BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI










……… VŨ NGỌC LAN
NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG INVITRO
KHÔNG SỬ DỤNG CHẤT ĐIỀU TIẾT SINH TRƯỞNG
VÀ MỘT SỐ BIỆN PHÁP KỸ THUẬT NUÔI TRỒNG
HAI LOÀI LAN BẢN ĐỊA (DENDROBIUM NOBILE LINDL.,
DENDROBIUM CHRYSANTHUM LINDL.) TẠI HÀ NỘI Chuyên ngành : Trồng trọt
Mã số : 62 62 01 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
- Thư viện Quốc gia Việt Nam
- Thư viện Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội

1

MỞ ðẦU
1. Tính cấp thiết của ñề tài
Hoàng Thảo là một trong những chi lớn nhất của của họ Lan (Orchidaceae). Ở
Việt Nam hiện biết 107 loài và 1 thứ thuộc chi Hoàng thảo, phân bố chủ yếu ở vùng
núi suốt từ Bắc vào Nam và trên một số ñảo ven biển (ðào Thị Thanh Vân, ðặng
Thị Tố Nga, 2008) [55].
Do vừa có giá trị làm cây hoa cảnh vừa làm cây dược liệu nên hai loài lan
bản ñịa của vùng núi và trung du phía Bắc là Thạch hộc (Dendrobium nobile
Lindl.) và Ngọc vạn vàng (Dendrobium chrysanthum Lindl.) thuộc chi Hoàng thảo
ñã bị khai thác kiệt dẫn ñến nguy cơ tuyệt chủng trong tự nhiên.
Hiện nay, trên thế giới cũng như ở Việt nam, phương pháp nuôi cấy mô là
phương pháp nhân giống cây lan cho hệ số nhân cao, số lượng cây giống lớn và giá
thành cây giống hợp lý (Trần Hợp, 1990) [12] và (Lê Văn Hòa, 2008) [9]. Tuy
nhiên, cho ñến nay ở nước ta, việc nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô ñặc biệt sử
dụng nuôi cấy mô cải tiến hai loài lan bản ñịa: Dendrobium nobile Lindl. (D.nobile)
và Dendrobium chrysanthum Lindl. (D.chrysanthum) chưa có ñề tài nghiên cứu nào
ñề cập ñến một cách chính tắc (Trần Văn Huân, Văn Tích Lượm, 2007) [16].
Xuất phát từ những vấn ñề nêu trên, chúng tôi ñã tiến hành ñề tài:
“Nghiên cứu nhân giống in vitro không sử dụng chất ñiều tiết sinh trưởng và
một số biện pháp kỹ thuật nuôi trồng hai loài lan bản ñịa (Dendrobium nobile
Lindl., Dendrobium chrysanthum Lindl.) tại Hà Nội” với mong muốn góp phần
làm cơ sở cho việc tạo ñược nguồn cây giống không chứa các chất ñiều tiết sinh
trưởng thực vật tổng hợp phục vụ cho sản xuất nguyên liệu dược.
2. Mục tiêu và yêu cầu của ñề tài

- Góp phần bảo tồn và phát triển loài lan rừng bản ñịa Dendrobium nobile
Lindl. và Dendrobium chrysanthum Lindl.
- ðề tài ñã ñề xuất ñược quy trình nhân giống in vitro không sử dụng chất
ñiều tiết sinh trưởng và bước ñầu ñưa ra kỹ thuật chăm sóc cây thu thập của loài
lan rừng bản ñịa Dendrobium nobile Lindl. và Dendrobium chrysanthum Lindl
tại Gia Lâm - Hà Nội
4. ðối tượng và phạm vi nghiên cứu của ñề tài
4.1. ðối tượng nghiên cứu của ñề tài
- Hai loài lan rừng bản ñịa Dendrobium nobile Lindl. và Dendrobium
chrysanthum Lindl. thuộc chi Hoàng thảo.
- Các nền môi trường nuôi cấy cơ bản của Vacin and Went, 1949 (VW);
KnudsonC, 1965 (KC), Murashige-Skoog, 1962 (MS), Robert Ernst, 1979 (RE)
- Dịch chiết hữu cơ từ các loại củ quả: khoai tây, cà rốt, táo, chuối chín
- Các yếu tố ảnh hưởng ñến nhân nhanh in vitro: saccaroza, than hoạt tính,
- Hệ thống bioreactor do hãng Sartorius sản xuất, mã hiệu máy Biostat
Bplus có thể tích tối ña 10 lít.
- Các giá thể: Bột dừa, xơ dừa, than củi, gỗ nhãn, dương xỉ.
- Các chế phẩm dinh dưỡng: Antonic, Yogen, Komix, Growmore, ðầu trâu
4.2. Phạm vi nghiên cứu của ñề tài
Các nghiên cứu ñược tiến hành tại Viện Sinh học Nông nghiệp - Trường ðại
học Nông nghiệp Hà Nội; Học viện Hậu Cần - Ngọc Thụy - Long Biên - Hà Nội.
5. ðóng góp mới của luận án
- ðã xây dựng ñược quy trình nhân giống in vitro cho hai loài lan bản ñịa
D.nobile Lindl. và D.chrysanthum Lindl. có nguy cơ tuyệt chủng không sử dụng chất
ñiều tiết sinh trưởng.
- ðã sử dụng thành công kỹ thuật cải tiến trong nhân nhanh hai loài lan bản
ñịa bằng kỹ thuật thoáng khí và biorector ñạt hệ số nhân cao.

