Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

i

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
ĐOÀN TIẾN DŨNG
NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY HOA BAN
(BAUHINIA VARIEGATA L.) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: GS. TS. Chu Hoàng Mậu
Thái Nguyên, năm 2014



THÁI NGUYÊN - 2014
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

iii
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết
quả nêu trong luận văn là hoàn toàn trung thực chưa từng được công bố trong
một công trình khoa học nào.

Tác giả Đoàn Tiến Dũng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


MỤC LỤC
Trang
Trang bìa phụ i
Lời cam đoan ii
Lời cảm ơn iii
Mục lục iv
Danh mục các từ viết tắt v
Danh mục các bảng vi
Danh mục các hình vii
MỞ ĐẦU 1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. CÂY HOA BAN (Bauhinia variegata L.) 3
3
1.1.2. Chi Bauhinia 9
1.1.3. Vai trò của Ban đối với đời sống 10
1.2. IN VITRO . 10
1.2.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thức vật 10
1.2.2. Các nhân tố ảnh hưởng tới quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật 12
IN VITRO
16
1.3.1. Tình hình nghiên cứu nhân giống in vitro trên thế giới 16
1.3.2. Nhân giống cây thân gỗ bằng phương pháp in vitro ở Việt Nam. 18
Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
21
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu 21 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

vi

Công thức
BAP
:
Benzyladenin
DNA
:
Deoxyribonucleic Acid
Đ/C
:
Đối chứng
K
:
Kinetin (6- Furfurylaminopurine)
IAA
:
Indole -3- acetic acid
NAA
:
α -Napthalene acetic acid
THT
:
Than hoạt tính
TN
:
Thí nghiệm
CV
:
Sự sai khác giữa các công thức
LSD
:

3.2.
38
3.3.
của chồi Ban 40
Hình 3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số giá thể đến khả năng sống của
cây Ban nuôi cấy mô. 41
in vitro 42
in vitro 43

1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Cây Ban trắng (Bauhinia variegate L.) có nguồn gốc ở Đông Nam Á và
phát triển trải dài từ Ấn Độ đến Trung Quốc. Tuy có kích thước nhỏ nhưng
Ban là một trong những loại cây phổ biến được trồng để ngăn cản hiệu ứng
nhà kính tại Ấn Độ [8]. Ban trắng (Bauhinia variegate L.) là một loại ban sinh
trưởng và phát triển mạnh ở khu vực Tây Bắc Việt Nam, cây rụng lá theo mùa
và có hoa màu trắng. Cây Ban có khả năng thích nghi tốt, sinh trưởng tốt
trong đất, nhưng không chịu được nghèo dinh dưỡng. Đã được chọn trồng ở
một số tuyến đường ở Hà Nội từ đầu năm 1960 [19].
Hoa Ban còn có tác dụng làm thuốc, lá cây ban dùng để chống khuẩn
rất tốt và có thể sử dụng làm thực phẩm. Ngoài màu sắc và kiểu dáng hoa đẹp,
cây Ban còn có một giá trị như một loại thảo mộc, và là đặc trưng của núi
rừng Tây Bắc [19]. Nhưng nạn phá rừng bừa bãi, đốt rừng làm nương rẫy đã
làm giảm đáng kể số lượng quần thể thực vật này. Dù khả năng sinh sản ở
mức cao nhưng khả năng phát tán và nảy mầm của hạt kém, và việc nhân
giống bằng phương pháp thủ công như gieo hạt, dâm cành, chiết cành… đạt

