quan điếm khác nhau. Vì vậy, đòi hỏi
cần nhiều nghiến cứu hơn nữa về loại vi khuấn này.
1.1.2.

Đặc điếm phân loại của Gluconacetobacter

1.1.2.1.

Đặc điếm hình thái, tế bào học

Gluconacetobacter là trực khuấn hình
thước khoảng 2ụm, tế bào đứng riêng lẻ hoặc

que,


Đặc điếm sinh lí,

sinh hóa + Đặc điểm sinh lí:
Vi khuấn Gluconacetobacter phát triến ở nhiệt độ 25 - 35°c, pH: 4 - 6 .
Nhiệt độ và pH tối ưu tùy thuộc vào giống.Ở 37°c, tế bào sẽ suy thoái hoàn toàn ngay
cả trong môi trường tối ưu. Tuy nhiên vẫn còn những ý kiến khác nhau và nhiều tranh
cãi về điều kiện nhiệt độ, pH tối ưu cho chủng vi khuẩn Gluconacetobacter sinh
trưởng và tạo màng.
Gluconacetobacter có khả năng chịu được pH thấp nên người ta thường bổ
sung thêm acid acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ.
+ Đặc điếm sinh hóa:
Năm 1950, Frateur đã chính thức đưa ra một khóa phân loại mới căn cứ vào
các tiêu chuấn: khả năng oxy hoa acid acetic thành CƠ 2và H2O; hoạt tính catalase;
khả

năng

tăng

trưởng

trên

môi

trường

Hoyer...



7

Kết quả
+

+


3

-Sinh

trưởng

trên

môi

-Sinh khối không phát triển

-

trường Hoyer
4

-Chuyển

hóa


-Váng vi khuẩn xuất hiện màu

hợp cellulose

xanh lam

1.2.

Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuấn Gluconacetobacter

1.2.1.

Ảnh hường của nguồn cacbon

+

Đe vi khuẩn sinh trưởng và phát triến tốt hơn cần cung cấp nguồn cacbon phù
hợp, tùy nhóm vi sinh vật mà nguồn cacbon được cung cấp là vô cơ hay hữu cơ. Giá
trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ cacbon phụ thuộc vào hai yếu tố: thành phần hóa
học và tính chất sinh lí của nguồn thức ăn, đặc điếm sinh lí của từng loại vi sinh vật.
Người ta sử dụng đường làm thức ăn nuôi cấy phần lớn các vi sinh vật dị
dưỡng. Đường đơn ở nhiệt độ cao có thế chuyến hóa thành loại hợp chất cố màu tối
khó hấp thụ. Trong môi trường kiềm sau khử trùng, đường còn dễ bị chuyến hóa làm
biến đổi pH môi trường. Đế tránh hiện tường này khi khử trùng môi trường có chứa
đường người ta thường chỉ hấp ở áp lực 0,5 atm ở 110°c trong 30 phút. Từ các loại
đường đơn tốt nhất nên sử dụng phương pháp hấp gián đoạn (phương pháp Tyndal).
Đe nuôi cấy các loại vi sinh vật khác người ta sử dụng các nồng độ đường không
giống nhau, với vi khuẩn thường dùng 0,2 - 0,5% đường. Gluconacetobacter sinh
trưng chính trong môi trường có ethanol, glucose, glycerol.Có thế sinh trưởng trong
môi trường chỉ có D - mantolse.Hầu hết các chủng không sử dụng sucrose [7].

Ethanol được sử dụng như một cơ chất.Hàm lượng ethanol có thế thay đối từ 2
- 10% V. Hàm lượng cao hơn sẽ làm giảm năng suất lên men. Theo Hong - J00 Son lại
công bố hàm lượng ethanol có thể thay đổi từ 0,2 - ỉ % tốt nhất là ở 0,6% [4]. Theo
Nodes, lượng ethanol duy trì trong môi trường luôn giữ ở 3 - 3,5%. Các tác giả Ebner
và Heirich, cho lượng ethanol dùng từ 7 - 10% V. Đe tránh hiện tượng oxy hóa hoàn
toàn acid acetic cần có mooti lượng ethanol sót trong sản phẩm từ 0,2 - 0,5% để ức
chế sự tổng hợp enzyme oxy hóa acid acetic và muối acetate [7]. Ngoài việc oxy hóa

9


ethanol, vi khuấn acetic còn có khả năng oxy hóa các rượu khác thành acid tương ứng.
1.3.