3


D.chrysanthum thì chuyên trị khô miệng, phổi kết hạch; dạ dày thiếu vị chua; di
tinh, ra mồ hôi trộm, thắt lưng ñau mỏi.
1.1.5 Giá trị sử dụng và thực trạng khai thác một số loài lan Hoàng Thảo bản ñịa
tại miền Bắc Việt Nam.
Hai loài lan D.nobile, D.chrysanthum vừa có giá trị thẩm mỹ và ñặc biệt là giá
trị làm dược liệu cao nên chúng ñều ở mức ñộ nguy cấp tuyệt chủng trong tự
nhiên. Các loài lan rừng Dendrobium nobile Lindl., Dendrobium chrysanthum
Lindl. rất cần ñược ưu tiên nghiên cứu nhân giống, nuôi trồng nhằm bảo tồn
phát triển ñược nguồn tài nguyên thực vật quý giá của Việt Nam.
1.2 Cơ sở khoa học của các kỹ thuật nuôi cấy nhân giống trong ñề tài
1.2.1 Kỹ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật
Phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô, tế bào (nhân giống in vitro) dựa
trên cơ sở về tính toàn năng và khả năng phân hóa, phản phân hóa của tế bào, mô

4

thực vật. ðây là lĩnh vực mà nuôi cấy mô và tế bào thực vật ñã thực sự mang lại
hiệu quả kinh tế to lớn (Vũ Văn Vụ và cs, 2001) [57], (Hoàng Minh Tấn và cs,
2006) [37]. Ngoài ra, nhân giống vô tính in vitro cho phép nhân giống cây trồng
ở quy mô công nghiệp (kể cả trên các ñối tượng khó nhân bằng phương pháp
thông thường), hệ số nhân cao và cho ra các cá thể sạch bệnh, hoàn toàn ñồng
nhất về mặt di truyền. ðó là ưu việt mà các phương pháp nhân giống khác
không có ñược (Razan MK ., 1994) [89], (Hoàng Thị Lan Hương và cs, 2004)
[18], (Võ Hà Giang, Ngô Xuân Bình, 2010) [8].
1.2.2 Nhân giống bằng bioreactor
Nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô truyền thống, thường ñược sử dụng
trên môi trường có agar (thạch) phải trải qua nhiều công ñoạn nuôi cấy, tỷ lệ
mẫu nhiễm tăng, nhân công lao ñộng nhiều qua các khâu trong quá trình nhân
giống, do ñó cần có một hệ thống nhân giống hiện ñại bioreactor có thể nâng tần
suất nhân giống lên quy mô công nghiệp là cần thiết ñể giảm thấp chi phí sản


mô cây Dendrobium “Sonia”, các nhà nghiên cứu tại ðại học Mauritius kết luận
môi trường MS có hiệu quả nhất trong nhân nhanh PLB (Puchoa, 2004).
1.3.3 Ảnh hưởng của nguồn các bon hữu cơ
Ảnh hưởng của nguồn các bon hữu cơ ñến nuôi cấy in vitro cây lan ñã ñược
nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu. Roslina Jawan và cộng sự ñã chứng minh
ñược chồi Vanda dearei sinh trưởng tốt hơn trên môi trường nuôi cấy bổ sung
ñường saccharose so với ñường glucose và fructose. ðồng thời trong 3 nồng ñộ
ñường saccharose nghiên cứu (1, 2, 4%) thì nồng ñộ 2% là thích hợp nhất
(Roslina Jawan et al., 2010) [91]. Nồng ñộ ñường 2% cũng ñược cho là phù hợp
nhất trong nuôi cấy lan Cymbidium (Mamoru, 1980) [81]. Với cây Cattleya
granulosa thì nồng ñộ saccaroza thích hợp cho sự sinh trưởng của chồi là 1,5%
và cho sự tạo rễ là 3% (Pinto et al., 2010) [87].
1.3.4 Ảnh hưởng của các hỗn hợp chất hữu cơ tự nhiên
Ở nước ta, việc sử dụng các hỗn hợp chất hữu cơ tự nhiên trong nuôi cấy in
vitro cây lan ñã ñược nhiều tác giả thực hiện. Nguyễn Quang Thạch và cộng sự
(2003) [39] ñã khẳng ñịnh các hợp chất BA, Kinetin không có tác ñộng tích cực
trong giai ñoạn nhân nhanh thể PLB và chồi của lan Hồ ñiệp. Mặt khác ñể tăng
hệ số nhân và chất lượng của chồi in vitro nên sử dụng các loại dịch nghiền của
khoai tây, cà rốt, chuối… Khi nuôi cấy in vitro D.pirimulinum, Nguyễn Thị
Trang (2009) cũng chứng minh ñược môi trường MS không chứa chất ñiều tiết
sinh trưởng là thích hợp ñể hình thành PLB từ hạt và ñể nhân nhanh PLB thì
môi trường (MS+10% nước dừa+1g pepton+30g khoai tây+30g cà rốt)/l là hiệu
quả nhất. Hiệu quả của các hỗn hợp chất hữu cơ tự nhiên cũng ñược khẳng ñịnh
trong nuôi cấy in vitro cây Paphiopedilum hangianum Gurss (Nguyễn Quang
Thạch và CS., 2010) [43].
1.3.5 Ảnh hưởng của phương thức nuôi cấy
Với cây lan nói chung, một số tác giả ñã bước ñầu nghiên cứu nhân giống in
vitro trong bioreactor, nhằm nâng cao hệ số nhân, nâng cao chất lượng và giảm
giá thành. Tuy nhiên, việc nghiên cứu và ứng dụng hệ thống bioreator ñể nhân