Lào và Việt Nam. Ban cũng sinh trưởng và phát triển nhiều ở các xứ nhiệt
đới, thường gặp trong các khu rừng rụng lá từ độ cao 500 m tới 1500
m, từ Sơn La, Lai Châu đến Nghệ An. Hoa ban là một loại cây cảnh phổ biến
ở nhiều nơi trong khu vực có khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới, được trồng vì
có hoa tỏa mùi thơm. Tuy nhiên, tại một số khu vực thì nó lại là một loài xâm
hại do hợp thủy thổ và thích nghi với môi trường sống mới. Tại Việt Nam, nó
sinh trưởng chủ yếu ở khu vực Tây Bắc Bắc Bộ. Có trồng ở các thành phố Hà
Nội, Hồ chí Minh [8].
Theo Phạm Hoàng Hộ hoa Ban ở Việt Nam bao gồm khoảng 40 loài đã
được định danh, một số loài thường thấy như [8]:
Bauhinia monandra Kurz (móng bò đơn hùng); cây đại mộc, cao đến
15 mét, nhánh ngang. Lá xanh tươi, có lông mặt dưới; 9 – 12 gân từ đáy; lá bẹ
hình gươm, cao 1cm. Chùm đứng, dài 8 – 10 cm; đài hình tàu; cánh hoa
hường hay vàng có đốm đỏ, cờ vàng có đốm đỏ; tiểu nhụy thụ 1, tiểu nhụy lép
9, nhỏ. Trái dẹp, dài 20 cm, có mũi; hột đen, láng, to 1 cm. Trồng nhiều ở Sài
Gòn, hoa có chấm, mầu hồng hoặc đổ kem. Nguồn gốc Châu Mỹ nhiệt đới.
Bauhinia purpurea L. (móng bò đỏ); cây tiểu mộc 2 – 6 m; nhánh
non có lông. Lá to, không lông, gân từ đáy 9 -11. Tản phòng to, ít hoa; hoa
to, thơm, đỏ tươi hoặc sọc đỏ đậm, đẹp; đài nõa sào có lông. Trái dẹp, 15- 4
25 x 2 cm; hột 12 – 15, rông 12 – 13 mm. Thường trồng ở Bình Nguyên (vì
hoa to đẹp). Nụ ăn như rau; vỏ trị tê thấp, kinh phong, bướu ở bao tử, hoa
giúp tiêu hoa.
Bauhinia pottsii G.Don var. Subsessills (Craib) de Wit; tiểu mộc hay
đại mộc nhỏ; nhánh non có lông mịn, rồi không lông. Phiến lá xoan tròn, chẻ
đến 1/3, to 9 – 14 x 10 – 15 mm, đáy hình tim, có lông nhung màu nâu, gân từ
đấy 11 – 15. Chùm dày, dài đến 10 cm; lá hoa 3 – 5 mm; cọng 1 – 1,5 cm,
mang tiền diệp ở giữa; cánh hoa trắng, dài 4 – 6 cm, cánh hoa sau có bớt

cạp, rắn; rễ trị sưng gan; nụ trị kiết; trái lợi tiểu.
Bauhinia racemosa Lamk (móng bò chùm). Đại mộc, cao đến 15 m;
nhánh thòng, có lông nhưng. Lá có phiến hình thận, dài 5 – 10 cm, mặt trên
không lông, mặt dưới như nhưng xám, gân từ đáy 7 – 9; lá bẹ tam giác, nhỏ,
mau rụng. Chùm thòng, dài 15 cm, thưa, có lông, cọng 5 mm; nụ hình thoi,
cao 5 – 8 mm; đài hình tàu; cánh hoa vàng, thon hẹp; tiểu thụy thụ 10; noãn
sào không lông. Trái hơi cong, không lông; hạt 10 – 20, to 1cm. Có ở Rừng
Dầu Bình Nguyên, Đắc Lắc, lá trị nhức đầu, sốt rét.
Bauhinia viridescens Desv (móng bò xanh). Tiểu mộc, đứng cao 4 – 6
m; nhánh không lông. Lá có phiến hai thùy, đáy hình tim, mỏng, lúc khô nâu
nhạt, mặt trên không lông, mặt dưới có lông ngắn ở gân; lá bẹ tam giác có tơ
mũi. Chùm dài 5 – 15 cm; cọng hoa 2 – 3 mm; nụ bầu dục hay thon; hoa tạp
pha xanh; tiểu nhụy 10; noãn sào có cọng, có lông. Trái 5 – 7 x 0,7 – 1 cm;
hạt 5 – 10 dẹp. Có nhiều ở Hà Sơn Bình, Nghệ Tĩnh, Bình Trị Thiên, Thuận
hải. Quả và lá ăn được.
Bauhinia malabarica Roxb (tai voi). Đại mộc cao đến 17 m; nhánh
không hay có lông. Lá không lông, mốc bạc mặt dưới gân từ đáy 9 – 11.
Chùm 2 – 5 cm; cọng 2 cm; nụ tròn dài; ống đài rất ngắn; cánh hoa trắng,
dài 2 cm; hoa đực với 10 tiểu ngụy thụ; noãn sào có lông. Trái như rắn, dài
25 cm, rộng 2 cm; hạt 10 – 30 mm. Thấy ở những nơi rừng dày, rừng thay 6
lá, từ Quảng Trị đến Tây Ninh, Đồng Nai, Bà Rịa. Lá non chua, trâu bò
thích ăn trái khô.
Bauhinia saccocalyx Piere (Móng bò đài túi). Đại mộc. Lá có lông hoe
dày mặt dưới, gân từ đấy 9 – 11; cuống 2 – 3 cm, có lông. Chùm 2 -3 cm, có
lông hoe; đài to, lá đài rời; cánh hoa trắng hay ửng hồng, dài 13 mm, không
lông; tiểu nhụy 10; noãn sào không lông. Trái to 11 x 2,5 cm; hạt 3 – 4, tròn
dẹp, to 12 – 15 mm. Có ở Quảng Trị. Lá non và hoa ăn được.

