Đồ án tốt nghiệp Đại Học Nha Trang
SVTH: Phan Thanh Quang - 50SH
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Đề tài : NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN QUY TRÌNH GÂY
MIỄN DỊCH NGỰA ĐỂ SẢN XUẤT HUYẾT THANH
THÔ KHÁNG NỌC RẮN HỔ ĐẤT. Giảng viên hướng dẫn : Th.s LÊ NHÃ UYÊN.
Sinh viên thực hiện : PHAN THANH QUANG.
Lớp : 50CNSH
Khoá : 50
Nha Trang, tháng 7 năm 2012
Đồ án tốt nghiệp Đại Học Nha Trang
SVTH: Phan Thanh Quang - 50SH
i
LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực tập hoàn thành luận văn tốt nghiệp, em đã nhận được sự
1.1.2. Cấu tạo hàm rắn 2
1.1.3. Cấu tạo răng độc và nọc độc. 2
1.1.4. Các cơ quan cảm giác 3
1.2. Một số đặc điểm dịch tễ học ở Việt Nam. 4
1.2.1 Rắn độc ở Việt Nam. 4
1.2.2. Triệu chứng khi bị rắn cắn. 6
1.3. Bản chất sinh hóa và các tác động của nọc rắn lên cơ thể con người 7
1.3.1. Thành phần hóa học của nọc rắn 7
1.3.2. Tính độc của nọc rắn 7
1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới tính độc của nọc rắn 8
1.3.4. Tính độc của nọc rắn thay đổi theo mùa và vùng địa lí 10
1.3.5. Các tác động của nọc rắn lên cơ thể con người 10
1.4. Hệ thống miễn dịch của cơ thể 11
1.4.1. Khái niệm 11
1.4.2. Phân loại miễn dịch. 11
1.4.3. Huyết thanh. 12
1.4.4. Kháng thể. 15
Đồ án tốt nghiệp Đại Học Nha Trang
SVTH: Phan Thanh Quang- 50SH iii
1.4.5. Huyết thanh phòng và chữa bệnh. 16
1.4.6. Súc vật để gây miễn dịch. 17
1.5. Tá chất gây miễn dịch 17
1.5.1. Định nghĩa tá chất 17
1.5.2 Cơ chế hoạt động của tá chất. 17
1.5.3 Vai trò của tá chất 18
1.5.4. Tính an toàn của tá chất. 18
1.5.5. Tá chất Montanide ISA 50 V2 19
1.6.1. Lịch sử 22
1.6.2. Hiện trạng sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn hổ đất và điều trị nạn nhân bị
rắn cắn ở Việt Nam 23
Bảng 1.5: Tính chất tạo nhũ dịch của Montanide ISA 50 V2 20
Bảng 2.1: Phác đồ gây miễn dịch dự phòng bệnh uốn ván 26
Bảng 2.2: Phác đồ gây miễn dịch cao độ cho lô A 29
Bảng 2.3: Phác đồ gây miễn dịch nhắc lại cho lô A. 30
Bảng 2.5: Phác đồ gây miễn dịch nhắc lại cho lô B 33
Bảng 2.6: Pha loãng nọc rắn dùng trung hòa huyết thanh 34
Bảng 3.1: Kết quả hiệu giá huyết thanh của lô A (hồi cứu) 40
Bảng 3.2: Kết quả hiệu giá huyết thanh của lô B ( thí nghiệm ) 40
Bảng 3.3: Kết quả đáp ứng miễn dịch chu kỳ cao độ 41
Bảng 3.4: Kết quả phân tích phương sai hàm lượng kháng thể ở giai đoạn miễn dịch
cao độ (chép nguyên gốc từ phần mềm thống kê Excell ) 42
Bảng 3.5: Kết quả đáp ứng miễn dịch nhắc lại chu kì 2, 3, 4 43
Bảng 3.6: Kết quả phân tích phương sai hàm lượng kháng thể ở giai đoạn miễn dịch
nhắc lại 2, 3, 4 (chép nguyên gốc từ phần mềm thống kê Excell ) 45
Bảng 3.7: Hiệu giá trung bình của 4 chu kì miễn dịch của 2 lô 46
