BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI










……… VŨ NGỌC LAN NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO
KHÔNG SỬ DỤNG CHẤT ðIỀU TIẾT SINH TRƯỞNG
VÀ MỘT SỐ BIỆN PHÁP KỸ THUẬT NUÔI TRỒNG
HAI LOÀI LAN BẢN ðỊA (DENDROBIUM NOBILE LINDL.,
DENDROBIUM CHRYSANTHUM LINDL.) TẠI HÀ NỘI

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành : Trồng trọt
Mã số : 62 62 01 01

Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. NGUYỄN THỊ LÝ ANH
2. TS. NGUYỄN VĂN GIANG


ii

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến
PGS.TS. Nguyễn Thị Lý Anh và TS. Nguyễn Văn Giang, là thầy cô đã tận
tình dìu dắt, hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô giáo cùng toàn thể đồng nghiệp
Viện Sinh học Nông nghiệp, Bộ môn Sinh lý Thực Vật, Khoa Nông học,
Khoa Công nghệ thực phẩm, Khoa Công nghệ Sinh học, Viện Đào tạo Sau đại
học, Phòng Khoa học và Hợp tác Quốc tế, Trường Đại học Nông nghiệp Hà
Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ban lãnh đạo cùng các chuyên
viên Vụ Khoa học Công nghệ và Môi trường Bộ Giáo dục và Đào tạo đã tạo
điều kiện, hướng dẫn tận tình để tôi được thực hiện 01 đề tài trọng điểm cấp
Bộ, cũng chính là nguồn kinh phí chủ yếu để tôi đủ khả năng triển khai
nghiên cứu và thu được các kết quả trong bản luận văn này.
Tôi xin được bày tỏ tỏ lòng biết ơn và tình cảm yêu thương nhất của
mình tới bô mẹ, chồng, anh chị em và bạn bè đã cho tôi động lực và tạo điều
kiện trong quá trình học tập và nghiên cứu

1.1.2 Phân bố của chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium) tại Việt Nam 21
1.1.3 Đặc điểm thực vật học chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium) 24
1.1.4 Một số đặc điểm chính về 2 loài lan bản địa Dendrobium
nobile Lindl. và Dendrobium chrysanthum Lindl. 27
1.1.5 Giá trị sử dụng và thực trạng khai thác một số loài lan Hoàng
Thảo bản địa tại miền Bắc Việt Nam 29
1.2 Cơ sở khoa học của các kỹ thuật nuôi cấy nhân giống trong đề tài 32
1.2.1 Kỹ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật 32

iv

1.2.2 Nhân giống bằng bioreactor 35
1.2.3 Môi trường dinh dưỡng trong nuôi cấy in vitro 38
1.3 Các nghiên cứu về nhân giống in vitro cây lan 42
1.3.1 Nghiên cứu lựa chọn mẫu nuôi cấy 43
1.3.2 Ảnh hưởng của nền môi trường nuôi cấy 44
1.3.3 Ảnh hưởng của nguồn các bon hữu cơ 45
1.3.4 Ảnh hưởng của các hỗn hợp chất hữu cơ tự nhiên 46
1.3.5 Ảnh hưởng của phương thức nuôi cấy 47
1.3.6 Nhân giống in vitro Dendrobium nobile và Dendrobium
chrysanthum 51
1.4 Các nghiên cứu về nuôi trồng lan Hoàng Thảo 53
1.4.1 Các điều kiện cơ bản để trồng lan Dendrobium 53
1.4.2. Nghiên cứu về nuôi trồng cây lan Dendrobium sau nuôi cấy mô 57
Chương 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 60
2.1 Vật liệu nghiên cứu 60
2.2 Nội dung nghiên cứu 61
2.3 Phương pháp nghiên cứu 62
2.3.1 Bố trí thí nghiệm 62
2.3.2 Các chỉ tiêu theo dõi và phương pháp đánh giá 72