2006) [85]. Koravisd Nathalang (Thái Lan) [86] ñã gieo hạt của quả D.chrysanthum
trên môi trường KC bổ sung 15% nước dừa và 1g/l than hoạt tính. Các chồi mầm sau
8 tháng ñã ñược chuyển sang môi trường KC+15% nước dừa và bổ sung thêm
αNAA (0, 0.5, 1, 1.5, 2 và 2.5 ppm), các axít amin (200 ppm của glutamine, alanine
và methionine) và saccarose (20, 40 và 60 g/l).
1.4 Các nghiên cứu về nuôi trồng lan Hoàng thảo
1.4.1 Các ñiều kiện cơ bản ñể trồng lan Dendrobium
Chi Dendrobium gồm nhiều loài thích nghi với các ñiều kiện sinh thái khác
nhau. Yêu cầu nhiệt ñộ có thể chia Dendrobium làm 2 nhóm chính: nhóm ưa
lạnh và nhóm ưa nóng (Dương ðức Huyến, 2007) [17]. Dendrobium cũng như
ña số các giống lan khác chỉ phát triển tốt trong ñiều kiện không khí ẩm nhưng
thoáng khí, vào ban ngày cây cần ñộ ẩm khoảng 40-60%, ban ñêm ñộ ẩm thích
hợp từ 60-90% thì cây sẽ phát triển tốt hơn (
.) [110]. Thời
gian chiếu sáng trong ngày cũng là ñiều kiện quyết ñịnh sự ra hoa của một số
loài chịu ảnh hưởng bởi quang kỳ, ví dụ: lan Giả Hạc, Long Tu, Kim ðiệp chỉ ra
hoa với ñiều kiện ánh sáng có thời gian chiếu ít hơn 10 giờ trong ngày.
(
.) [110]. Giá thể của Dendrobium cần ñảm bảo chậu trồng
phải thoáng, không úng nước. Ngoài ra, Dinh dưỡng ñóng vai trò rất quan trọng ñối
với cây lan, nhất là ñối với việc trồng qui mô lớn nhằm khai thác hàng hoá. Trong
cả chu kỳ sống của cây lan cần 13 chất dinh dưỡng khoáng, thuộc các nhóm ña,
trung và vi lượng. Dinh dưỡng ña lượng là ðạm (N), Lân (P) và Kali (K). Dinh
dưỡng trung lượng bao gồm Lưu huỳnh (S), Magiê (Mg) và Canxi (Ca). Dinh
dưỡng vi lượng là Sắt (Fe), Kẽm (Zn), ðồng (Cu), Mangan (Mn), Bo (B),
Molypñen (Mo) và Clo (Cl) (Nguyễn Hạc Thủy, 2000) [48] và (Trần Văn Huân,
2002) [15]. Khi nuôi trồng cây tại vườn ươm và vườn sản xuất, cây lan thường
gặp một số sâu bệnh phổ biến do nấm, vi khuẩn, sâu, chúng

ta phải thực hiện chế

[104] ñã sử dụng dung dịch Chitosan với nồng ñộ từ 200 ñến 600mg/l ñể làm
tăng khối lượng cành hoa, kích thước cánh hoa của lan Dendrobium “Sonia”.

CHƯƠNG 2
VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Vật liệu nghiên cứu
Hai loài lan bản ñịa D.nobile và D.chrysanthum thuộc chi Hoàng thảo
(Dendrobium) ñược thu thập tại: Hòa Bình.
+ Chồi mầm, quả, cây thu thập của hai loài lan nghiên cứu D.nobile và
D.chrysanthum
+ Các nền môi trường nuôi cấy mô cơ bản theo Vacin and Went, 1949 (VW);
KnudsonC, 1965 (KC), Murashige-Skoog, 1962 (MS), Robert Ernst, 1979 (RE)
+ Dịch chiết hữu cơ từ các loại củ quả: khoai tây, cà rốt, táo, chuối chín
+ Các yếu tố ảnh hưởng ñến nhân nhanh in vitro: saccaroza, than hoạt tính.
+ Hệ thống bioreactor do hãng Sartorius sản xuất, mã hiệu máy Biostat
Bplus, bình nuôi có thể tích tối ña 10 lít.

8

+ Các giá thể: Bột dừa, xơ dừa, than củi, gỗ nhãn, dương xỉ.
+ Các chế phẩm dinh dưỡng: Antonic, Yogen, Komix, Growmore, ðầu trâu.
2.2 Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu lựa chọn phương pháp khử trùng và cơ quan nuôi cấy ñể tạo nguồn
vật liệu in vitro với hai loài lan bản ñịa nghiên cứu D.nobile và D.chrysanthum
Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố ñến khả năng nhân nhanh, tạo cây
hoàn chỉnh in vitro ñối với hai loài lan bản ñịa D.nobile và D.chrysanthum theo
phương pháp nuôi cấy mô truyền thống.
Nghiên cứu khả năng nhân nhanh in vitro ñối với hai loài lan bản ñịa nghiên
cứu theo phương pháp nuôi cấy cải tiến.
Nghiên cứu ảnh hưởng thời vụ ra cây, giá thể, chế phẩm dinh dưỡng ñến tỷ

năng nhân nhanh cụm chồi của hai loài lan nghiên cứu D.nobile và
D.chrysanthum
Thí nghiệm 10: Ảnh hưởng của hàm lượng chuối chín ñến khả năng nhân
nhanh cụm chồi trên hai loài lan bản ñịa D.nobile và D.chrysanthum
Thí nghiệm 11: Ảnh hưởng của nền môi trường cơ bản ñến sinh trưởng của
chồi lan với hai loài lan bản ñịa D.nobile và D.chrysanthum
Thí nghiệm 12: Nghiên cứu ảnh hưởng của cường ñộ ánh sáng tới khả năng