Bảng 3.8: Hiệu giá trung bình của 4 chu kì miễn dịch của 2 lô ngựa A và B 48
Đồ án tốt nghiệp Đại Học Nha Trang
SVTH: Phan Thanh Quang- 50SH vi
DANH MỤC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ
Hình 1.1: Rắn hổ đất (Naja kaouthia) 1
Hình 1.2: Cấu tạo xương hàm của rắn 2
Hình 1.3: Móc độc và nọc độc của rắn 2
Hình 1.4: Cấu trúc kháng thể 15
Hình 1.5: Thành phần và các dạng nhũ dịch của tá chất Montanide ISA 50 V2 19
Bảng 2.4: Phác đồ gây miễn dịch cao độ cho lô B 32
Hình 3.1: Biểu đồ biểu diễn kết quả đáp ứng miễn dịch ở giai đoạn cao độ của 2 lô
A và B 42
Hình 3.2: Biểu đồ biểu diễn kết quả đáp ứng miễn dịch chu kỳ nhắc lại 2, 3, 4 của 2
lô A và B 45
PD50 Liều bảo vệ 50%
PBS Photphate buffered saline (Đệm muối photphate)
SAD Serum Anti Diphtheria (Huyết thanh kháng bạch hầu)
SAR Serum Anti Rabique (Huyết thanh kháng dại)
SAT Serum Anti Tetanus (Huyết thanh kháng uốn ván)
TB Tế bào
WHO World Health Organization (Tổ chức y tế thế giới)
W/O Water in oil (Nhũ dịch nước trong dầu)
W/O/W Water in oil in water (Nhũ dịch nước trong dầu trong nước)
Đồ án tốt nghiệp Đại Học Nha Trang
SVTH: Phan Thanh Quang- 50SH
LỜI MỞ ĐẦU
Từ bao đời nay, rắn độc và nạn nhân của rắn độc luôn là mối quan tâm của
nhiều người trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng. Hằng năm, trên thế giới
có hàng ngàn người chết vì bị rắn cắn. Thống kê sơ bộ cho thấy, mỗi năm Việt Nam
có khoảng 300.000 bệnh nhân bị rắn cắn nhập viện. Trong số những người được
cứu sống, có đến 13-14% phải cắt chi hoặc một phần chi.
Trước đây, ở Việt Nam người ta thường dùng các biện pháp điều trị Đông Y
không đặc hiệu kết quả lành bệnh rất hạn chế, tỉ lệ tử vong cao.
Phương pháp sử dụng huyết thanh để điều trị nạn nhân bị rắn độc cắn đã có
từ cuối thế kỷ XIX. Đây được xem là phương pháp điều trị có hiệu quả và phổ biến
nhất, tính đặc hiệu trong kháng nọc của nó giúp giảm tỷ lệ tử vong khoảng 7 - 10
lần, và trở thành thường qui của các nước tiên tiến dùng trong công tác điều trị, và
cấp cứu nạn nhân do rắn độc cắn.
Ở Việt Nam, sau 8 năm nghiên cứu, vào đầu tháng 4/2004 Viện Vắc-Xin
Nha Trang được sự cho phép của Bộ Y Tế đã sản xuất đại trà hai loại huyết thanh
kháng nọc rắn hổ đất và rắn lục tre.
Tuy nhiên, huyết thanh kháng nọc rắn hổ đất sản xuất được vẫn chưa tối ưu
về chất lượng. Vì vậy, Viện Vắc Xin hiện nay đã và đang nghiên cứu áp dụng quy
trình miễn dịch mới để cải tiến phương pháp sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn hổ
Lớp da mỏng ở dưới có tính đàn hồi làm cho thân rắn cử động rất linh hoạt. Số vẩy
và vị trí của các vẩy ở đầu và ở thân của rắn không thay đổi trong quá trình lớn lên.
