ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
NGUYỄN THỊ THU THỦY
NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO MỘT SỐ DÒNG
LAN HUỆ LAI (HIPPEASTRUM EQUESTRE)
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội – Năm 2014
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
NGUYỄN THỊ THU THỦY
NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO MỘT SỐ DÒNG
LAN HUỆ LAI (HIPPEASTRUM EQUESTRE)
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS. TS. Nguyễn Trung Thành
Hà Nội – Năm 2014
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc
đến PGS.TS. Nguyễn Trung Thành, thầy đã luôn tận tình hướng dẫn,
giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này.
Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới GS.TS.
Nguyễn Quang Thạch, TS. Nguyễn Hạnh Hoa và toàn thể tập thể cán
bộ, nhân viên trong Viện Sinh học Nông nghiệp, Học viện Nông
nghiệp Việt Nam đã nhiệt tình chỉ bảo, giúp đỡ, tạo điều kiện về cơ sở
vật chất, chia sẻ kinh nghiệm quý báu để em hoàn thành tốt đề tài này.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới gia đình,
người thân và bạn bè, những người luôn chia sẻ, động viên, giúp đỡ
đông y trong củ của nó có chứa các thành phần biệt dược có giá trị như các
ankaloids (Funganti, 1975), các lectins có khả năng chống ung thư, cầm
máu, chữa lành vết thương…
Lan huệ ở Việt Nam hiện nay còn nghèo nàn về màu sắc (chủ yếu là
màu đỏ), thời gian ra hoa của chúng lại khá muộn (khoảng từ giữa tháng 3
đến cuối tháng 5) nên khả năng phát triển loài hoa này còn rất nhiều hạn
chế. Bằng con đường thu thập nguồn gen, lai hữu tính và chọn lọc có thể
làm phong phú bộ giống hoa Lan Huệ ở nước ta. Năm 2009 – 2010,
Nguyễn Hạnh Hoa và cs đã chọn tạo ra hàng loạt con lai có màu sắc lạ,
đẹp, đa dạng, hoa có độ bền lâu và có thời gian ra hoa đáp ứng đúng thị
trường. Điển hình là các dòng H2, H4, H9, H10, H18. Tuy nhiên các dòng lai
này lại có nhược điểm là sinh sản vô tính kém (trong điều kiện tự nhiên),
đặc biệt là các dòng lai H2, H4 và H18. Do vậy, những cá thể lai có đặc
điểm ưu tú được chọn lọc cần phải nhân giống vô tính nhằm duy trì được
tính trạng ban đầu.Từ nhiều năm nay, để nhân giống vô tính cây Lan huệ có
thể sử dụng các phương pháp: Tách chồi hoặc củ nhỏ từ cụm cây mẹ
(Siddique và cs., 2007); kỹ thuật cắt lát (Chipping); nhân giống bằng hạt
hoặc sử dụng phương pháp nhân giống in vitro (Husey, 1975; Seabrook và
cs., 1976; De Buruyn, 1992; Chieh Li Huang và cs., 2005). Mặc dù đơn giản
nhưng hiệu quả khi nhân giống bằng phương pháp truyền thống không cao
do thời gian nhân giống dài, hệ số nhân thấp, cây không đồng nhất cũng
như không tạo được cây sạch bệnh. Phương pháp nhân giống in vitro đã
khắc phục được những nhược điểm đó tạo được cây con sạch bệnh, thời
7
gian nhân giống ngắn, hệ số nhân giống cao, cây đồng nhất, do vậy đáp
ứng được nhu cầu về số lượng giống có chất lượng cao và tính di truyền ổn
định. Để đánh giá và duy trì nguồn vật liệu thì việc nghiên cứu nhân giống
vô tính các dòng Lan huệ trên là rất cần thiết. Ở nước ta, Nguyễn Thị
Phương Thảo và cs (2009,2010) đã bước đầu xác định được một số kết
quả nhất định để xây dựng quy trình nhân nhanh in vitro hoa Loa kèn đỏ
trắng. Hoa to khi nở đường kính tới 15 cm, đều, lưỡng tính,màu sắc sặc sỡ,
màu đỏ hoặc đỏ cam, có cuống dài 4-5 cm, gốc màu xanh hoặc xanh vàng
hoặc vàng trắng.