Cấu trúc và sự hình thành màng BC từ vi khuẩn Gluconacetobacter

1.3.1.

Đặc điểm cấu trúc của màng Bacterial celluỉocse

BC có đường kính bằng 1/100 đường kính của cellulose thực
vật (PC- Plant Cellulose). Màng BC được cấu tạo bởi chuỗi
polyme ß-l,4glucopynanose mạch thẳng. Có thành phần hóa
học đồng nhất với cellulose thực vật nhưng cấu trúc và đặc
tính lại khác xa nhau [16].
Chuỗi polyme (3-1,4 glucopynanose mới hình thành liên kết với nhau tạo thành
sợi nhỏ (subfibril ) có kích thước 1,5 nm. Những sợi nhỏ kết tinh tạo sợi lớn hơn-sợi
vĩ mô (microfibril ) (Jonas and Farah, 1998), những sợi này kết hợp với nhau tạo
thành bó và cuối cùng tạo dải ribbon (Yamanaka et.al 2000). Dải ribbol có chiều dài
trong khoảng từ 1-9 nm. Những dải ribbol được kéo ra từ tế bào này sẽ liên kết với

cellulose ở vi khuấn Gỉuconacetobacter.

Glucokinase, Phosphoglucomutase,

Glucose - 1 - phosphate uridylytransferase (ƯDPG pyrophosphorylase hay UPG),
Cellulose synthase (CS). Trong đó UPG là enzyme có vai trò quan trọng nhất.

glucose

cellulose
Hình 1.4.Con đường sinh tống hợp cenlulose ở Gluconacetobacter
Hai giai đoạn chính sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn Giai

1
1


đoạn polymer hóa
Đầu tiên enzyme glucokinase (GK) xúc tác phản ứng phosphoryl hóa chuyển
glucose thành glucose-6-phosphate.Enzyme phosphoglucomutase tiếp tục chuyển hóa
glucose-6-phosphate

thành

glucose-1-phosphate

thông

qua



của

quá

trình

sinh

tống

hợp

cellulose

của

vi

khuấn

Gluconacetobacter
Phần lớn tế bào trong môi trường tĩnh, Gluconacetobacter khôngdi động do
chúng nằm bên trong lớp màng cellulose. Điều này làm cản trở nghiên cứu về quá

1
2


trình chuyến hóa, vận chuyến chất dinh dưỡng và oxy đến tế bào.

cho

thấy,

cellulose

được

tổng

hợp

bởi

Gluconacetobacter còn đóng vai trò tích trữ và có thế sử dụng khi vi sinh vật này bị
thiếu dinh dưỡng. Sự phân hủy cellulose được xúc tác bởi enzyme exo gluconase hay
endo glucanase. Các enzyme exo gluconase hay endo glucanase phân hủy cellulose
được phát hiện trong dịch nuôi cấy ở một và chủng Gluconacetobacter sản xuất
cellulose [10].

1
3


1.4.

Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Gluconacetobacter trên thế giới và ở
Việt Nam

1.4.1.