1.1.2. Cấu tạo hàm rắn.
Hình 1.2: Cấu tạo xương hàm của rắn.
Cấu tạo cung xương hàm của rắn rất đặc biệt. Các cấu xương cấu tạo thành
bộ hàm rắn đều khớp động với nhau bằng những dây chằng đàn hồi. Đặc biệt,
xương vuông của rắn dài nên nó có tác dụng như chiếc đòn bẩy cho hàm dưới há
rộng ra dễ dàng. Các xương hàm dưới của rắn lại không gắn với nhau mà chỉ nối
với nhau bằng dây chằng. Nó có thể bửa ra hết cỡ theo chiều ngang để tạo ra một
khoảng miệng rộng. Nhờ có cấu tạo đặc biệt này mà rắn có thể nuốt được con mồi
to gấp nhiều lần miệng rắn.
1.1.3. Cấu tạo răng độc và nọc độc.
Hình 1.3: Móc độc và nọc độc của rắn
Đồ án tốt nghiệp Đại Học Nha Trang
SVTH: Phan Thanh Quang Trang 3
Nọc độc của rắn chứa trong hai tuyến độc nằm dưới da, sau mắt và do tuyến
nước bọt (tuyến thái dương) biến đổi thành. Tuyến này có ống dẫn thẳng đến răng
độc nằm ở phía trước hàm hoặc sau hàm của rắn. Các răng độc hình ống hoặc sẻ
rãnh. Khi cắn con mồi, các cơ thái dương co lại ép tuyến độc tiết ra nọc độc; nọc
chảy vào ống dẫn rồi vào răng độc và bơm thẳng vào con mồi.
Trong lợi của nhóm rắn độc có một số răng độc dự trữ. Nếu rắn bị gãy răng
độc chính thí răng độc dự trữ sẽ phát triển thành răng độc mới, thay thế răng độc
chính một cách nhanh chóng.
Khi rắn cắn, nọc qua răng độc được chích sâu dưới da con mồi, vào cơ và lập
tức được dẫn vào máu, tác động tới hệ thần kinh. Trong nọc rắn có hơn 20 thành
phần khác nhau, chủ yếu là protein chứa các men và độc tố polypetid. Thành phần
nọc gây nên hậu quả lâm sàng:
- Độc tố tế bào và hoại tử (men thủy phân proteolytic enzim và
Đồ án tốt nghiệp Đại Học Nha Trang
SVTH: Phan Thanh Quang Trang 5
Bảng1.1: Danh sách các loài rắn độc ở Việt Nam [1].
Dòng
Family
Họ
Subfamily
Tông
Tribe
Giống
Genus
Loài
Species
Tên việt
1. Colubridae Natricinae “ Rhabdophis R. callichroma Có ở Ba Vì
“ “ “ “ R. Nuchalis
“ “ “ “ R. subminiatus
“ “ “ “ R.tigrinus
5. Elapidae Bungarinae Bungarini Bungarus B.candidus Cạp nia, mai gầm bạc
“ “ “ “ B.fasciatus Cạp nong, mai gầm
“ “ “ “ T.jerdoni bourreti Rắn lục hoa cải
30. “ “ “ “ T.monticola
meridionalis
Rắn lục núi
“ “ “ “ T.mucrosquamatus Rắn khô mộc
“ “ “ “ T.tonkinensis*
Đồ án tốt nghiệp Đại Học Nha Trang
SVTH: Phan Thanh Quang Trang 6
1.2.2. Triệu chứng khi bị rắn cắn.
Những loài rắn khác nhau khi cắn gây ra các triệu chứng khác nhau. Người
ta dựa vào các triệu chứng này mà tìm cách chữa trị cho phù hợp.