Bao hoa hình phễu, dài 9-12 cm, nằm ngang hoặc rủ xuống, 6 mảnh,
dạng tràng, phần dưới dính nhau thành ống, ngắn, dài 2-3,5 cm, họng có 1
vòng vảy ngắn hoặc 1 vòng tràng phụ cụp vào trong, phần trên 6 thùy, hình
trứng xếp 2 vòng, các thùy bằng nhau hoặc các thùy vòng trong hẹp hơn.
Nhị 6; chỉ nhị rời nhau, hình trụ dài 6-7 cm, đầu hơi cong đính ở họng ống
9
bao hoa, nghiêng về một phía; bao phấn hình trụ, dài 2-2,5 cm, màu trắng
ngà,2 ô, đính lưng , hướng trong, mở bằng khe dọc.
Bầu hoa, dài 1,2-1,5 cm 3 ô, đính noãn trung trụ, mỗi ô nhiều noãn; vòi
nhụy dài tới 10 cm, mảnh; đầu nhụy dạng đầu hoặc 3 thùy, màu trắng.
Hình 1.1: Hoa Lan huệ (Hippeastrum equestre)
c. Củ và rễ
Củ con: Lan huệ có các củ con (thân hành con) sinh ra từ củ mẹ, chu vi
của củ con từ 3-6 cm, số lượng củ con trung bình từ 1-3 củ/cây.
Rễ:cây thuộc bộ Lilliales nên có hệ rễ chùm gồm nhiều rễ phụ tương
đối đồng đều về kích thước.
d. Quả
Quả nang, hình cầu hoặc hình thuôn, mở ở khe lưng ô thành 3 mảnh.
Hạt nhiều, dẹp, màu đen nội nhũ nạc bao lấy phôi nhỏ.
1.1.1.2 Yêu cầu ngoại cảnh
Cây Lan huệ mọc tự nhiên ở vùng nhiệt đới Nam Mỹ, được nhập vào
Việt Nam, trồng trong vườn hoa, trong chậu. Cây ra hoa vào mùa xuân- hè,
do đó để hoa nở vào đúng dịp Tết thì các yếu tố ngoại cảnh là điều kiện vô
10
cùng quan trọng mà chúng ta cần chú ý đối với việc sinh trưởng phát triển
của cây [2].
a . Nhiệt độ
1.1.1.3 Phân bố
Cây Lan huệ có nguồn gốc từ Nam Mỹ, được trồng khắp Châu Mỹ
nhiệt đới, từ Mêhico và phía Nam Tây Ấn đến Brazil và Chile [4],[5]. Chi
Hippeastrum hiện có 70- 76 loài. Ở Việt Nam, chi Hippeastrum có 2 loài, 1 thứ
thường được trồng làm cảnh.
11
1.1.2 Giá trị kinh tế và sử dụng
Trên thế giới, nhiều loài thuộc chi Hippeastrum được trồng làm cảnh
bởi chúng có ưu điểm là hoa to, đẹp, khá đa dạng về màu sắc, có thể sử
dụng dưới dạng hoa cắt cành, trồng chậu hoặc trồng thảm. Hoa được sử
dụng trong ngày lễ, ngày tết, được trang trí trong nội thất, hoặc làm quà
tặng rất trang trọng. Hoa mang hương thơm mát dịu, màu sắc thanh nhã, làm
tăng vẻ đẹp, tăng sức sống cho mọi người [6].
Ở Việt
Nam, hoa được sử dụng trong những ngày lễ, ngày tết,
được trang trí trong hội trường, công viên, làm quà tặng rất trang trọng,
trong gia đình hoa mang hương thơm mát dịu, màu sắc thanh nhã, làm
tăng vẻ đẹp, tăng sức sống cho mọi người.