9

sinh trưởng của chồi lan D.nobile và D.chrysanthum

Thí nghiệm 13: Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính (THT) ñến khả
năng tạo rễ của chồi hai loài lan bản ñịa D.nobile và D.chrysanthum.
Thí nghiệm 14: Nghiên cứu ảnh hưởng của phương thức nuôi cấy khi sử dụng nút
bông ñến khả năng nhân nhanh thể sinh chồi (protocorm) ñối với loài lan rừng
D.nobile
Thí nghiệm 15: Nghiên cứu ảnh hưởng của phương thức nuôi cấy khi sử dụng nút
màng lọc thoáng khí ñến khả năng nhân nhanh thể sinh chồi (protocorm) ñối với loài
lan rừng D.nobile
Thí nghiệm 16: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng saccaroza ñến quá
trình nhân nhanh thể sinh chồi (protocorm) trong nuôi cấy ñặc có màng lọc
thoáng khí ñối với loài lan rừng D.nobile
Thí nghiệm 17: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng saccaroza ñến quá trình
nhân nhanh thể sinh chồi (protocorm) trong nuôi cấy lỏng lắc có màng lọc thoáng khí
ñối với loài lan rừng D.nobile
Thí nghiệm 18: Nghiên cứu ảnh hưởng của các phương thức nuôi cấy ñến khả
năng nhân nhanh cụm chồi ñối với loài lan rừng D.chrysanthum
Các thí nghiệm từ thí nghiệm 1 ñến thí nghiệm 18 ñược bố trí theo phương
pháp nuôi cấy mô tiêu chuẩn hiện hành.

x 100

10

- ðường kính cụm thể sinh chồi (protocorm) (mm) = Sử dụng thước ño
ñường chéo, lấy giá trị trung bình.
- Hệ số nhân thể sinh chồi (protocorm) (lần): Sau 8 tuần nuôi cấy
- Hệ số nhân chồi (lần): Sau 8 tuần nuôi cấy
Tổng số chồi sau 8 tuần nuôi cấy
HSN =
Tổng số chồi ban ñầu
- Chiều cao cây(cm) là khoảng cách từ gốc rễ ñến ñầu mút lá
Tổng số lá trên các cây thí nghiệm
Số lá TB/cây =

Tổng số cây thí nghiệm Tổng số rễ trên các cây thí nghiệm
Số rễ TB/cây =
Tổng số cây thí nghiệm
2.3.2.2 Các chỉ tiêu theo dõi trong vườn ươm, vườn sản xuất
Tổng số cây sống
- Tỷ lệ cây sống % =
Tổng số cây ñưa ra trồng ngoài vườn ươm,
vườn sản xuất
x 100
- Chiều cao cây (cm) = Từ phần gốc rễ ñến ñầu mút lá.
Tổng số lá ñếm ñược
- Số lá TB/cây =

CHƯƠNG III
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Xác ñịnh lựa chọn phương pháp khử trùng, cơ quan nuôi cấy ñể tạo
nguồn vật liệu in vitro với hai loài lan D.nobile và D. chrysanthum
3.1.1. Xác ñịnh hiệu quả khử trùng ñối với chồi mầm trong H
2
O
2
2% và HgCl
2
0,1%
Môi trường nuôi cấy = (MS + 100ml nước dừa + 10g sacaroza + 6g
agar)/lít, Dn: D.nobile; Dc: D.chrysanthum
Công thức 3 (sử dụng HgCl
2
0,1% kép trong 3 phút, tách bỏ bớt phần lá
bao bên ngoài và ngâm tiếp trong HgCl
2
0,1% trong 1 phút) ñã cho tỷ lệ mẫu
sống cao nhất là 8,89% ñối với loài lan rừng D.nobile; 3,48% ñối với loài lan
rừng D.chrysanthum (bảng 3.1)
Mẫu chồi mầm không có hiệu quả cao trong việc tạo nguồn mẫu sạch in
vitro với hai loài lan nghiên cứu.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của phương pháp khử trùng
ñến khả năng sống của chồi mầm lan D.nobile và D. chrysanthum
(Sau 6 tuần, ðơn vị tính: %)
Tỷ lệ mẫu chết

(%)
Tỷ lệ mẫu

2
0,1% kép, lần 1 trong 3
phút và lần 2 trong 1 phút
37,78

40,02 53,33

56,50 8,89 3,48
3.1.2. Xác ñịnh phương pháp khử trùng ñối với quả lan
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của phương pháp khử trùng ñến tỷ lệ mẫu sống
và nẩy mầm của quả 02 loài lan D.nobile và D.chrysanthum
(Sau 6 tuần, ðơn vị tính:%)
Tỷ lệ mẫu sống
và phát sinh
protocorm (%)
Tỷ lệ mẫu sống

và phát sinh
chồi (%)
Công thức thí nghiệm
Dn Dc Dn Dc
Nhúng quả trong cồn 96
0
, ñốt trên ngọc lửa
ñèn cồn
97 0 3 100
Nhúng quả bằng cồn 96
0
, ngâm trong H
2

nhanh thể sinh chồi (protocorm) của loài lan D.nobile (Sau 8 tuần nuôi cấy)
ðường kính cụm
(cm)
Số lượng
protocorm/ cụm
Chỉ tiêu CT
Ngày
cấy mẫu