- Khởi đầu thường là rối loạn cảm giác: tê lưỡi, đau họng, khó nuốt (do tổn
thương các dây thần kinh của vùng hầu họng).
- Tiếp theo, bệnh nhân sẽ khó mở mắt (do liệt cơ nâng mi), khó há miệng,
nhìn mờ (do giãn đồng tử).
- Giai đoạn toàn phát, bệnh nhân sẽ dần dần liệt toàn bộ các cơ, đặc biệt nguy
hiểm là liệt cơ hô hấp, đồng tử giãn to. Bệnh nhân thường vẫn tỉnh, trừ trường hợp
tổn thương thần kinh do nhiễm độc quá nặng.
- Một số trường hợp có thể có loạn nhịp tim nặng dẫn tới tử vong.
- Tổn thương tại chỗ cắn:
+ Rắn cạp nia ( thân có khoang đen trắng ), cạp nong ( thân có khoang
đen vàng) thường không có tổn thương gì, nhiều khi rất khó nhìn thấy, nếu không
bị chích rạch.
+ Rắn hổ mang: hoại tử, phù nề lan rộng quanh vùng rắn cắn, có thể phù
nề toàn bộ chi bị cắn.
- Sẽ có rất nhiều biến chứng có thể xuất hiện trong thời gian này: nhiễm
trùng, loét, sốt cao
- Nguyên nhân tử vong chủ yếu của rắn hổ cắn là suy hô hấp do liệt các cơ
hô hấp, và tổn thương các trung tâm sống còn của thân não do tổn thương thần kinh.
P.Boquet (1948) cho biết những trường hợp người bị rắn độc cắn đau nhức
dữ dội ở chỗ bị cắn, sau đó nọc độc được lan truyền khắp chân hay tay nơi bị cắn.
Da nạn nhân nổi mẫn đỏ lấm tấm hay đỏ bầm nơi chỗ có dấu răng. Lớp biểu bì của
Đồ án tốt nghiệp Đại Học Nha Trang
SVTH: Phan Thanh Quang Trang 8
da sẽ bị khô rồi hoại tử, các mô liên kết xuất huyết. Đồng thời nọc độc được lan
truyền khắp toàn thân, tác động lên các trung khu thần kinh làm hạ thân nhiệt, nôn
mửa, hạ huyết áp, sock, hôn mê sâu rồi tử vong.
A.Calmette[1] mô tả nạn nhân bị rắn hổ mang cắn : không đau nhức lắm, vết
thương lộ rõ nơi bị cắn rồi nọc độc lan truyền nhanh khắp toàn thân, làm trụy tim
mạch, gây khó thở, đi đứng khó khăn, mệt mỏi, thở dồn dập rồi tử vong.
b. Tính độc của nọc rắn độc trên động vật thí nghiệm.
Súc vật nhạy cảm nhất đó là chó, tiếp đến là thỏ, chuột lang, chuột trắng và
bồ câu. Tiêm nọc rắn độc dưới da hay trong da các loài động vật này thì gây nên
hiện tượng hoại tử, nếu đưa nọc rắn vào ổ bụng hay tĩnh mạch, não hay tủy sống thì
ta sẽ thấy xuất huyết đông máu hay hiện tượng co giật thần kinh. A.Calmette đã
quan sát và nhận xét rằng : nếu trộn nọc rắn độc vào thức ăn cho chuột lang với số
lượng thích hợp thí phát hiện có xuất huyết ở bộ phận tiêu hóa.
P.Boquet (1948) [1]đã định nghĩa : liều chết hoàn toàn là liều nhỏ nhất của
rắn độc ở dạng khô có khả năng giết chết động vật thí nghiệm trong điều kiện được
xác định. Theo Slotta và Szyska[1], liều chết hoàn toàn là liều nhỏ nhất của nọc rắn
độc có khả năng giết chết chuột sau 22 giờ qua đường tiêm dưới da.
