BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP & PTNT
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
PHẠM ĐỨC TRỌNG NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO MỘT SỐ
DÒNG LAN HUỆ LAI (Hispeastrum equestre) CHUYÊN NGÀNH: KHOA HỌC CÂY TRỒNG
MÃ Số: 60 62 01 10 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. NGUYỄN HẠNH HOA HÀ NỘI, 2014
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn khoa học
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các Thầy giáo, Cô giáo cùng
toàn thể các cán bộ nhân viên trong Viện Sinh học Nông nghiệp - Học viện
Nông nghiệp Việt Nam đã quan tâm giúp đỡ tôi và tạo mọi điều kiện thuận
lợi trong quá trình tôi thực hiện Luận văn tốt nghiệp.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã
luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện Luận văn tốt
nghiệp này.
Hà Nội, ngày tháng năm 2014
Tác giả
Phạm Đức Trọng Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page iii
MỤC LỤC
Trang
LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CẢM ƠN ii
MỤC LỤC iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi
DANH MỤC CÁC BẢNG vii
2.1.5. Giá trị kinh tế và sử dụng của cây Lan huệ 7
2.2. Tình hình sản xuất Lan huệ trong nước 9
2.3. Một số phương pháp nhân giống vô tính hoa Lan huệ 10
2.3.1. Phương pháp tách củ con 10
2.3.2. Phương pháp cắt lát (Chipping) 10
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page iv
2.3.3. Nhân nhanh In vitro 12
2.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro 13
2.4. Những nghiên cứu về nuôi cấy mô cây Lan huệ ở trong nước và
trên thế giới 14
2.4.1. Những nghiên cứu về nuôi cấy mô cây Lan huệ ở Việt Nam 14
2.4.2. Những nghiên cứu về nuôi cấy mô cây Lan huệ trên thế giới 17
PHẦN III. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18
3.1. Đối tượng, vật liệu, điều kiện, địa điểm và thời gian nghiên cứu 18
3.1.1. Đối tượng 18
PHẦN IV. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 30
4.1. Giai đoạn nuôi cấy khởi động 30
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page v
4.2. Giai đoạn nhân nhanh 34
4.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của sự phối hợp 2 nhóm chất là
cytokinin và auxin đến khả năng phát sinh chồi từ vảy củ đôi 34
4.2.2. Ảnh hưởng của sự phối hợp 2 nhóm chất cytokinin và auxin
đến hệ số nhân nhanh chồi từ chồi in vitro 38
4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường tới chất lượng
chồi in vitro 43
4.4. Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh 47
4.5. Giai đoạn vườm ươm 53
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 62
5.1. Kết luận 62
5.2. Đề nghị 63
TÀI LIỆU THAM KHẢO 64
PHỤ LỤC 67
chồi in vitro từ vảy củ đôi 36
Bảng 4.4. Ảnh hưởng của BA, kinetin và α-NAA đến khả năng tái sinh
chồi in vitro từ vảy củ đôi 36
Bảng 4.5. Ảnh hưởng của BA, kinetin và α-NAA đến khả năng phát
sinh chồi từ chồi in vitro 40
Bảng 4.6. Ảnh hưởng của BA, kinetin và IBA đến khả năng phát sinh
chồi từ chồi in vitro 40
Bảng 4.7. Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa tới chất lượng chồi in
vitro sau 4 tuần nuôi cấy 44
Bảng 4.8. Ảnh hưởng của hàm lượng đường tới chất lượng chồi in
vitro sau 4 tuần nuôi cấy 44
Bảng 4.9. Ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng ra rễ các dòng Lan
huệ lai in vitro 49
Bảng 4.10. Ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng ra rễ các dòng
Lan huệ lai in vitro 49
Bảng 4.11. Ảnh hưởng của các loại giá thể đến tỷ lệ sống, sinh trưởng
và phát triển của cây Lan huệ lai sau in vitro 55
Bảng 4.12. Ảnh hưởng của một số loại phân bón qua lá tới sự sinh
trưởng ở vườm ươm của cây Lan huệ lai sau in vitro 59
dòng lai hoa Lan huệ ngoài vườn ươm 60 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 1
PHẦN I
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Hoa đóng vai trò quan trọng trong cuộc sống của con người, là sản phẩm
vừa mang giá trị tinh thần vừa mang giá trị kinh tế. Trong những năm gần
đây, nước ta đã đạt được kết quả khả quan về phát triển kinh tế - xã hội. Đời
sống của người dân được cải thiện nên nhu cầu về hoa ngày càng tăng, ngày
càng đa dạng và phong phú cả về chủng loại và màu sắc. Một trong những
loài hoa ngày càng được nhiều người yêu thích hiện nay là hoa Lan huệ được
trồng trong chậu, trong cốc thủy tinh hoặc cắt cành.