thành mảnh mỏng, dài 5 – 6 cm, rông 1,5 cm; hột 2 – 6, dẹp, to 1 cm. Ven
rừng, đến 500 m: Bình Trị Thiên, Phú Khánh, Thuận Hải đến Đồng Nai.
Thân cây làm thừng tốt.
Bauhinia championii Benth (móng bò Champion); tiểu mộc leo; nhánh
non có lông xám hay hoe. Lá có phiên nguyên hay lõm ở chót, mặt dưới trắng
với lông nằm. Chùm dài 6 – 20 cm; nụ xoan, cao 3,5 – 4 mm; cánh hoa trắng,
rộng 2 – 3 mm; tiểu nhụy thụ 3; noãn sào có cọng lông. Trái dẹp, mỏng,
không lông; hạt 2 – 5 mm có lông xám. Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hà Sơn Bình.
Bauhinia bassacensis Pierre ex Gagn (móng bò Hậu Giang); dây leo to;
nhánh non có lông nâu và có móc. Lá không lông hay mặt dưới có lông sét;
cuống 4 – 7 cm. Tản phòng có lông vàng; hoa vàng tái; cánh hoa 5, đài 3 cm,
rộng 7 – 9 mm, trên cọng dài 1 – 2,5 cm; tiểu nhụy thụ 2 – 3, lép 7 – 8; noãn
sào có cọng, có lông. Trái dẹp, to 9 x 3 cm; hạt dẹp, to 1 cm. Rừng dày và bán
thay lá, thường gần biển: Hoàng Liên Sơn, Vũng Tàu, Phú Quốc [8].
Bauhinia bracteata Benth (cánh dơi); dây leo to; nhánh có lông xám.
Phiến xoan tròn, chẻ đến 1/3, to 3 – 15 x 5 – 14 cm, mặt dưới có lông ở gần;
gân từ đáy 9 – 11; lá bẹ đến 1 cm. Chùm hay chùm tụ, tán nhiều hoa; cọng
dài; nụ nhọn; cánh hoa xanh; tiểu nhụy thụ 2 – 3, lép 5, noãn sào cso lông
nhung. Trái có mảnh dày, nâu đậm, to 15 x 5 cm, hạt 2 – 8, tròn dẹp, to 15
mm. Ven rừng, dựa tường: từ Lạng Sơn đến Minh Hải, thân làm thừng. 8
Bauhinia involucrans Gagn (móng bò tông giao); dây leo; nhánh non
ít lông. Lá có phiến chẻ sâu đến 1/3, dài 7 – 14 cm, mặt trên không lông, mặt
dưới gần như không lông, gần từ đáy 9 – 11. Chùm tụ tán dài đến 20 cm, có
lông mịn nâu đỏ; lá hoa thon, dài 1 cm; cọng 2 – 3 cm mang 2 tiền diệp to
bao nụ; đài 5 thùy; cánh hoa hường, trên cọng 8 mm; tiểu nhụy thụ 3, chỉ
hường, có lonog, lép 7; noãn sào 1 cm, có lông đo đỏ, nõa 5 -6. Dựa rạch
800 m: Bảo Lộc.