1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới tính độc của nọc rắn.
a. Nhiệt độ:
Theo Phisalix và Bertrand [1]nọc rắn tươi là một chất nhờn màu vàng, trong.
Đun nóng 60
o
C trong 30 phút thì nọc rắn trở nên đục, ở 80
o
C thì giảm tính độc, ở
Bảng 1.2: Tính chất của các chất dùng để lọc và hấp phụ nọc rắn.
Hoạt chất hấp phụ Tính chất
Than hoạt tính, tinh dầu, Hydrat
albumin
- Nọc rắn được hấp phụ nhanh chóng
Acid phenic - Không làm tủa vói nọc rắn
NaOH, KOH - không làm bất hoạt nhanh nọc rắn
NH
4
(SO4)
2
, Na
2
SO
4
-
Làm tủa một phần hoạt tính của nọc rắn
Acid trichloacetic, piric, tanic, chì
acetat, bichlorua, thủy ngân hay chlorua
vàng
- Làm tủa với thành phần của nọc rắn
Formol , các chất oxy hóa khác
- Kết dính các acid amin làm giảm độc
lực của nọc rắn
Các dung môi hữu cơ : aceton,
chloroform …
- Làm mất phần lớn các yếu tố độc của
nọc rắn
Đồ án tốt nghiệp Đại Học Nha Trang
SVTH: Phan Thanh Quang Trang 11
Các độc tính loại này có đặc tính gắn chọn lọc lên những phần tiếp nhận
(post synapse) của tế bào thần kinh hay chính xác hơn là phần tiếp thu nicotinic và
ngăn cản sự lan truyền kích thích thần kinh đến các cơ, do đó làm tê liệt cơ. Tác
động này có thể so sánh như chất curare. Đó là những đặc tính của nọc rắn thuộc họ
Elapidae và Hydrophiidae.
d. Tác động lên hệ thống tim mạch:
Loại độc tố tim (cardiotoxin) là những chuỗi polypeptic có 60-62 acid amin
như độc tố thần kinh chuỗi ngắn, tác động trực tiếp lên tế bào cơ tim và gây nên sự
co cơ kéo dài làm cho cơ tim mất hết khả năng đáp ứng sự kích thích do những
nguyên nhân tác động từ bên ngoài. Trụy tim kéo dài đưa đến hậu quả tác động lên
áp huyết, thành mạch.
1.4. Hệ thống miễn dịch của cơ thể[9].
1.4.1. Khái niệm.
Miễn dịch (hay miễn nhiễm) là tập hợp tất cả các cơ chế sinh học giúp cho
một cơ thể đa bào giữ được sự liên kết giữa các tế bào và các mô, đảm bảo sự toàn
vẹn của cơ thể bằng cách loại bỏ những thành phần bị hư hỏng cũng như các chất và
sinh vật xâm hại.
1.4.2. Phân loại miễn dịch.
Có nhiều cách phân loại khác nhau:
Liên quan đến quá trình sống.
Liên quan đến tính đặc hiệu.
Liên quan đến nơi tạo kháng thể.
Liên quan đến tính cá thể.
Ở đây ta xét cách phân loại theo nơi tạo kháng thể :
Đồ án tốt nghiệp Đại Học Nha Trang
SVTH: Phan Thanh Quang Trang 12
huyết tương
= 1,7 - 2 ,2. Độ
nhớt của huyết tương thay đổi trong các trường hơp sinh lý và bệnh lý.
MIỄN DỊCH
Mắc phải
Chủ động Thụ động
Tự nhiên Nhân tạo
Tự nhiên
Tự nhiên Nhân tạo
Đồ án tốt nghiệp Đại Học Nha Trang
SVTH: Phan Thanh Quang Trang 13
Độ pH của huyết thanh phụ thuộc chủ yếu vào nồng độ H
+
, OH
–
và có ý
nghĩa rất quan trọng. Khi pH của huyết thanh không phải là hằng số thì pH của máu
cũng thay đổi, do đó các phản ứng trong cơ thể không xảy ra. Bởi vậy pH của huyết
thanh luôn ở khoảng giá trị 7,2 - 7,5.
b. Thành phần hoá học của huyết thanh.