tử chất lượng cao từ màng vi khuẩn (Jay shah, Brown. M. R., 2005); nghiên cứu của
Alexander Steinbuchel, Sang Ki Rhee (2005) về con đường hình thành cellulose ở vi
khuấn, cấu trúc sợi cellulose và đặc tính của màng cellulose, mối quan hệ giữa khả
năng hình thành cellulose và khả năng sinh axit acetic [15]; trong khi đó Alina
Krystynowicz và cộng sự (2005) đã so sánh đặc điếm sinh học phân tử của chủng
Gluconacetobacter dại (có khả năng tổng hợp cellulose) và chủng đột biến (không
có khả năng tống hợp cellulose) [16]; năm 2006 đã có các nghiên cứu về cấu trúc của
màng BC sử dụng làm monocomposit; Czafa, w. Young; Elvie Escoro Brown đã
nghiên cứu và đi đến kết luận có sự tương đồng vầ cấu trúc giữa màng BC với
colagen. Năm 2007, Neelobon và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi
cấy đến khả năng hình thành màng trong điều kiện cụ thế là nuôi tĩnh, nuôi lắc và nuôi
trong bioreactor; Sirlene M. Costa và cộng sự nghiên cứu đặc tính vật lý của màng,
cấu trúc sợi cellulose của màng trong điều kiện nuôi cấy, ứng dụng trong sản xuất
giấy; Wojciech K. và cộng sự nghiên cứu đặc tính, cấu trúc màng cellulose ứng dụng
làm da nhân tạo. Năm 2008, Barbara Surma-S'lusarska và cộng sự [17] đã đưa ra
phương pháp chế tạo màng và nghiên cứu đặc điếm màng, ảnh hưởng của nguồn
cacbon, đường glucose, manitol và xylose đến quá trình tạo màng, cấu trúc sợi
cellulose của màng và ứng dụng trong sản xuất giấy. Hầu hết các tác giả nước ngoài
nghiên cứu theo hướng sinh tổng hợp cellulose từ vi khuẩn, ứng dụng của màng BC
trong y học, công nghiệp giấy, trong chế biến thực phẩm.
Tuy nhiên những ứng dụng thường thấy trên thế giới của màng BC là trong
ngành dược phấm và mỹ phấm. Czajt và cs (2006), sử dụng màng Bc đắp lên vết
thương hở, vết bỏng đã thu được kết quả tốt. Các tác giả Jonas và Farad (1998), Czaja
và cs (2006) đã dùng màng BC làm da nhân tạo, làm mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ.
1.4.2.

Tại Việt Nam


sử dụng nhiều nguồn nguyên lệu khác như các loại bia, rượu nhạt, các nguyên liệu có
chứa đường, tinh bột, axit hữu cơ, giàu vitamin... từ các vùng miền khác nhau ở Việt
Nam.
Việc nghiên cứu và sử dụng màng BC từ chủng Gluconacetobacter ngày càng

1
6


được nhiều tác giả quan tâm. Ngày càng có nhiều các nghiên cứu, công bố liên quan
đến chủng Gluconacetobacter sự hình thành màng BC và các hướng ứng dụng màng
BC. Năm 2006, tác giả Nguyễn Văn Thanh, Trưởng bộ môn Vi Sinh - Ký Sinh,
Trường đại học Y Dược học Tp.HCM đã chế tạo thành công màng trị bỏng sinh học
dầu mù u bằng phương pháp lên men. Màng BC có khả năng thấm nước cao, kết dính
chặt và trơ về mặt hóa học nên nó có vai trò như màng sinh học, có thế thay thế da
tạm thời. Với các hoạt chất tái sinh mô và các chất sát khuẩn đều có nguồn gốc thiên
nhiên không gây đau rát và không chứa các yếu tố gây kích ứng da, chính vì vậy dùng
màng sinh học đế ngăn ngừa biến chứng nhiễm trùng vết thương bỏng, tạo điều kiện
che phủ sớm vết thương, qua đó, rút ngắn thời gian điều trị và giảm thiếu sẹo xấu trên
vùng bỏng sâu.
Gần đây, nhóm nghiên cứu của tác giả Đinh Thị Kim Nhung đã thu nhận màng
BC từ vi khuấn Gluconacetobacter , ứng dụng màng BC trong điều trị bỏng.
Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
2.1.

Đối tượng ngiên cứu và hóa chất
2.1.1.

Đối tượng nghiên cứu

Thuốc nhuộm: Tím gentian, Fucshin, Lugol.
Ngoài ra còn sử dụng: nước dừa.

1
8


2. /.¥. Môi trường
2.1.4.

ỉ.

Môi

trường

giữ

Glucose: 20g KH 2PƠ 4 : 2g Pepton : 5g Nước

giong (MT1)
(NH 4) 2S0 4 : 3g
MgS0 4.7H 20: 2g

máy: lOOOml.
2.1.4.2.

Môi

trường


2.2.1.1.

Axit acetic: 2%

MgS0 4.7H 20: 2g

dừa: lOOOml
2.2.

(NH 4) 2S0 4 : 3g

Phương pháp vỉ sinh vật

Phương pháp bảo quản chủng giống trên thạch nghiêng
chủng

sau

khi

phân

lập

được

xác

định

định vết bôi bằng cách hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn, nhuộm tế bào bằng phương pháp
nhuộm gram:
Tím gentian: 2 phút Rửa
nước
Dung dịch lugol: 2 phút Rửa
nước Cồn 95°: 20 giây Rửa
nước
Dung dịch íucshin: 2 phút
Rửa nước
Hong khô trên ngọn lửa đèn cồn
Sau đó soi trên tiêu bản dưới vật kính dầu và kính hiến vi quang học với độ
phóng đại 1000 lần. Neu tế bào vi khuấn nhuộm màu hồng, đó là vi khuẩn
Gluconacetobacter.
2.2.1.4.