Sau cấy
8 tuần
Ngày
cấy mẫu
Sau cấy
8 tuần
Hệ số
nhân
(lần)

Số chồi
phát
sinh
Tỷ lệ
tạo chồi
(%)
VW 0,5 1,85 50 176,32 3,53 22 11,1
KC 0,5 2,26 50 210,06 4,20 18 7,9

CV (%) 4,0 4,6 4,1 4,7
Ghi chú: Các công thức ñược bổ sung (100ml nước dừa + 10g saccaroza + 6g agar)/
lít; Dn: D.nobile;Dc: D.chrysanthum
3.2.2. Ảnh hưởng của hàm lượng sacaroza ñến khả năng nhân nhanh của loài lan
D.nobile và loài D.chrysanthum
Bổ sung 10 gram sacaroza/lít hơn hẳn các công thức thí nghiệm khác về
các chỉ tiêu: ñường kính cụm protocorm, số lượng protocorm trung bình/cụm và
hệ số nhân protocorm /8 tuần ở mức ñộ sai số tin cậy 95%, ñạt hệ số nhân là

13

4,22 lần/8 tuần (bảng 3.5).
Các công thức thí nghiệm có hàm lượng saccaroza ñược bổ sung vượt quá 30g
/lít thì số chồi/cụm lại giảm dần, ñiều này thể hiện trên cả 02 loài lan rừng.
Ở ñộ tin cậy 95%, với loài D.nobile công thức CT3 (bổ sung 30g saccaroza/lít
môi trường) cho số lượng chồi TB/cụm, hệ số nhân chồi nhiều nhất, ñạt lần lượt
48,42 chồi và 3,23 lần sau 8 tuần nuôi cấy.
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của hàm lượng saccaroza ñến khả năng nhân nhanh
protocorm của loài lan rừng D.nobile (Sau 8 tuần nuôi cấy)
ðường kính cụm
(cm)
Số lượng
protocorm/ cụm
Chỉ tiêu
CT
Ngày cấy
mẫu


0,5 1,02 50 108,32 2,17 7 6,0
LSD
0.05
0,3 13,8 0,3
CV (%) 2,8 5,0 5,0
Ghi chú: Các công thức ñược bổ sung (100ml nước dừa + 10g saccaroza + 6g agar)/ lít
Với loài D.chrysanthum công thức CT2 (bổ sung 20g saccaroza/lít môi trường)
cho số lượng chồi TB/cụm, hệ số nhân chồi nhiều nhất, ñạt lần lượt 46,63 chồi và
3,11 lần sau 8 tuần nuôi cấy (bảng 3.6)
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của hàm lượng saccaroza ñến khả năng nhân nhanh
cụm chồi 02 loài lan D.nobile và D.chrysanthum (Sau 8 tuần nuôi cấy)
Số chồi TB/cụm
Ngày cấy mẫu Sau cấy 8 tuần
Hệ số nhân chồi
(lần)
Chỉ tiêuCT
Dn Dc Dn Dc Dn Dc
ðC+10g 15,00 15,00
43,96 43,02 2,93 2,87
ðC+20g saccaroza 15,00 15,00
44,57 46,63 2,97 3,11
ðC+30g saccaroza 15,00 15,00
48,42 43,30 3,23 2,89
ðC+40g saccaroza 15,00 15,00
43,43 42,43 2,89 2,83
ðC+50g saccaroza 15,00 15,00

nhân nhanh protocorm của loài lan rừng D.nobile (Sau 8 tuần nuôi cấy)
ðường kính
cụm (cm)
Số lượng
protocorm/ cụm

Chỉ tiêu CT
Ngày
cấy
mẫu
Sau
cấy 8
tuần
Ngày
cấy
mẫu
Sau
cấy 8
tuần
Hệ số
nhân
(lần)
Số
chồi
phát
sinh
T


2,7 2,7 Ghi chú: Các công thức ñược bổ sung (Nền môi trường KC + 100ml nước dừa + 10g
saccaroza + 6g agar)/ lít.
Bổ sung 60g khoai tây/lít là công thức tốt nhất về các chỉ tiêu sinh trưởng
protocorm, cụ thể hệ số nhân protocorm/sau 8 tuần ñạt 4,47 ở mức tin cậy 95%
(kết quả tại bảng 3.8).
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của hàm lượng khoai tây ñến khả năng nhân nhanh
protocorm loài lan rừng D.nobile (Sau 8 tuần nuôi cấy)
ðường kính cụm
(cm)
Số lượng
protocorm/ cụm
Chỉ tiêu CT
Ngày c
ấy
mẫu
Sau cấy
8 tuần
Ngày
cấy mẫu

Sau cấy
8 tuần
Hệ số

ñến khả năng nhân nhanh cụm chồi 02 loài lan D.nobile và D.chrysanthum
(Sau 8 tuần nuôi cấy)
Số chồi TB/cụm
Ngày cấy mẫu Sau cấy 8 tuần
Hệ số nhân chồi
(lần)
Chỉ tiêuCT
Dn Dc Dn Dc Dn Dc
ðC 15,00 15,00 43,86