Trong Đông dược, Lan huệ là một vị thuốc quan trọng vì củ có vị ngọt
cay, tính ấm có độc, có tác động tán ứ, tiêu thũng. Thân hành của cây được
dùng giã nát đắp cầm máu và trị tổn thương khi té ngã.
Bên cạnh đó, Lan huệ (Hippeastrum equestre) là một trong những loài
hoa có tiềm năng phát triển của chi Hippeastrum do củ của nó có chứa các
biệt dược giá trị như các loại alkaloids (Funganti, 1975), các lectins có hoạt
tính chống siêu vi trùng, chống sưng viêm, chống ung thư, chữa bệnh
Alzheimer, cầm máu và chữa vết thương. Các alkaloids trong Lan huệ đang
được nghiên cứu về một số tác động dược học. Trong số các alkaloids,
lycorine (tên cũ Narcissine) là chất được chú ý nhất. Narcissine được cô lập
vào 1578, là một alkaloid rất bền. Đến 1920, narcissine được chứng minh là
sinh trưởng trung tâm) như chi Hippeastrum, Narcissus (hoa thủy tiên),
Galanthus. Các bước tiến hành [17]:
1. Chọn những củ Lan huệ bố mẹ khoẻ mạnh không bị nấm bệnh,
nhổ củ khi củ còn ở trạng thái ngủ nghỉ.
2. Dùng dao sắc nhọn sao cho khi cắt lát cắt phẳng, mịn không làm
dập nát củ. Khử trùng bề mặt củ và dao cắt.
3. Cắt bớt phần rễ và phần trên của củ, dùng dao cắt dọc chia đôi củ
từ đỉnh củ xuống phần đế củ, tiếp tục chia nhỏ các nửa hành sao cho mỗi
lát đều mang một phần đế củ. Một củ có thể chia thành 8-16 lát.
4. Các lát được ngâm trong dung dịch thuốc diệt nấm khoảng 10-15
phút lắc đều, sau đó được vớt ra để ráo nước.
13
5. Cho mỗi lát vào trong 1 túi nilon có chứa đá trân châu có thêm chất
khoáng, cho nhiều khí vào túi và buộc kín túi. Đưa vào nơi mát và tối với
nhiệt độ thích hợp 20-21
o
C, thường xuyên kiểm tra dấu hiệu thối hỏng.
6. Sau khoảng 12 tuần các hành con sẽ xuất hiện ở gốc của lát cắt.
Tách các cây con trồng vào giá thể tơi xốp và thoát nước. Cây con rất bé và
yếu ớt nên cần đặt dưới ánh sáng tán xạ một thời gian trước khi đưa ra
ngoài ánh sáng trực tiếp.
Phải mất khoảng 2-4 năm cây mới sinh trưởng phát triển thành thục
và cho hoa. Ở Việt Nam, mùa đông không có tuyết và sương giá nên cây sẽ
lớn nhanh hơn và cho hoa sớm hơn so các nước ở xứ lạnh.
Nhân nhanh bằng phương pháp cắt lát củ đã được rất nhiều nhóm tác
giả nghiên cứu cả trong điều kiện in vivo và in vitro. Epharath và cs. (2001)
đã sử dụng 7 phương pháp cắt củ [17], chia củ mẹ thành 2, 4, 8, 12, 16, 32
và 48 lát cắt, mỗi lát cắt đều mang 1 phần đế củ và giâm vào túi nilon có
chứa chất khoáng bón cho cây. Các túi này được đặt trong điều kiện nhiệt
độ 23
người Đức HaberLandt đã đề xướng ra phương pháp nuôi cấy mô tế bào
thực vật để chứng minh cho tính toàn năng của tế bào thực vật. Theo ông,
mỗi tế bào được lấy từ bất kỳ cơ quan sinh vật đa bào đều có khả năng
tiềm tàng phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Khả năng này do mỗi tế
bào đều chứa bộ gen mang thông tin di truyền của toàn bộ cơ thể, khi được
đặt vào môi trường thích hợp tế bào này sẽ có khả năng giống như một hợp
tử ban đầu.