D.chrysanthum 96
3.2.6 Ảnh hưởng của các nền môi trường cơ bản đến sinh trưởng
của chồi lan với 2 loài lan D.nobile và D.chrysanthum 99
3.2.7 Nghiên cứu ảnh hưởng của cường độ ánh sáng tới khả năng
sinh trưởng của chồi lan D.nobile và D.chrysanthum 100
3.2.8 Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính (THT) đến khả
năng sinh rễ của chồi loài lan D.nobile và D.chrysanthum 102
3.3 Nghiên cứu khả năng nhân nhanh in vitro đối với hai loài lan
D.nobile và D.chrysanthum theo phương pháp nuôi cấy cải tiến. 105
3.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của phương thức nuôi cấy khi sử
dụng nút bông đến khả năng nhân nhanh thể sinh chồi
(protocorm) đối với loài lan D.nobile 105

vi

3.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của phương thức nuôi cấy khi sử
dụng nút màng thoáng khí đến khả năng nhân nhanh
protocorm đối với loài lan D.nobile 106
3.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng saccaroza đến quá
trình nhân nhanh thể sinh chồi (protocorm) trong nuôi cấy
đặc thoáng khí đối với loài lan D.nobile 107
3.3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng saccaroza đến quá
trình nhân nhanh thể sinh chồi (protocorm) trong nuôi cấy
lỏng lắc thoáng khí đối với loài lan D.nobile 108
3.3.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của các phương thức nuôi cấy đến
khả năng nhân nhanh cụm chồi đối với loài lan
D.chrysanthum 110
3.4 Đặc điểm sinh trưởng của cây con in vitro hai loài lan D.nobile
và D.chrysanthum tại vườn ươm, vườn sản xuất 111
3.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời vụ ra cây đến tỷ lệ sống và


BAP Benzyl amino purin
D.chrysanthum Dendrobium chrysanthum Lindl.
CV(%) Hệ số biến động (Correlation of Variants)
ĐC Đối chứng
IAA Indol acetic acid
IBA Indol butyric axit
α. NAA α Naphtyl acetic axit
KC KnudsonC, 1965
Kn Kinetin
LSD Sai khác tối thiểu có ý nghĩa ở P = 0.05
(Least Significant Difference)
MS Murashige-Skoog, 1962
D.nobile Dendrobium nobile Lindl.
RE Robert Ernst, 1979
THT Than hoạt tính
VW Vacin and Went, 1949 ix

DANH MỤC BẢNG

STT Tên bảng Trang

1.1 Đặc điểm chính của hai loài lan nghiên cứu 28
1.2 Thực trạng phân bố, giá trị sử dụng làm dược liệu của chi Hoàng
Thảo (Dendrobium) ở phía Bắc Việt Nam 30
1.3 Phân hạng mức độ bị đe dọa của một số loài chi lan Hoàng thảo
tại Việt Nam 32

(Sau 8 tuần nuôi cấy) 93
3.10 Ảnh hưởng của dịch nghiền hợp chất hữu cơ tự nhiên đến
khả
năng nhân nhanh cụm chồi 02 loài lan D.nobile và
D.chrysanthum 95
3.11 Ảnh hưởng của hàm lượng chuối chín đến khả năng
nhân nhanh
cụm chồi 02 loài lan D.nobile và D.chrysanthum 97
3.12 Ảnh hưởng của các loại nền môi trường cơ bản
đến sinh trưởng
của chồi lan của 02 loài lan D.nobile và D.chrysanthum (Sau 6
tuần nuôi cấy) 100
3.13 Ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng đến sinh trưởng chồi của 02
loài lan D.nobile và D.chrysanthum
(Sau 30 ngày nuôi cấy) 101
3.14 Ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng tạo rễ của chồi 02
loài lan D.nobile và D.chrysanthum 103
3.15 Ảnh hưởng của phương thức nuôi cấy đến khả năng
nhân nhanh
thể sinh chồi (protocorm) đối với loài lan D.nobile
(Sau 3 tuần
nuôi cấy) 105
3.16 Ảnh hưởng của phương thức nuôi cấy đến khả năng
nhân nhanh
thể sinh chồi (protocorm) đối với loài lan D.nobile
(Sau 3 tuần
nuôi cấy) 107
3.17 Ảnh hưởng của hàm lượng đường saccaroza đến khả năng nhân
nhanh thể sinh chồi (protocorm) của loài lan D.nobile trong nuôi
cấy đặc thoáng khí (Sau 8 tuần nuôi cấy) 107

loài lan rừng thu thập D.nobile 127
3.26 Ảnh hưởng của các chế phẩm dinh dưỡng qua lá
đến tỷ lệ ra hoa
và kích thước hoa của loài lan rừng thu thập D.nobile 131
3.27 Ảnh hưởng của các loại chế phẩm dinh dưỡng
đến động thái tăng
chiều cao, đường kính thân, số lá và số chồi TB/cây của loài lan
rừng thu thập D.chrysanthum 132
xii