Bauhinia wallichii Mcbride (Móng bò Wallich).
Bauhinia saigonensis Pierre ex Gagn (Móng bò Sài Gòn).
Bauhinia carcinophylla Merr. (Càng cua).
Bauhinia coccinea
Bauhinia mastipoda Pierre ex Gagn (Móng bò đỏ).
Bauhinia lorantha Pierre ex Gagn (Móng bò thừng).
Bauhinia rubro-villosa K & S.S. Lars (Móng bò lông đỏ).
Bauhinia pyrroclada Drake del Cast (Móng bò lưa).
Bauhinia ornata Kurz (Móng bò diện) [8].
1.1.2. Chi Bauhinia
Bauhinia là thực vật bậc cao thuộc ngành Hạt kín
(Angiospermatophyta), lớp Hai lá mầm (Dicotyledoneae), phân lớp Hoa hồng
(Rosidae), Bộ Đậu (Fabales), họ Đậu (Fabaceae), phân họ Vang
(Caesalpinioideae).
Loài Bauhinia variegata L. (Móng bò sọc; Variegate Bauhinia, Orchid
Tree). thuộc chi Bauhinia tên thường gọi là Ban, đặc trưng cho rừng Tây bắc,
hoa nở vào mùa xuân trắng rừng, trông rất đẹp mắt. Cây Ban là loại cây đại
mộc, cây trưởng thành cao từ 6 đến 15 mét, nhánh non có lông mịn. Lá rụng
theo mùa, phiến lá có màu xanh nhạt, mặt trên của lá không có lông, mặt dưới
ít lông. Chùm hoa dài đến 20 – 30 cm, hơi thòng, có hoa to, đài hoa hình tàu
có 5 răng, có lông, cánh hoa trắng hay đỏ, hơi tím có sọc đậm, dài khoảng 5 10
cm, tiểu nhụy lép cao 1 cm. Trái dẹp, to 15 – 30 x 2,5 cm; kích thước hạt
khoảng 9 – 10, to 10 – 15 mm. Ngoài núi rừng Tây Bắc như Lào Cai, Lai
Châu; gần đây được trồng ở Hà Nội, Thành phố Hồ Chí Minh với mục đích
làm đẹp cảnh quan đô thị [19].
1.1.3. Vai trò của Ban đối với đời sống
Cây ban có vai trò quan trọng trong đời sống, gỗ dùng đóng các đồ đạc

của mô chuyên hoá, đảm nhân các chức năng khác nhau trong cơ thể.
Quá trình phân hoá có thể diễn ra như sau:
Tế bào phôi sinh → Tế bào dẫn → Tế bào phân hoá chức năng
Khi tế bào phân hoá thành mô chức năng, chúng không hoàn toàn mất
khả năng phân chia của mình. Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích
hợp chúng lại có thể trở lại giống như tế bào phôi sinh và tiếp tục quá trình
phân hoá, quá trình này gọi là sự phản phân hoá của tế bào.
Về bản chất thì sự phân hoá và phản phân hoá là một quá trình hoạt hoá
phân hoá gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có 12
một số gen được hoạt hoá để cho ra tính trạng mới, một số gen mới lại ức chế
hoạt động. Quá trình này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong
cấu trúc của phân tử ADN của mỗi tế bào. Khi tế bào nằm trong cơ thể thực
vật, chúng bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách tế bào riêng rẽ, gặp
điều kiện bất lợi thì các gen được hoạt hoá, quá trình phân chia sẻ được xảy ra
theo một chương trình đã định sẵn trong ADN của tế bào [13].
1.2.2. Các nhân tố ảnh hƣởng tới quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.2.2.1. Môi trường nuôi cấy
Môi trường Murashige và Skoogs (MS) được sử dụng.
Ngoài thành phần khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin của môi trường
cơ bản ban đầu thì nước dừa thông thường được bổ sung để tăng cường sự
hình thành mô sẹo (callus), với phạm vi sử dụng từ 10 - 25%. Với mẫu đưa
vào nuôi cấy ban đầu có thể dùng 20% và sau khi xảy ra sự phân hóa cấy
chuyển có thể giảm xuống còn 10% [24].
Một trong những nhân tố quan trọng nữa là cytokinin. Tuy nhiên tùy
theo đối tượng mẫu, ngồng hoa, mô lá hay tính trạng của mẫu (đã cấy chuyển
nhiều lần hay chưa) mà ta sử dụng chủng loại, nồng độ cho thích hợp với từng
loại mẫu, từng thời kì, vì đa số các loại thực vật là tương đối nhạy cảm với sự