Một đặc tính quan trọng khác, làm cơ sở cho nuôi cấy mô tế bào thực
vật là khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào. Khả năng biệt hóa là
sự biến đổi của tế bào từ tế bào phôi thành toàn bộ các tế bào chức năng
trong các cơ quan của cơ thể. Ngược lại, khi được đặt vào môi trường thích
hợp, các tế bào chuyên hóa của cơ thể có thể trở lại trạng thái của tế bào
đầu tiên sinh ra nó – tế bào phôi. Tuy nhiên, thực tế nghiên cứu đã chứng
minh, khả năng phản biệt hóa của các tế bào là khác nhau, các tế bào
chuyên hóa sâu như tế bào của hệ thống mạch dẫn thực vật, tế bào thần
kinh động vật, khả năng biệt hóa rất khó xảy ra. Đối với thực vật, khả năng
hình thành cơ quan hay cơ thể giảm dần theo chiều từ ngọn xuống gốc
(Galson, 1986; Murashige, 1974).
16
Trong tự nhiên, tất cả các loài sinh vật đều tồn tại trong mình tiềm
năng sinh sản dù là vô tính hay hữu tính, như thế các loài mới có thể duy trì
được kiểu gen của mình, chiến thắng trong quá trình tiến hóa. Nhưng ngay
từ khi ra đời, công nghệ nuôi cấy mô đã trở thành công cụ đắc lực phục vụ
mục đích nhân giống của con người.
1.2.3.2 Ý nghĩa của phương pháp nhân giống in vitro
Nuôi cấy mô tế bào thực vật, thực chất là một phương pháp nhân
giống vô tính. Đối với nhiều loại thực vật quý hiếm, có giá trị kinh tế và ý
nghĩa sinh học cao, gặp khó khăn trong vấn đề nhân giống hữu tính thì
nhân giống vô tính in vitro là công cụ vô cùng hữu ích. Nhưng trên thực tế
có nhiều loại thực vật nhân giống hữu tính bằng hạt có hệ số nhân cao
hơn nữa, việc sử dụng chính các bộ phận làm thuốc để nhân giống rất lãng
phí, tốn kém.
Để khắc phục các nhược điểm của phương pháp nhân giống vô tính
truyền thống, một phương pháp nhân giống khác đã áp dụng rộng rãi trên
thế giới cũng như ở Việt Nam, đó là phương pháp nhân giống in vitro,
phương pháp này có nhiều ưu điểm nổi trội như:
- Hệ số nhân giống cao, từ một cây trong vòng một năm có thể tạo
thành hàng triệu cây. Hệ số nhân giống ở các loại cây khác nhau nằm trong
phạm vi 3
6
đến 10
12
/ năm, cao hơn bất cứ phương thức nhân giống nào.
- Tính đồng nhất và ổn định di truyền cao: Các cây con được tạo ra
giống hệt với cây bố mẹ ban đầu. Theo lý thuyết từ bất kỳ một cây chọn lọc
ưu việt nào đều có thể tạo ra một quần thể với độ đồng đều cao, số lượng
không hạn chế.
- Nâng cao chất lượng giống do tạo được các giống sạch bệnh, loại
bỏ được các nguồn vi khuẩn, virus, nấm bệnh. Trong công tác nhân giống,
vấn đề được quan tâm hàng đầu là số lượng và chất lượng giống. Bằng
phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, người ta đã tạo được những giống
cây hoàn toàn sạch virus. Limasset và Cornel (1949) đã chứng minh được
rằng, số lượng virus được giảm dần ở các bộ phận gần đỉnh sinh trưởng,
riêng đỉnh sinh trưởng thì hoàn toàn sạch virus (Morel and Martin, 1952).