43,22

2,92

2,88
ðC+60g Khoai tây 15,00 15,00 45,31

45,13

3,02

3,01
ðC+ 60g Cà rốt 15,00 15,00 44,47

43,77

2,96

ðC+60gKhoai tây+60g Chuối chín 15,00 15,00 44,88

37,48

3,00

2,50
ðC+ 60g Cà rốt+60g Táo 15,00 15,00 43,97

35,97

2,93

2,40
ðC+ 60g Cà rốt +60g Chuối chín 15,00 15,00 43,53

35,13

2,90

2,34
ðC+ 60g Táo +60g Chuối chín 15,00 15,00 43,21

35,11

2,88

2,34
LSD
0,05


CT
Dn Dc Dn Dc Dn Dc
ðC 15,00 15,00 43,66 43,32 2,91 2,89
ðC+ 30g chuối chín 15,00 15,00 45,90 45,87 3,06 3,06
ðC+ 60g chuối chín 15,00 15,00 49,36 47,93 3,29 3,20
ðC+90g chuối chín 15,00 15,00 45,26 44,46 3,02 2,96
ðC+120g chuối chín 15,00 15,00 44,42 43,83 2,96 2,92
ðC+150g chuối chín 15,00 15,00 44,63 43,85 2,98 2,92
ðC+180g chuối chín 15,00 15,00 43,66 42,95 2,91 2,86
LSD
0,05
1,90

1,87

0,13

0,12
CV (%) 2,40

2,60

2,4

2,5
Ghi chú: Dn: Dendrobium nobile Lindl., Dc: Dendrobium chrysanthum Lindl.;ðC =
(Nền môi trường MS + 100ml nước dừa + 30g saccaroza + 6g agar)/ lít / loài Dn; ðC
= (Nền môi trường MS + 100ml nước dừa + 20g saccaroza + 6g agar)/ lít/ loài Dc


2,6
3,8
3,4
5,3 4,3
Ghi chú: Dn: D.nobile; Dc: D.chrysanthum; các công thức ñều ñược bổ sung (10g saccaroza
+ 6g agar)/lít
Kết quả tại bảng 3.11cho thấy: ñối với 02 loài lan thí nghiệm thì CT4 sử
dụng nền khoáng RE cho khả năng phát triển về chiều cao cây, số lá, số rễ là cao
nhất ñạt chiều cao 4,88 cm/cây; 4,44 lá/cây; 3,69 rễ/cây với D.nobile và với
D.chrysanthum là 5,28 cm/cây; 4,34 lá/cây; 4,89 rễ/cây.
3.2.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của cường ñộ ánh sáng tới khả năng sinh
trưởng của chồi lan rừng D.nobile và D.chrysanthum
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của cường ñộ chiếu sáng ñến sinh trưởng chồi
của 02 loài lan rừng D.nobile và D. chrysanthum
(Sau 30 ngày nuôi cấy)
Chiều cao
TB/cây (cm)
Số lá TB /cây
(chiếc)
Số rễ TB/cây
(chiếc)
Chỉ tiêuCông thức
Dn Dc Dn Dc Dn Dc
ðC + 1 ñèn chiếu sáng = 800lux
3,87 3,97 3,27 3,36 3,09 3,59
ðC + 2 ñèn chiếu sáng = 1300lux
4,18 5,23 3,44 4,49 3,24 5,26

TB/cây
(chiếc)
Chiều dài
rễ TB
(cm)
Hình thái rễ
Sau 15 ngày

Sau 30 ngày Sau 30 ngày

Sau 30 ngày

Sau 30 ngày
Chỉ
tiêuCông
thức
Dn Dc Dn Dc Dn Dc Dn Dc Dn Dc
ðC
8,89 6,67 80,00 83,33 3,02 3,39 1,27 1,37
Vừa,
trắng ngà
Vừa,
trắng ngà
ðC+0,5g
THT
66,67 15,56 100,00 100,00 3,46 3,44 2,12 2,20
Mập, tròn,

lông tơ
LSD
0,05

0,25

0,22

0,26

0,2CV %

3,9

3,5

5,8

5,1
LSD
0,05
7,01 1,40 0,19
CV % 5,10 2,30 4,90
Ghi chú: ðC = (Nền môi trường KC + 100ml nước dừa + 10g saccaroza + 60g khoai tây)/lít.
Phương thức nuôi cấy có ảnh hưởng ñến các chỉ tiêu: số lượng, khối lượng, hệ
số nhân nhanh protocorm của loài lan rừng D.nobile. Các công thức sử dụng nút

18

bông cho các chỉ tiêu tốt nhất, cụ thể là số lượng protocorm/cụm là 105 protocorm,
khối lượng protocorm ñạt 45mg và hệ số nhân ñạt 2,10 lần/3 tuần. ðồng thời nuôi
cấy trong môi trường lỏng lắc sẽ tiết kiệm ñược thời gian nuôi cấy, giảm lượng môi
trường nuôi cấy, hoàn toàn không sử dụng agar (bảng 3.14).
3.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của phương thức nuôi cấy khi sử dụng nút màng
thoáng khí ñến khả năng nhân nhanh protocorm ñối với loài lan rừng D.nobile
Bảng 3.15. Ảnh hưởng của phương thức nuôi cấy ñến khả năng nhân nhanh
protocorm ñối với loài lan rừng D.nobile
(Sau 3 tuần nuôi cấy)
Màng lọc thoáng khí Chỉ tiêuCông thức
Số lượng thể
sinh chồi/cụm
ban ñầu
Số lượng TB
thể sinh chồi/
cụm
Khối lượng TB