Lan huệ ((Hippeastrum equestre (Aiton) Herb.)), tên tiếng Anh là
Valentine flower. Nếu như ở các nước Châu Âu, loài hoa này đã được sử
dụng phổ biến làm quà tặng nhân dịp “Valentine” với nhiều giống hoa có màu
sắc đa dạng thì ở Việt Nam, Lan huệ còn rất nghèo nàn về màu sắc (chủ yếu
là màu đỏ), thời gian ra hoa của chúng lại muộn hơn (khoảng từ giữa tháng 3
đến cuối tháng 5) lệch với thời gian lễ “Valentine”. Như vậy để phát triển Lan
huệ ở Việt Nam cần tiến hành nghiên cứu: Tăng độ đa dạng về màu sắc hoa
và chọn tạo giống có thời gian ra hoa phù hợp với dịp có nhu cầu tiêu thụ của
thị trường.
Để nhân giống vô tính cây Lan huệ có thể sử dụng các phương pháp:
Tách củ nhỏ từ cụm cây mẹ (Siddique và cs., 2007); kỹ thuật cắt lát
in vitro của một số dòng lai hoa Lan huệ.
Góp phần bổ sung và hoàn thiện quy trình nhân in vitro nhằm nhân
nhanh một số dòng Lan huệ lai (Hippeastrum equestre).
1.2.2. Yêu cầu
- Xác định môi trường thích hợp trong việc khởi động mẫu cho sự phát
sinh hình thái mẫu nuôi cấy.
- Xác định môi trường nhân nhanh thích hợp để làm tăng hệ số nhân chồi.
- Xác định môi trường ra rễ phù hợp để tạo cây hoàn chỉnh.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 3
- Xác định một số yếu tố kỹ thuật cần thiết chăm sóc cây sau in vitro
ngoài vườn ươm: (Tiêu chuẩn cây phù hợp; giá thể thích hợp; loại phân bón
qua lá phù hợp).
1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
1.3.1. Ý nghĩa khoa học
- Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp những dữ liệu khoa học mới
về nhân giống vô tính cây Lan huệ bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào,
góp phần làm phong phú cơ sở dữ liệu về kỹ thuật nuôi cấy mô cây hoa.
- Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp thông tin cần thiết làm cơ
sở cho việc xây dựng hoàn thiện quy trình nhân giống Lan huệ sản xuất hàng
hóa có thương hiệu riêng và hiệu quả kinh tế cao.
- Các kết quả nghiên cứu của đề tài có thể sử dụng để giảng dạy và
nghiên cứu trong nuôi cấy mô tế bào cây hoa.
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
- Các kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần đề xuất quy trình nhân
giống một số dòng Lan huệ lai bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào, đáp ứng sản
xuất giống có hiệu quả, chất lượng tốt, khắc phục được những hạn chế của
nhân giống truyền thống, duy trì và nhân nhanh kiểu gen được chọn lọc.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 5
thành hình máng, dai, cứng, có nhiều gân sọc song song và gân phụ ngang
song song, mép hơi cong xuống, chóp tù. Gốc lá dạng bẹ ôm lấy nhau.
Lá bắc tổng bao 2, dạng mo, gồm 2 cái, mỏng, kích thước 6-7 x 3-4 cm,
màu trắng xanh, mỏng, 2 chiếc, tồn tại.
2.1.2.3. Hoa
Cụm hoa tán, 2- 4 hoa, trên một cuống hoa chung có hình trụ, dài 30-50
cm, đường kính 1,5-2 cm ,thẳng đứng và rỗng, mặt ngoài phủ phấn trắng.
Hoa to khi nở đường kính tới 15 cm, đều, lưỡng tính,màu sắc sặc sỡ,
màu đỏ hoặc đỏ cam, có cuống dài 4-5 cm, gốc màu xanh hoặc xanh vàng
hoặc vàng trắng.