18
Phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng thường kết hợp với việc xử lý nhiệt
độ cao để tạo ra nguyên liệu giống sạch bệnh. Bằng cách này, ở khoai tây,
virus A, X và Y đã bị loại trừ còn virus M và S được giảm đi một cách đáng
kể (Kassanis, 1950; Thomson, 1956-1958; Wang and Huang, 1975).
- Nhân giống in vitro có thể nhân nhanh cây không kết hạt hoặc kết
(phôi, đỉnh chồi, chồi nách) hoặc từ những mô có khả năng hình thành điểm
sinh trưởng phụ, các dòng vô tính này sẽ được tạo ra theo các phương
thức sau:
- Tái sinh cây trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng, phôi, ngọn chồi, chồi
nách.
- Tái sinh cây gián tiếp thông qua giai đoạn hình thành mô sẹo.
Tái sinh cây trực tiếp từ mẫu nuôi cấy là quá trình phát động những
điểm tồn tại sẵn có trong mô nuôi cấy, phân chia và tái sinh thành cây. Các
cây con này được phát sinh từ các đỉnh sinh trưởng có bộ nhiễm sắc thể
2n, hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền và duy trì được các tính trạng của
cây mẹ (Hu and Xang, 1983). Tái sinh trực tiếp cũng có thể xuất phát từ
những tế bào không nằm trên đỉnh sinh trưởng, đó là các đoạn thân, mảnh
lá, cuống lá, mảnh hoa… Trong trường hợp này, các tế bào thường phân
chia nhưng không hình thành các tế bào mô sẹo mà tạo thành các điểm
sinh trưởng cao hơn ở trường hợp nói trên.
Với đường hướng tái sinh gián tiếp, mẫu nuôi cấy không tái sinh
thành cây ngay mà phát triển thành khối mô sẹo (callus). Trong môi trường
nuôi cấy thích hợp, thường là với auxin, mẫu nuôi cấy có thể đem lại sự gia
tăng thành khối tế bào không tổ chức, đó chính là các tế bào mô sẹo. Sự
tăng sinh này có thể được duy trì nhiều hay ít là không hạn định, chỉ cần mô
sẹo được cấy chuyển sang môi trường mới theo chu kỳ. Tuy nhiên, tế bào
mô sẹo khi cấy chuyển nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền. Để
tránh tình trạng này nên sử dụng các loại mô sẹo vừa mới phát sinh. Nhiều
cây tái sinh từ mô sẹo có thể rất khác với cây mẹ về mặt di truyền. Nguyên
nhân của hiện tượng này là do trong quá trình phát sinh và phát triển của
20
mô sẹo, thường xuất hiện những tế bào đột biến mang số nhiễm sắc thể
không giống với tế bào ban đầu hoặc chứa những đột biến gen do hiện
tượng nội nguyên nhân (endomitosits hay endoreduplication). Nội nguyên
nhân là hiện tượng nhân đôi nhiễm sắc thể không kèm theo sự phân bào
ngách trên bề mặt của mô cấy.
Thời gian khử trùng là một điều kiện quan trọng, nó phụ thuộc vào
từng loại dung dịch khử trùng và đặc điểm của từng loại mẫu cấy. Với
hypoclorite, người ta thường khử trùng trong thời gian 15-30 phút, HgCl
2
thường có thời gian ít hơn. Thời gian quá lâu, dung dịch khử trùng xâm
nhập vào mẫu có thể gây chết mẫu, thời gian quá ngắn sẽ không loại bỏ hết
nấm và vi khuẩn nên mẫu dễ bị nhiễm.
Sau khi khử trùng, mẫu cây được đặt vào các môi trường nuôi cấy, từ
đây giai đoạn nuôi cấy in vitro bắt đầu. Thành phần của môi trường nuôi cấy
có ảnh hưởng quyết định tới nuôi cấy.
b. Ảnh hưởng của các thành phần hóa học
Trong nuôi cấy in vitro, cả yếu tố hóa học và yếu tố vật lý của cây
trong các bình nuôi đều phải được cung cấp đầy đủ. Môi trường dinh
dưỡng phải cung cấp tất cả các ion khoáng cần thiết, nguồn chất hữu cơ bổ
sung như amino acid và vitamin, nguồn cacbon cố định, và một thành phần
cần cho sự sống cũng phải được cung cấp đó là nước. Các nhân tố vật lý
như nhiệt độ, pH, môi trường khí, ánh sáng và áp lực thẩm thấu, cũng phải
được duy trì trong giới hạn chấp nhận.