gen và các enzym phân giải acid nucleic, cơ chế thứ ba: Auxin tác động
thông qua sự thay đổi tính thẩm thấu của màng. Dùng phương pháp đánh
dấu phân tử có thể thấy NAA dính kết vào màng tế bào làm cho màng hoạt
động như một bơm proton và bơm ra ngoài ion H
+
làm màng tế bào mềm và
kéo dài ra, do đó tế bào lớn lên và sinh trưởng. Trong tế bào, NAA có tác
dụng lên sự tổng hợp acid nucleic [1].
Trong cây auxin được tổng hợp ở các mô non đặc biệt là lá đang phát
triển và vùng đỉnh chồi. Từ những vùng này auxin được chuyển xuống các
phần phía dưới của cây [1]. 14
Cytokinin
Cytokinin là chất điều hoà sinh trưởng có tác dụng làm tăng sự phân
chia tế bào. Các cytokinin thường gặp là kinetin, 6 - benzyl aminopurin (BA).
Kinetin được Skoog phát hiện ngẫu nhiên trong chiết xuất acid nucleic.
Kinetin thực chất là một dẫn xuất của bazơ nitơ adenine. BA là cytokinin tổng
hợp nhân tạo nhưng có hoạt tính mạnh hơn kinetin. Kinetin và BA cùng có tác
dụng kích thích phân chia tế bào kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân
sinh và làm hạn chế sự già hoá của tế bào. Ngoài ra các chất này có tác dụng
lên quá trình trao đổi chất, quá trình tổng hợp ADN, tổng hợp protein và làm
tăng cường hoạt tính của một số enzym. Cơ chế tác dụng của auxin ở mức độ
phân tử trong tế bào thể hiện bằng tác dụng tương hỗ của cytokinin với các
nucleoprotein làm yếu mối liên kết của histon với ADN, tạo điều kiện cho sự
tổng hợp ADN [1].
Những nghiên cứu của Miller và Skoog (1963) đã cho thấy không phải
các chất kích thích sinh trưởng ngoại sinh tác dụng độc lập với hoocmon sinh
trưởng nội sinh. Phân chia tế bào, phân hoá và biệt hoá được điều khiển bằng

Ethylen
Ethylen là chất điều hoà sinh trưởng dạng khí. Ethylen có rất nhiều tác
dụng đối với hoạt động sinh lý và trao đổi chất ở thực vật. Đã từ lâu vai trò
của ethylen đối với việc làm tăng hô hấp trong thời gian quả chín đã được ứng
dụng nhiều. Trong những năm gần đây đã xem xét tác dụng của ethylen lên sự
kéo dài thân và rễ, kích thích tế bào phát triển về bề ngang, kích thích nảy
mầm, tạo lông rễ, tạo hoa ở dứa và lan, ức chế vận chuyển ngang và xuống
của Auxin [1].
1.2.2.3. Phương pháp chuẩn bị môi trường nuôi cấy
Sử dụng môi trường MS (Murashinge & Skoog, 1962), bổ sung agar
7g/l, đường saccarose 30g/l. 16
Các chất kích thích sinh trưởng sử dụng thuộc nhóm Auxin và
Cytokinin bổ sung vào môi trường nuôi cấy với hàm lượng khác nhau tuỳ
thuộc thí nghiệm.
Các chất hữu cơ khoai tây, cà rốt cũng được bổ sung vào môi trường
nuôi cấy với hàm lượng khác nhau tuỳ thuộc thí nghiệm.
Giá trị pH của môi trường nuôi cấy: 5,8 - 6,0.
Thể tích dung dịch dinh dưỡng trong bình nuôi cấy là 50 – 70 ml/ bình
Môi trường nuôi cấy được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121
0
C, áp suất 1,1
atm trong 20 phút.
1.3. IN VITRO

1.3.1. Tình hình nghiên cứu nhân giống in vitro trên thế giới
Nuôi cấy mô tế bào đã được thí nghiệm ở thế kỷ XVII nhưng chỉ thành
công sau những sưu tầm về môi trường nuôi cấy của White và Gautheret [13].