Bảng 3.16. Ảnh hưởng của hàm lượng ñường saccaroza ñến khả năng
nhân nhanh thể sinh chồi (protocorm) của loài lan D.nobile
trong nuôi cấy ñặc, màng lọc thoáng khí
(Sau 8 tuần nuôi cấy)
Môi trường ñặc, màng lọc thoáng khí Chỉ tiêu
Công thức
Số lượng thể
sinh chồi/cụm
ban ñầu
Số lượng TB
thể sinh chồi/
cụm
Khối lượng TB
thể sinh chồi
(mg)
Hệ số nhân
(lần)
CT1: ðC + 0g saccaroza 50,0 52,0 21,5 1,04
CT2: ðC + 2,5g saccaroza 50,0 165,5 22,4 3,31
CT3: ðC + 5,0g saccaroza 50,0 201,7 23,0 4,04
CT4: ðC + 7,5g saccaroza 50,0 318,3 22,8 6,37
CT5: ðC + 10g saccaroza 50,0 96,7 22,0 1,93
LSD
0,05
5,11 0,14
CV % 2,3 2,3
Ghi chú: ðC = (Nền môi trường KC + 100ml nước dừa + 60g khoai tây + 6g agar)/lít.

(mg)
Hệ số
nhân
(lần)
CT1: ðC + 0g saccaroza 50,0
108,6 40,8 2,17
CT2: ðC + 2,5g saccaroza

50,0
112,8 38,8 2,26
CT3: ðC + 5,0g saccaroza

50,0
136,3 42,6 2,73
CT4: ðC + 7,5g saccaroza

50,0
204,7 43,7 4,09
CT5: ðC + 10g saccaroza

50,0
68,5 39,1 1,37
LSD
0,05

13,73 0,28
CV %
4,5 4,0
Ghi chú: ðC = (Nền môi trường KC + 100ml nước dừa + 60g khoai tây)/lít.
3.3.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của các phương thức nuôi cấy ñến khả năng

3,6 3,5
Ghi chú: ðC = (Môi trường MS + 100ml nước dừa + 60g chuối chín + 20g saccaroza)/lít.
Sau 4 tuần nuôi cấy chúng tôi nhận thấy: Công thức 4 sử dụng hệ thống
bioreactor nhân nhanh cụm chồi là công thức cho số lượng chồi TB/cụm cao

20

nhất ñạt 48 chồi. Mức ñộ sai khác tin cậy 95%, ñể ñánh giá ñến chỉ tiêu hệ số
nhân chồi/4 tuần, công thức 4 và công thức 3 ở cùng mức tốt hơn hai công thức
1, công thức 2 ñạt 3,2 lần/4 tuần (bảng 3.18).
3.4. ðặc ñiểm sinh trưởng của cây con in vitro hai loài lan rừng D.nobile và
D.chrysanthum tại vườn ươm, vườn sản xuất
3.4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời vụ ra cây ñến tỷ lệ sống và chất lượng cây
con ngoài vườn ươm của 02 loài lan rừng D.nobile và D.chrysanthum
Bảng 3.19. Ảnh hưởng của thời vụ trồng ñến tỷ lệ sống và hình thái cây con
in vitro ngoài vườn ươm của 02 loài lan rừng D.nobile và D.chrysanthum
(Sau 01 tháng nuôi trồng)
Tỷ lệ sống (%) Hình thái cây con in vitro
CT
Dn Dc Dn Dc
Vụ xuân, 8/2/2011 89,60 92,25 Cây xanh ñậm, ra rễ mới

Cây xanh ñậm, ra rễ mới
Vụ hè, 2/5/2010 62,22 62,22 Cây xanh, ra rễ mới Cây xanh, ra rễ mới
Vụ thu, 3/9/2010 79,30 79,30 Cây xanh, ra rễ mới Cây xanh, ra rễ mới
Ghi chú: Các công thức ñều ñược trồng trên giá thể bột xơ dừa
Công thức 1 là trồng cây vào mùa xuân cho tỷ lệ cây sống cao nhất ñạt
89,60% ñối với loài D.nobile. và 92,25 ñối với loài D.chrysanthum ñồng thời
cho chất lượng cây con tốt (bảng 3.19).
3.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể ñến tỷ lệ sống và chất lượng cây con

3.4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của các chế phẩm dinh dưỡng ñến chiều cao, số lá
cây in vitro trên 02 loài lan D.nobile và D.chrysanthum ngoài vườn ươm
Với chỉ tiêu chiều cao cây, các loại chế phẩm dinh dưỡng ñều có ảnh
hưởng tốt ñến ñộng thái tăng chiều cao cây, ở mức ñộ sai khác 95% chế phẩm
dinh dưỡng tốt nhất là Komix, cây sử dụng ñạt chiều cao trung bình là 7,96cm

21

ñối với D. nobil Lindl. và 8,64cm ñối với D.chrysanthum Lindl. Với chỉ tiêu số
lá: Khi phun chế phẩm dinh dưỡng Komix cũng cho số lá trung bình cao nhất là
7,2 lá ñối với D.nobile và 7,6 lá ñối với D.chrysanthum so với các công thức
khác có sự sai khác về mặt số liệu số học. Giai ñoạn vườn ươm của cây lan nuôi
cấy mô của loài D.nobile và D.chrysanthum phun chế phẩm dinh dưỡng qua lá
Komix là tối ưu nhất (bảng 3.21).
Bảng 3.21. Ảnh hưởng của chế phẩm dinh dưỡng
ñến ñộng thái tăng chiều cao cây và số lá trên cây in vitro của 02 loài lan
rừng D.nobile và D.chrysanthum ngoài vườn ươm
Chiều cao cây (cm) Số lá (chiếc) Chỉ tiêu