Hiện nay trên thế giới có rất nhiều môi trường được sử dụng như môi
trường Murashige và Skoog (1962), môi trường Gamborg (1968), môi
trường Knop (1974), môi trường Anderson, Went, Knudson, Lindemann…
Trong đó môi trường MS được đánh giá là phù hợp rộng rãi nhất với nhiều
loại cây trồng, bao gồm cả cây hai lá mầm và cây một lá mầm. Thông
thường trong một môi trường nuôi cấy phải đảm bảo các thành phần hóa
học sau:
Các nguyên tố khoáng
22
Tùy theo nồng độ sử dụng, các nguyên tố khoáng được chia vào hai
nhóm là nguyên tố đa lượng và nguyên tố vi lượng.
Đường vừa là nguồn cacbon cung cấp cho mẫu nuôi cấy, đồng thời
còn tham gia điều chỉnh áp suất thẩm thấu của môi trường. Đường đóng
góp khoảng 50-70 % vào khả năng thẩm thấu của môi trường (Trigiano and
Gray, 2000). Thông thường đường saccarose được sử dụng ở nồng độ 0,2-
0,3 %, nhưng nồng độ này có sự thay đổi ở từng đối tượng khác nhau và
mục đích nuôi cấy khác nhau, có khi xuống tới 0,2 % (tạo dòng), có khi tăng
lên đến 12 % (gây cảm ứng stress nước).
Sự hình thành rễ đòi hỏi một lượng đường được cung cấp từ quang
hợp hoặc ngoại sinh. Theo George (1993) hầu hết các loại thực vật khi ra rễ
thích hợp với lượng đường 20-30 g/lít. Tuy nhiên, cũng có loài yêu cầu
nguồn carbohydrate ngoại sinh cao hơn. Ví dụ: theo Sharma (1993) cây
Gentiana kurroo chỉ có thể ra rễ tốt khi bổ sung 60 g/l saccarose trong môi
trường.
Thí nghiệm áp dụng phương pháp quang tự dưỡng cho thấy các cây
in vitro đã phát triển tốt trên môi trường không có đường và vitamin, độ
thoáng khí cao. Tỷ lệ nhiễm nấm giảm đáng kể. Cây có diện tích lá lớn hơn
và sự đóng mở của lá theo quy luật tự nhiên ngay khi gặp điều kiện thay đổi
của môi trường. Trong khi đó cây nuôi cấy theo điều kiện truyền thống (có
đường và vitamin) có diện tích lá nhỏ, khí khổng luôn luôn ở trạng thái mở
trong nhiều giờ khi chuyển từ điều kiện in vitro ra vườn ươm. Tỷ lệ sống 95-
100 % sau một tháng ở vườn ươm đối với cây nuôi cấy trên môi trường
không có đường, trái lại chỉ từ 70-80 % theo phương pháp truyền thống
(Nguyễn Thị Quỳnh và cộng sự, 2005).
Chất điều tiết sinh trưởng
Chất điều tiết sinh trưởng thực vật là thành phần môi trường khắt khe
trong việc xác định con đường phát triển của tế bào thực vật. Các chất điều
tiết sinh trưởng được sử dụng thông thường là các hormome thực vật hoặc
các chất tổng hợp tương tự chúng, phổ biến là auxin và cytokinin,
24
gibberellins, abscisic acid, ethylene. Trong đó auxin và cytokinin là hai nhóm
bằng phenylureas, cũng được sử dụng như cytokinin trong môi trường nuôi
cấy tế bào thực vật.
25
Copyright: Tài liệu đại học ©