DANH MỤC HÌNH
STT Tên hình Trang

1.1 Cấu tạo hoa D.nobile Lindl 27
1.2 Cấu tạo hoa D.chrysanthum Lindl. 27
2.1 Loài lan D.nobile Lindl. 60
2.2 Loài lan D.chrysanthum Lindl. 60
3.1 Hình thái chồi mầm D.nobile sau khử trùng 75
3.2 Gieo hạt lan rừng D.nobile (Sau 6 tuần nuôi cấy) 77
3.3 Gieo hạt lan rừng D.chrysanthum 77
3.4 Ảnh hưởng của nền môi trường đến động thái tăng đường kính
cụm thể sinh chồi của loài lan rừng D.nobile 80
3.5 Ảnh hưởng của nền môi trường cơ đến động thái nhân nhanh
cụm chồi loài lan rừng D.nobile 82
3.6 Ảnh hưởng của nền môi trường đến động thái nhân nhanh
cụm
chồi loài lan rừng D.chrysanthum 82

3.20 Nuôi cấy lỏng lắc thoáng khí với loài D.nobile 109
3.21 Nhân nhanh cụm chồi của loài D.chrysanthum bằng nuôi cấy
bioreactor 111
3.22 Cây con in vitro ở vườn ươm, vườn sản xuất 113
3.23 Ảnh hưởng của chế phẩm dinh dưỡng đến động thái
tăng chiều
cao cây in vitro của loài lan rừng D.nobile 115
3.24 Ảnh hưởng của chế phẩm dinh dưỡng đến động thái
tăng chiều
cao cây in vitro của loài lan rừng D.chrysanthum 116
3.25 Ảnh hưởng của chế phẩm sinh dưỡng đến động thái
tăng số lá
trên cây in vitro của loài lan rừng D.nobile 116
3.26 Ảnh hưởng của chế phẩm sinh dưỡng đến động thái
tăng số lá
trên cây in vitro của loài lan rừng D.chrysanthum 117
3.27 Cây con in vitro ra cây ở vườn ươm 117

xiv

3.28 Ảnh hưởng của giá thể đến động thái tăng chiều dài cành của loài
lan rừng thu thập D.nobile 122
3.29 Ảnh hưởng của giá thể đến động thái tăng đường kính thân
của
loài lan rừng thu thập D.nobile 122
3.30 Ảnh hưởng của giá thể đến động thái tăng số chồi
của loài lan
rừng thu thập D.nobile 123
3.31 Cây D.nobile trồng trên giá thể than củi ngoài vườn sản xuất 123
3.32 Ảnh hưởng của giá thể đến động thái tăng chiều dài cành của loài

MỞ ðẦU

1 Tính cấp thiết của ñề tài
Trong thế giới các loài hoa có thể nói hoa lan là loài hoa có vẻ đẹp
quyến rũ mê hồn về mầu sắc và hương thơm, đặc biệt là các đường nét
của hoa thật cầu kỳ, sắc sảo, thêm vào đó hoa lan có đặc tính bền và tươi
lâu (Trần Hợp, 1989) [9] và (Nguyễn Nghĩa Thìn, 2006) [46]. Ngoài các
giá trị làm cảnh và trang trí, hoa lan còn được sử dụng với nhiều mục đích
khác nhau như: Dùng làm thực phẩm (giống Orchis), rau xanh (giống
Anoetochilus), trà uống (loài Jumellea fragrans), hương liệu (Vannila
plannifolia) và đặc biệt lan còn được dùng làm dược liệu, có tác dụng chữa
bệnh như một số loài thuộc chi Orchis, Platanthera, Gymnadenda,
Dactylorhiza và đặc biệt là chi Hoàng thảo (Dendrobium nobile, Caulis
Dendrobium, Dendrobium loddgesii, Dendrobium chrysanthum, Dendrobium
fimbriatum, Dendrobium nobile Lindi), (Lê Trần Đức, 1977) [7], (Đỗ Huy
Bích, 2004) [3] và (Dương Đức Huyến, 2007) [17].
Hoàng Thảo là một trong những chi lớn nhất của của họ Lan (Orchidaceae).
Theo A. Takhajan (1966) chi Hoàng Thảo trên thế giới có khoảng 1400 loài, chủ
yếu phân bố ở lục địa Đông Nam Á và các đảo thuộc Philippin, Malaixia,
Inđonêxia, Niu Ghinê, Đông Bắc Ôxtrâylia. Ở Việt Nam hiện biết 107 loài và 1
thứ thuộc chi Hoàng Thảo phân bố chủ yếu ở vùng núi suốt từ Bắc vào Nam và
trên một số đảo ven biển (Đào Thị Thanh Vân, Đặng Thị Tố Nga, 2008) [55] .
Tuy nhiên, trong quá trình phát triển kinh tế xã hội, do những nguyên nhân
khác nhau, nhiều loài Hoàng Thảo ở nước ta đã bị tuyệt chủng hoặc bị đe dọa
tuyệt chủng (Nguyễn Xuân Linh, 2002) [23]. Năm 2004, một số loài lan thuộc chi
lan Hoàng Thảo đã có trong danh lục Đỏ của “Sách đỏ Việt Nam” như: Kim Điệp
(Dendrobium fimbriatum Hook. 1823), Ngọc Vạn Vàng (Dendrobium
chrysanthum Lindl. 1830), Thuỷ Tiên Hường (Dendrobium amabile (Lour.)