Bao hoa hình phễu, dài 9-12 cm, nằm ngang hoặc rủ xuống, 6 mảnh, dạng
tràng, phần dưới dính nhau thành ống, ngắn, dài 2-3,5 cm, họng có 1 vòng
vảy ngắn hoặc 1 vòng tràng phụ cụp vào trong, phần trên 6 thùy, hình trứng
xếp 2 vòng, các thùy bằng nhau hoặc các thùy vòng trong hẹp hơn. Nhị 6; chỉ
nhị rời nhau, hình trụ dài 6-7 cm, đầu hơi cong đính ở họng ống bao hoa,
nghiêng về một phía; bao phấn hình trụ, dài 2-2,5 cm, màu trắng ngà,2 ô, đính
lưng , hướng trong, mở bằng khe dọc.
Bầu ha, dài 1,2-1,5 cm 3 ô, đính noãn trung trụ, mỗi ô nhiều noãn; vòi
nhụy dài tới 10 cm, mảnh; đầu nhụy dạng đầu hoặc 3 thùy, màu trắng.
2.1.2.4. Củ và rễ
Củ con: Lan huệ có các củ con (thân hành con) sinh ra từ củ mẹ, chu vi
của củ con từ 3-6 cm, số lượng củ con trung bình từ 1-3 củ/cây.
Rễ:cây thuộc bộ Lilliales nên có hệ rễ chùm gồm nhiều rễ phụ tương đối
đồng đều về kích thước.
2.1.2.5. Quả
Quả nang, hình cầu hoặc hình thuôn, mở ở khe lưng ô thành 3 mảnh. Hạt
nhiều, dẹp, màu đen nội nhũ nạc bao lấy phôi nhỏ
trong bóng râm thường cao và lá dài.
2.1.3.3. Nước
Thời kỳ đầu cây rất cần nước, khi ra hoa giảm bớt nước. Nhiều nước dễ
làm cho củ bị thối, rụng nụ. Độ ẩm đất thay đổi tùy thuộc vào giai đoạn phát
triển của cây (thường từ 70-85%).
2.1.3.4. Đất
Đất tơi xốp, không chứa mầm bệnh và thoát nước tốt. Lan huệ rất mẫn
cảm với muối, nồng độ muối trong đất cao, cây không hút được nước ảnh
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 7
hưởng tới sinh trưởng, ra hoa. Nói chung, hàm lượng muối trong đất không
được cao quá 1,5mg/cm
2
, lượng hợp chất Clo không được vượt quá
1,5mmol/lít, pH = 6,5-7,0.
2.1.4. Kỹ thuật trồng và chăm sóc
Hispeastrum equestre có khả năng duy trì bộ lá xanh quanh năm nên vẫn
giữ được màu xanh trong suốt mùa đông. Vào những tháng có nhiệt độ xuống
thấp, cây vẫn có thể được trồng ngoài trời nhưng nên phủ rơm rạ hoặc lá khô
quanh gốc để hạn chế tác hại.
Nhiều giống thuộc chi Hispeastrum có khả năng sinh trưởng phát triển tốt
hơn khi được trồng trong điều kiện che bóng nhẹ. Vì vậy, có thể trồng cây
dưới tán cây lớn hoặc đưa chậu trồng cây vào ban công, hiên nhà, cây vẫn
phát triển tốt.
Ở nước ta, cây ra hoa vào mùa xuân - hè, vào khoảng tháng 3 cho đến hết
tháng 5, nở tập trung nhất vào cuối tháng 3 đầu tháng 4, thường được trồng
làm cảnh, hoa rất đẹp.
Trồng củ huệ đúng bài bản nhất là chỉ chôn 2/3 củ xuống đất. Chất
trồng phù hợp với Lan huệ trồng chậu là loại không có đất (soilless) vì tự thân
trích từ Lycoris radiata, và từ đó tên narcissine bị bỏ. Lycorine là một alkaloid
loại isoquinolone (chuyển hóa từ phena thridine), có phân tử lượng 287.32, có
các hoạt tính sinh học loại cholino mimetic; ức chế hoạt tính sinh học của
men acetylcholinesterase. Các hoạt tính của Lycorine có tác dụng chống siêu
vi trùng : Lycorine có hoạt tính ức chế hoạt động tái lập của siêu vi trùng
HIV-1, khi thử trên dòng tế bào MT4.(Planta Medica Số 70-2004). Lycorine
ức chế sự phát triển của siêu vi trùng coronavirus gây bệnh SARS (Severe
Acute Respiratory Syndrome) ở liều EC50 (Effective Concentration) = 15.7
+/- 1.2 nM và đang được nghiên cứu thêm để làm thuốc trị SARS (Antiviral
Research Số 67-2005). Ngoài ra, Lycorine có tác dụng chống sưng-viêm do
ức chế sự sản xuất TNF-alpha (tumor necrosis factor) nơi các đại thực bào của
chuột thử nghiệm; ức chế tiến trình sinh tổng hợp proteins. Vì TNF-alpha là
một chất cytokine căn bản điều hòa tiến trình sưng viêm nên lycorine có triển
vọng được dùng làm thuốc chống sưng, trị thấp khớp.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 9
Trong Đông dược, Lan huệ là một vị thuốc quan trọng vì củ có vị ngọt
cay, tính ấm có độc, có tác động tán ứ, tiêu thũng. Thân hành của cây được
dùng giã nát đắp cầm máu và trị tổn thương khi té ngã.