Huyết thanh chiếm tỉ lệ 55 - 60% tổng lượng máu, là dịch trong suốt màu
vàng nhạt. Trong huyết thanh nước chiếm 90 - 91%, chất khô chiếm 9 - 10% gồm
protein, đường, lipit, muối khoáng.
Trong huyết thanh thành phần khí có O
2
và CO
2
. Cứ 100 ml máu động mạch
chứa khoảng 18 - 20 ml O
2
Là thành phần hữu cơ quan trọng nhất của huyết thanh động vật. Có nhiều
loại protein huyết thanh, khoảng 100 - 150 loại khác nhau tuỳ theo cấu tạo và nhiệm
vụ của nó: albumin, globulin, fibrinogen, các enzyme… Số lượng và tính chất của
các protein thay đổi tuỳ theo loài.
Bằng phương pháp điện di trên giấy người ta phân tích được protein huyết
thanh gồm 5 thành phần: phần chạy nhanh nhất là albumin,
1
-globulin,
2
-
globulin, chậm nhất là
-globulin.
- Albumin:
Albumin thuộc protein thuần, hoà tan trong nước, bị đông vón bởi nhiệt, bị
kết tủa bởi dung dịch muối bão hoà. Trong các protein của huyết thanh albumin
chiếm một lượng lớn tới 56,6%, vì vậy nó đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì
Đồ án tốt nghiệp Đại Học Nha Trang
SVTH: Phan Thanh Quang Trang 14
áp suất thẩm thấu của huyết tương, ảnh hưởng đến điều hoà nước trong cơ thể, tham
gia vận chuyển các chất không tan trong máu như billirubin tự do, axit béo, …
- Globulin:
Là một protein huyết thanh quan trọng thứ hai, nó thuộc protein thuần.
Globulin hoà tan trong dung dịch muối loãng, không tan trong nước tinh khiết hoặc
trong các dung dịch có nồng độ vừa phải, bị đông vón bởi nhiệt. Có nhiều loại
globulin:
+
thoái hoá cuối cùng được cơ thể đào thải ra ngoài như ure, axit uric, billirubin…
Ngoài ra huyết thanh còn có những sản phẩm thoái hoá trung gian của protein như
polypeptit và các axit amin tự do. Đồ án tốt nghiệp Đại Học Nha Trang
SVTH: Phan Thanh Quang Trang 15
Glucose:
Glucose máu dao động trong khoảng cố định. Chỉ số này tăng giảm trong các
trường hợp bệnh lý.
Lipid:
Lipid trong huyết thanh bao gồm triglycerit, phospholipit, steroit,
cholesterol.
1.4.4. Kháng thể.
Hình 1.4: Cấu trúc kháng thể.
Kháng thể hay là globulin miễn dịch là các protein có trong huyết thanh hoặc
dịch sinh học của cơ thể (nước tiểu, sữa…) có khả năng liên kết đặc hiệu với kháng
nguyên đã kích thích sinh ra chúng.
Kháng thể chính là protein thường được phát hiện ở phần
-globulin của
huyết thanh, dịch bạch huyết và các dịch khác của cơ thể. Về cấu trúc và hoá tính
đó là những
-globulin điển hình, vì vậy không thể phân biệt được chúng với các
-globulin “bình thường” bằng phương pháp hoá học. Chỉ có thể phát hiện kháng
thể bằng “thuốc thử” đặc hiệu là kháng nguyên tương ứng. Kháng thể được phát
Đồ án tốt nghiệp Đại Học Nha Trang
Copyright: Tài liệu đại học ©