Phương pháp lên men tạo màng

Sử dụng môi trường lên men tạo màng đem hấp thanh trùng ở 110°c trong 20
phút đế tránh caramen đường.Sau đó khử khuấn ở đèn cực tím trong 15 phút. Bổ sung
vào môi trường 10% giống hoạt hóa.
Nuôi cấy ở điều kiện tĩnh và theo dõi sự hình thành màng BC. Khoảng sau 5
ngày thì có thể thu được màng.

2
0


2.2.2.

Phương pháp xác định trọng lượng tươỉ của màng BC

lOg

Thạch

: 20g

Nước máy

: lOOOml

pH

: 7,0-7,2

Phân phối môi trường vào bình tam giác đem khử trùng ở 121°c trong 20 phút,
để nguội khoảng 40-45°C đổ thạch đĩa, cấy vi khuẩn tuyển chọn mới hoạt hóa (1824h) nuôi 6-7 ngày ở điều kiện thích hợp. Quan sát hiện tượng: nếu xung quanh khuấn
lạc có vòng trắng sữa là phản ứng dương tính (acetat bị oxy hóa, calcium giải
phóng ra tạo màu trang sữa), nêu không là âm tính.
2.2.4.

Phương pháp toán học

Chúng tôi xử lí các kết quả thống kê thí nghiệm theo một số phương pháp
trong cuốn "ứng dụng tin học trong sinh học" [1], và "Thống kê và ứng dụng" [ 2] như:

2
1


số trung bình công: dùng đế tính giá trị trung bình của các lần lặp lại thí

Kết quả

Các bước xử lí

2
2


1

-Rửa sạch màng bằng nước máy nhiều

-Loại bỏ bớt acid acetic và các

lần

thành phần dư thừa từ môi
trường, màng có màu vàng, mùi
hơi chua.

2

-Ngâm màng BC trong dung dịch muối

-Làm chết và làm sạch vi khuẩn

NaCl 0,7M, ở 25 - 40°c trong 12 giờ

3


-Màng có màu trắng đục, có mùi

kiểm tra bằng máy đo pH. Rửa sạch để

kiềm

muối Natri acetat
-Ngâm cồn 70°, kiếm tra nếu còn kiềm

-Kiềm còn dư và chất dư thừa sẽ

tiếp tục trung hòa bằng acid acetic -Rửa

tan trong cồn, sau khi trung hòa

nước và đun sôi màng 3 lần, mỗi lần

pH: 7

đun sôi từ 2 - 3 phút

-Loại bỏ muối Natri acetat, các
chất dư thừa. Màng trắng hơi
đục, không mùi

Sau khi xử lí màng BC, chúng tôi tạo màng có kích thước 10x10 cm, sau đó
sấy màng ở nhiệt độ 45°c trong khoảng 6 giờ đế làm thoát bớt hơi nước có trên màng.

2
3

của

chủng

vi

khuẩn

Gluconacetobacter
Chủng Gluconacetobacter nhận từ phòng Vi sinh, Khoa Sinh-KTNN, trường
Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
Quan sát hình dạng tế bào trên kính hiến vi quang học Labomed (Mỹ) với độ
phóng đại 1000 lần, nhận thấy vi khuầnGỉucơnacetobacter là trực khuẩn hình que,
thẳng hay hơi cong,kích thước khoảng 2|Lim, tế bào đứng riêng lẻ hoặc xếp thành từng
chuỗi, không có khả năng di động, không sinh bào tử. Các tế bào được bao bọc bởi
màng nhày có bản chất là hemicellulose,bắt màu hồng khi nhuộm íucshin.

2
4


Hình 3.1. Kết quả nhuộm Gram của Gluconacetobacter
3.1.2.

Sinh trưởng trên môi trường thạch đĩa

Trên môi trường thạch đĩa, vi khuẩn Gỉuconacetohacter hình thành khuẩn
lạc như hình 3.2

2