Ngoài ra, việc phục vụ nhu cầu giải trí thưởng thức, hoa Lan huệ còn
mang lại lợi ích kinh tế khá cao. Hiện nay, trên thị trường các loài hoa Lan huệ
mới được bán với giá khá cao từ 5.000 – 20.000đ/cành. Thu nhập từ 150 – 200
triệu đồng/ha/năm.
2.2. Tình hình sản xuất Lan huệ trong nước
Trước giờ ở Việt Nam hoa Lan huệ (Hippeastrum) chỉ có một màu đỏ
là nhiều nhưng không mấy người chú ý bởi vì quanh năm suốt tháng nó chỉ có
độc một màu lá xanh biếc. Hoa Lan huệ chỉ trổ bông mỗi năm một lần, có khi
đôi lần nhưng không nhiều cây được như thế [7].
Người Việt Nam ta thường để Lan huệ tự sinh tự dưỡng ở bờ rào góc
sinh trưởng trung tâm) như chi Hippeastrum, Narcissus (hoa thủy tiên),
Galanthus. Các bước tiến hành [19]:
1. Chọn những củ Lan huệ bố mẹ khoẻ mạnh không bị nấm bệnh, nhổ
củ khi củ còn ở trạng thái ngủ nghỉ.
2. Dùng dao sắc nhọn sao cho khi cắt lát cắt phẳng, mịn không làm dập
nát củ. Khử trùng bề mặt củ và dao cắt.
3. Cắt bớt phần rễ và phần trên của củ, dùng dao cắt dọc chia đôi củ từ
đỉnh củ xuống phần đế củ, tiếp tục chia nhỏ các nửa hành sao cho mỗi lát đều
mang một phần đế củ. Một củ có thể chia thành 8-16 lát.
4. Các lát được ngâm trong dung dịch thuốc diệt nấm khoảng 10-15
phút lắc đều, sau đó được vớt ra để ráo nước.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 11
5. Cho mỗi lát vào trong 1 túi nilon có chứa đá trân châu có thêm chất
khoáng, cho nhiều khí vào túi và buộc kín túi. Đưa vào nơi mát và tối với
nhiệt độ thích hợp 20-21
o
C, thường xuyên kiểm tra dấu hiệu thối hỏng.
6. Sau khoảng 12 tuần các hành con sẽ xuất hiện ở gốc của lát cắt. Tách
các cây con trồng vào giá thể tơi xốp và thoát nước. Cây con rất bé và yếu ớt
nên cần đặt dưới ánh sáng tán xạ một thời gian trước khi đưa ra ngoài ánh
sáng trực tiếp.
Phải mất khoảng 2-4 năm cây mới sinh trưởng phát triển thành thục và
cho hoa. Ở Việt Nam, mùa đông không có tuyết và sương giá nên cây sẽ lớn
nhanh hơn và cho hoa sớm hơn so các nước ở xứ lạnh.
Các hóa chất thường được sử dụng để khử trùng là HgCl
2
0,1% từ 5
đến 10 phút, NaClO 1% từ 15 – 20 phút, cồn 70
0
, H
2
O
2
, Johnson 10%
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 13
2.3.3.3. Giai đoạn nuôi cấy khởi động
Ở giai đoạn này mô nuôi cấy sau khi được khử trùng được chuyển vào
môi trường thích hợp về tỷ lệ và hàm lượng các chất điều tiết sinh trưởng để
kích thích mẫu cấy hình thành chồi bất định, các phôi vô tính hay kích thích
các chồi nách, mắt ngủ bật mầm.