Công thức
Dn Dc Dn Dc
Phun nước lã
6,8 6,8 5,6 5,5
Antonic
7,4 7,8 7,0 7,2
Yogen
7,0 7,6 7,0 7,4
Komix
7,96 8,64 7,2 7,6
Growmore

Số chồi TB/ chậu

CT1: Than củi
39,82 9,2 25,91
CT2: Xơ dừa
26,60 8,0 17,96
CT3: Gỗ nhãn
29,36 8,2 21,67
CT4: Dương xỉ
28,41 8,1 15,41
LSD
0,05

2,16 0,52 1,58
CV%
3,7 3,3 4,1 22

Bảng 3.23. Ảnh hưởng của giá thể ñến ñộng thái tăng chiều dài cành,
ñường kính thân và số chồi của loài lan rừng thu thập D.chrysanthum
(Sau 3 tháng theo dõi)
Chỉ tiêu

Công thức
Chiều dài cành
(cm)
ðường kính
(mm)

Antonik
46,28 11,12 13,2 4,25
Yogen
39,35 10,21 12,5 6,26
Growmore
41,42 10,15 11,9 3,78
ðầu Trâu
36,59 10,09 10,3 2,05
LSD
0,05

0,54 0,33 0,54 0,36
CV%
2,70 1,70 2,40 4,70
Chỉ tiêu chiều dài cành ở mức ñộ sai khác tin cậy 95%, chúng tôi thấy các
cây lan sử dụng Antonik (CT1) có chiều dài cành lớn nhất ñạt 46,28cm. Về chỉ
tiêu số lá TB/cây: ở ñộ sai khác tin cậy 95%, sau 3 tháng theo dõi số lá TB/cây
khi phun Antonik (CT1) ñạt nhiều nhất 13,2 lá. Số chồi/cây: Phun Yogen ñạt
6,26 chồi mới/ 90 ngày nuôi trồng. Như vậy, các chế phẩm dinh dưỡng có ảnh
hưởng ñến khả năng sinh trưởng thân lá của loài lan rừng D.nobile, có chế phẩm
dinh dưỡng Antonik là thích hợp nhất (bảng 3.24).
Bảng 3.25. Ảnh hưởng của các chế phẩm dinh dưỡng qua lá ñến tỷ lệ ra hoa
và kích thước hoa của loài lan rừng thu thập D.nobile
Chỉ tiêu CT
Tỷ lệ
cây ra
hoa


0,48 0,42
CV%
2,2 2,8 23

Trong 4 chế phẩm dinh dưỡng ñược sử dụng trong thí nghiệm thì Yogen
(CT2) có hiệu quả cao nhất về tỷ lệ cây ra hoa, số hoa trung bình/cành, ñường
kính hoa so với các công thức sử dụng các loại chế phẩm dinh dưỡng khác, ở ñộ
sai khác tin cậy 95%. Sử dụng phun dinh dưỡng qua lá Yogen (CT2) có hiệu quả
nhất ñến số lượng TB hoa/ cành và ñường kính hoa (bảng 3.25).
Cho chúng tôi thấy: Sau 90 ngày chỉ tiêu số lá TB/cây, phun dinh dưỡng
qua lá Antonik (CT1) hơn hẳn các công thức khác ñạt 17,36 lá/ cây ở mức ñộ sai
khác tin cậy 95%. Với chỉ tiêu số chồi trung bình/ cây khi phun dinh dưỡng qua lá
Antonik cũng ñạt cao nhất 3,6 chồi/ cây/ 90 ngày (bảng 3.26).
Bảng 3.26. Ảnh hưởng của các loại chế phẩm dinh dưỡng
ñến ñộng thái tăng chiều cao, ñường kính thân, số lá và số chồi TB/cây
của loài lan rừng thu thập D.chrysanthum
(Sau 3 tháng nuôi trồng)
Chỉ tiêu

Công thức
Chiều dài
cành (cm)
ðường kính
thân (mm)
Số lá TB/cây Số chồi TB/cây


lan D.nobile có 97% hạt phát sinh thể sinh chồi (protocorm), 3% nẩy cụm chồi
còn với loài lan D.chrysanthum 100% hạt nẩy mầm tạo chồi, cụm chồi hoàn
toàn không hình thành thể sinh chồi (protocorm)

1.2 Phương pháp nhân nhanh bằng nuôi cấy mô kinh ñiển:
Môi trường nhân nhanh protocorm tốt nhất cho loài D.nobile là: môi
trường (KC + 100ml nước dừa + 10g saccaroza + 60g khoai tây)/lít môi trường,
ñạt hệ số nhân là 4,47 lần/sau 8 tuần nuôi cấy.
Môi trường nhân nhanh cụm chồi tốt nhất cho loài D.nobile là: môi trường
(MS + 100ml nước dừa + 30g sacchoroza + 60g chuối chín)/lít môi trường, ñạt hệ số
nhân chồi là 3,30 lần/sau 8 tuần nuôi cấy. Với loài D.chrysanthum môi trường nhân
nhanh cụm chồi tốt nhất là: môi trường (MS + 100ml nước dừa + 20g saccaroza +
60g chuối chín)/lít môi trường, ñạt hệ số nhân là 3,19 lần/ sau 8 tuần nuôi cấy.