17

18

phần làm cơ sở cho việc tạo được nguồn cây giống không chứa các chất điều tiết
sinh trưởng thực vật tổng hợp phục vụ cho sản xuất nguyên liệu dược.
2 Mục tiêu và yêu cầu của ñề tài
2.1 Mục tiêu của ñề tài
Xây dựng quy trình nhân giống in vitro không sử dụng chất điều tiết
sinh trưởng thực vật tổng hợp để góp phần làm cơ sở duy trì, phát triển nguồn
gen đồng thời thúc đẩy việc nuôi trồng cây lan rừng bản địa Dendrobium
nobile Lindl. và Dendrobium chrysanthum Lindl. như một nghề sản xuất
nguyên liệu dược mang lại hiệu quả kinh tế.
2.2 Yêu cầu của ñề tài
+ Xác định được phương pháp thích hợp để tạo nguồn vật liệu in vitro
đối với loài lan bản địa Dendrobium nobile Lindl. và Dendrobium
chrysanthum Lindl.
+ Xác định được các bước kỹ thuật nhân nhanh in vitro theo hướng
không sử dụng chất điều tiết sinh trưởng tổng hợp đối với loài lan bản địa
Dendrobium nobile Lindl. và Dendrobium chrysanthum Lindl.
+ Xác định được một số khâu kỹ thuật cải tiến trong nhân giống loài
lan bản địa Dendrobium nobile Lindl. và Dendrobium chrysanthum Lindl. để
có hệ số nhân giống cao và chất lượng cây in vitro tốt.
+ Xác định được một số khâu kỹ thuật nuôi trồng loài lan bản địa
Dendrobium nobile Lindl. và Dendrobium chrysanthum Lindl. trong giai đoạn
vườn ươm.
3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài
3.1 Ý nghĩa khoa học
- Kết quả của đề tài có thể được sử dụng làm tài liệu tham khảo cho việc
nghiên cứu, giảng dạy về hoa lan nói chung và chi lan Hoàng Thảo nói riêng.
- Kết quả nghiên cứu của đề tài là dẫn liệu khoa học có giá trị về khả
năng nhân giống in vitro không sử dụng chất điều tiết sinh trưởng và những

- Đã xây dựng được quy trình nhân giống in vitro cho hai loài lan bản

20

địa D.nobile Lindl. và D.chrysanthum Lindl. có nguy cơ tuyệt chủng không
sử dụng chất điều tiết sinh trưởng.
- Đã sử dụng thành công kỹ thuật cải tiến trong nhân nhanh hai loài lan
bản địa bằng kỹ thuật thoáng khí và biorector đạt hệ số nhân cao.

21

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium) và hai loài lan bản ñịa
Dendrobium nobile Lindl. (D.nobile) và Dendrobium chrysanthum
Lindl. (D.chrysanthum)
1.1.1 Nguồn gốc và phân bố của chi Hoàng Thảo (Dendrobium)
Chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium) được đặt tên vào năm 1799,
Dendrobium được hiểu là lan sống trên cây, tiếng Việt Nam gọi là chi lan
Hoàng Thảo. Lan Hoàng Thảo có nhiều màu sắc và hình thái khác nhau
(Nguyễn Tiến Bân, 1990a) [1] và Trần Duy Quý, 2005 [36].
Lan Hoàng Thảo là chi lan phong phú nhất, trong họ lan có 1600 loài
nguyên thủy được phân chia thành 40 nhóm, phân bố ở các vùng nhiệt đới
châu Á, tập trung nhiều nhất ở Đông Nam Á và châu Á. Dendrobium không
có kiểu hoa chung, mà rất đa dạng. Chúng phân bố ở cả ba vùng khí hậu như:
nóng, lạnh và trung gian (Võ Đức Tri, Dương Đức Tiến, 1978a) [4], Võ Đức