2.3.3.4. Giai đoạn nhân nhanh
Là giai đoạn quan trọng của quá trình nhân giống in vitro vì giai đoạn
này xác định hệ số nhân của quá trình nhân giống in vitro. Môi trường nuôi
cấy nhân tạo có các chất điều tiết sinh trưởng như: Auxin, Cytokinin, đồng
thời phải chú y đảm bảo những điều kiện ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng,
quang chu kì…
2.3.3.5. Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh
Là giai đoạn chuyển những chồi đã hình thành trong giai đoạn nhân
nhanh sang môi trường tạo rễ để hình thành cây có đủ rễ, thân, lá, đủ tiêu
chuẩn là cây giống. Môi trường tạo rễ thường bổ sung α NAA để kích thích
hình thành rễ.
2.3.3.6. Giai đoạn đưa cây in vitro ra đất
khoai tây, chuối được bổ sung vào môi trường nhằm làm tăng cường thêm các
axit amin, vitamin cũng như thêm các yếu tố dinh dưỡng khác.
* Agar: Là chất làm đông cứng môi trường tạo điều kiện cho mẫu cấy
phát triển, sinh trưởng tốt.
* pH môi trường: pH thích hợp cho phần lớn các mô nuôi cấy là 5,5 - 5,8.
2.4. Những nghiên cứu về nuôi cấy mô cây Lan huệ ở trong nước và trên
thế giới
2.4.1. Những nghiên cứu về nuôi cấy mô cây Lan huệ ở Việt Nam
Khả năng thành công của nuôi cấy mô tế bào phụ thuộc chủ yếu vào
trạng thái tuổi của tế bào. Tế bào càng gần trạng thái phôi sinh bao nhiêu,
khả năng nuôi cấy thành công càng cao bấy nhiêu. Như vậy tế bào phôi
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 15
thường có triển vọng nhất rồi đến tế bào các đỉnh sinh trưởng đang ở trạng
thái hoạt động (đỉnh ngọn, chóp rễ) và sau đó là tế bào ở trạng thái ngủ
nghỉ (chồi nách) [14],[15],[16],[17].
Trong nhân giống in vitro, cây con có thể được tái sinh từ các điểm sinh
trưởng có sẵn trong các bộ phận (phôi, đỉnh chồi, chồi nách) hoặc từ những
mô có khả năng hình thành điểm sinh trưởng phụ. Có hai phương pháp tái
sinh cây con:
+ Tái sinh trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng, phôi, ngọn, chồi hay chồi nách.
+ Tái sinh cây gián tiếp thông qua giai đoạn hình thành mô sẹo.
Tái sinh trực tiếp (direct regeneration) từ mẫu nuôi cấy là quá trình phát
động những điểm sinh trưởng đã tồn tại sẵn trong mô nuôi cấy phân chia và
tái sinh thành cây. Các điểm sinh trưởng này bao gồm các tế bào phôi sinh
chứa 2n nhiễm sắc thể đặc trưng cho loài. Cây con tạo ra theo đường này
hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền và duy trì được những tính trạng của
cây mẹ.
Trong đường hướng tái sinh gián tiếp, mẫu nuôi cấy không tái sinh
Việc lựa chọn mô nuôi cấy rất quan trọng, nghiên cứu về việc sử dụng
vảy củ để nuôi cấy, trong các năm 2008 – 2009, TS. Nguyễn Hạnh Hoa và
cộng sự cho rằng đối với hoa Lan huệ, sử dụng vảy củ làm vật liệu khởi đầu
rất dễ dàng và cho hiệu quả cao hơn nhiều so với sử dụng các bộ phận khác.
Tiếp đó, nhằm nhân nhanh các giống sạch bệnh, đáp ứng đa dạng hóa nguồn
gen và sản xuất giống gốc [7].
Cũng trong năm 2010, TS. Nguyễn Hạnh Hoa, TS.Nguyễn Thị
Phương Thảo và cộng sự đã nghiên cứu nhằm tìm ra các thông số thích hợp
hướng tới nhân giống in vitro cây Lan huệ mạng (Hispeastrum reticulatum
var. striatifolium) [13],[14]. Trên môi trường nền MS có bổ sung BA mẫu
tái sinh chồi và củ in vitro cao. Chồi và củ in vitro tiếp tục được sử dụng cho
thí nghiệm nhân nhanh và cũng thu được kết quả rất tốt. Các cây con in vitro
Copyright: Tài liệu đại học ©