khu vực Hymalaya, Nam Trung Hoa có các loài chịu được lạnh của chi
Dendrobium (Hoàng Thảo): Dendrobium salaccense Lind., Dendrobium
nobile Lindl., Dendrobium loddigesii Rolfe
* Vùng Tây Bắc: Từ hữu ngạn sông Hồng (chân núi Con Voi) đến các
vùng núi giáp nước Lào, ít ảnh hưởng gió mùa Đông Bắc nên ở đây ít lạnh hơn
ngược lại mùa hạ lại nóng sớm và có kèm theo gió Lào. Các chi loài phong lan ở
đây có khả năng chịu nóng hơn như các loài trong chi Dendrobium (lan Hoàng
Thảo) Dendrobium fimbriatum Hook., Dendrobium chryseum, Dendrobium peru
latum, Dendrobium chrysanthum Lind. và gần gũi với hệ thực vật họ phong
lan vùng thượng Lào (Khuất Hữu Trung và cs, 2007) [51].
* Trung du Bắc Bộ: Vùng này có rất nhiều loài của chi lan Hoàng thảo
như: Dendrobium longicornu Lind., Dendrobium williamsonii, Dendrobium

23

brymerianum, Dendrobium chrysanthum Lind., Dendrobium evaginatum,
Dendrobium wardiannum, Dendrobium nobile Lindl., Dendrobium pendulum
Roxb, Dendrobium parishii, Dendrobium devonianum, Dendrobium
loddigesii Rolfe.…
* Vùng Bắc Trung Bộ: Thường gặp các loài như: Dendrobium
ellipsophyllum, Dendrobium delacourii, Dendrobium chrysotoxum,
Dendrobium thyrsiflorum, Dendrobium amabile, Dendrobium podagraria
Hook, Dendrobium parciflorum,…
* Vùng cao Tây nguyên: Là vùng có cao độ trên 1.000m, địa hình đồi
núi, khí hậu lạnh ẩm, là nơi ưu thế phát triển của rừng cây thông 3 lá, dẻ, sồi.
Loài lan Nhất Điểm Hoàng (Dendrobium flavum) xuất hiện ở các thung lũng,
sườn núi, đèo Prenn đường vào Đà Lạt, trên các cây sồi cây dẻ.
* Vùng trung Tây nguyên: Đây là vùng có cao độ trung bình 700 -
1.000m, địa hình nhiều đồi núi, nhiệt độ thấp, khí hậu ẩm mát. Ở đây còn là
vùng tập trung nhiều loại Dendrobium có hoa đẹp nhất Việt Nam. Một tập

phong phú nhưng sự phân bố của chúng khá đặc thù cho các vùng địa lý khác
nhau. Hai loài lan Thạch hộc (D.nobile) và Ngọc vạn vàng (D.chrysanthum)
chỉ được tìm thấy ở vùng Tây bắc, Đông bắc và trung du Bắc bộ nước ta
(Phạm Hoàng Hộ, 2000) [10].
1.1.3 ðặc ñiểm thực vật học chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium)
1.1.3.1 Rễ
Rễ của phong lan có lớp mô xốp màu trắng ngà với nhiều công dụng
khác nhau: Bảo vệ nguồn dẫn nước bên trong của rễ; hút nước và các muối
khoáng bám trên bề mặt rễ và hấp thụ cả hơi nước trong không khí ẩm. Chúng
còn có khả năng bám chặt vào các vật mà chúng tiếp xúc. Ruột rễ của các loài
lan là một sợi rất chắc và khá dai như sợi cước, chính vì thế rễ lan đảm bảo
được cho cây lan có thể bám trên ngọn cây cao, ở các sườn núi non cao chót
vót mà không bị gió mạnh cuốn đi (Nguyễn Thiện Tịch, 1996) [50], (Nguyễn
Hạc Thúy, 2001) [48] và (Trần Duy Quý, 2005) [36] .